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문제 정의
- 본 연구에서 오가피를 발효시 키면 싸이토카인 및 streptozotocin 에 대한 저항성이 증가하여 혈당 강하효과가 증가됨을 관찰하였다. 전통적으로 오가피를 비롯하여 많은 천연물질이 임상에 적용되어 왔다.
- 이는 아마도 개인마다 장내 유산균의 종류 및 숫자의 차이에 의해 천연물질의 장내 대사가 다르기 때문일 것으로 추정하고 있다. 이에 본 연구에서는 이러한 장내 미생물의 역할을 근거하여 유산균으로 오가피 추출물을 발효시키고 이를 쥐에 복용시킨 후 항당뇨 효과에 미치는 영향을 관찰하였다.
제안 방법
- 차가운 PBS 를 처리함으로써 반응을 종결시켰다. 0.1% SDS 를 처리하여 세포를 깬 후 radioactivity를 liquid scintillation counter 를 사용하여 측정하였다.
- Deparaffinization 과정을 거친 후에 Protein Block Serum-Free (DAKO) 로 실온에서 10 분간 반응시켜 비특이적 반응을 제거하였다. 2 시간 동안 실온에서 인슐린에 대한 항체 (Santa Cruz Biochemicals) 반응시켜 면역염색을 실시하였다.
- 대조군은 citrate buffer만 투여하였다. 5 일째 마우스를 희생시키고, 혈액을 채취하여 1 mg/ml EDTA가 들어있는 tube에 보관하여 insulin과 glucose 농도를 측정하였다. Glucose 농도는 glucose oxidase 방법 (Sigma) 을 통해 측정하였고, insulin 농도는 radioimmunoassay kit (Linco Research)를 통해 측정하였다.
- Paraffin 으로 block 을 만든 후 4 ㎛ 두께로 잘라 section 을 만들었다. Deparaffinization 과정을 거친 후에 Protein Block Serum-Free (DAKO) 로 실온에서 10 분간 반응시켜 비특이적 반응을 제거하였다. 2 시간 동안 실온에서 인슐린에 대한 항체 (Santa Cruz Biochemicals) 반응시켜 면역염색을 실시하였다.
- ICR mice에 오가피 (5 g/kg/day)을 3 일간 복강 내로 투여하였다. 그런 다음 streptozotocin 을 50 ㎎/㎏ 농도로 5일간 복강 내로 주사하였다.
- Islets에 싸이토카인을 24시간 동안 처리한 후 3 mM D-glucose가 포함된Krebs-Ringer bicarbonate buffer (25 mM Hepes, 115 mM NaCl, 24 mM N* aHCO 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2.5 mM CaCL, 0.1% bovine serum albumin)로 3 번 washing 한 후 5.5 mM 또는 20 mM D-glucose에 30 분간 노출시킨 후 분비된 인슐린 양을 radioimmunoassay kit (Linco Research)를 이용하여 측정하였다.
- 3. Oral glucose tolerance test of diabetic mice and diabetic mice treated with Acanthopanax senticosus extract ICR mice were injected with Acanthopanax senticosus extract via i.p. in a daily dose of 5 g/kg/day, and then injected with STZ (50 ㎎/㎏) via i.p. for 5 days. After 16 h fasting, tail blood samples (5μl) were collected at 0, 30 min, 1h, 2h, and 3h after the intraperitoneal glucose challenge (1.
- ICR mice에 오가피 (5 g/kg/day)을 3 일간 복강 내로 투여하였다. 그런 다음 streptozotocin 을 50 ㎎/㎏ 농도로 5일간 복강 내로 주사하였다. 먼저 혈중 glucose 농도가 증가함에 따라 췌장 islets 으로부터 인슐린 분비 능력을 측정하기 위해 glucose tolerance test를 시행하였다.
- 다시 동일하게 1회 더 반복 추출한 다음 여액을 모아 60C 이하를 유지하면서 총량이 1 kg 이 되도록 감압농축하여 만들었다.
- 다음으로 오가피가 제 2형 당뇨병에 이용이 가능한지를 알아보기 위해 C2C12 myotubes 를 이용하여 glucose uptake 를 관찰 하였다. Fig.
- 다음으로 췌장 조직을 떼어 islets의 파괴 정도를 H&E 염색 (Fig. 5a-5d) 및 인슐린에 대한 immunohistochemistry (Fig. 5e-5h) 을 통해 관찰하였다.
- 5-6 주령의 ICR mice를 사용하였다. 당뇨병을 유발하기 위해 하루에 한번씩, 5 일간 stpreptzotocin (50 ㎎/㎏ body weight; 0.2 ml) 을 sodium citrate buffer (pH 4.0) 에 녹여 복강 내로 주사하였다. 오가피의 효과를 관찰하기 위해 마우스에게 streptozotocin 을 주사하기 전에 오가피를 3 일간 5 g/kg/day 씩 복강 내로 주사하였다.
- 처음 streptozotocin 을 처리 한 날을 day 1으로 정의 하였다. 대조군은 citrate buffer만 투여하였다. 5 일째 마우스를 희생시키고, 혈액을 채취하여 1 mg/ml EDTA가 들어있는 tube에 보관하여 insulin과 glucose 농도를 측정하였다.
- 마우스를 16 시간 동안 금식을 시키고 복강내로 glucose를 1.5 g/kg of body weight 농도로 주사한 후 꼬리의 끝을 잘라 glucometer를 이용하여 30 분, 1 시간, 2 시간, 3 시간에 혈중 fucose 농도를 측정하였다.
- 그런 다음 streptozotocin 을 50 ㎎/㎏ 농도로 5일간 복강 내로 주사하였다. 먼저 혈중 glucose 농도가 증가함에 따라 췌장 islets 으로부터 인슐린 분비 능력을 측정하기 위해 glucose tolerance test를 시행하였다. 마우스를 16 시간 굶긴 후 glucose (1.
- 0) 에 녹여 복강 내로 주사하였다. 오가피의 효과를 관찰하기 위해 마우스에게 streptozotocin 을 주사하기 전에 오가피를 3 일간 5 g/kg/day 씩 복강 내로 주사하였다. 마우스는 다음과 같이 4 군으로 나누어 실험을 했다.
- 오가피추출물 (NFE) 1 리터에 포도당 10 g 을 가해 녹인 다음 고온고압 멸균하고 실온으로 냉각하고, 유산균액 10 ml 를 가하고 30~32C를 유지하면서 30 일간 배양하여 배양액을 만들었다. 이 액을 다시 고온고압 멸균한 다음 60 C 이하를 유지하면서 진공 건조하여 건조물 약 85 g 을 얻어 이를 오가피발효물 (FE) 로사용하였다.
- 췌장 islet 을 분리한 후 3 시간 동안 500 g/ml의 오가피를 전처리한 후 싸이토카인인 IL-1 (2 ng/ml) 와 IFN- (100 U/ml) 를병합하여 24시간 동안 처리하였다. 대조군 islets의 경우 20.
대상 데이터
- 5-6 주령의 ICR mice를 사용하였다. 당뇨병을 유발하기 위해 하루에 한번씩, 5 일간 stpreptzotocin (50 ㎎/㎏ body weight; 0.
- C2C12 세포는 American Type Culture Collection (ATCC) 에서 구입하여 DMEM 배지에서 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 100 units/ml of penicillin, 100 i g/ml of streptomycin, 2.5 i g/ml of amphotericin B를 첨가한 후 CO2 incubator에서 배양하였다. IL-1 와 IFN- 는 R&D에서 구입하였고, 기타 다른 시약은 Sigma 에서 구입하였다.
- 5 i g/ml of amphotericin B를 첨가한 후 CO2 incubator에서 배양하였다. IL-1 와 IFN- 는 R&D에서 구입하였고, 기타 다른 시약은 Sigma 에서 구입하였다. Lactobacillus casei (ATCC 80382)는 한국 미생물보존센터에서 공급받았으며, MRS (Difco) 배지에 증식시킨 다음 colony 를 멸균된 식염수에 현탁하여 3000 rpm 으로 5 분간 원심 분리한 다음 침전물을 얻어 다시 멸균 식염수로 현탁하고 이를 발효용 균주액으로 사용하였다.
- IL-1 와 IFN- 는 R&D에서 구입하였고, 기타 다른 시약은 Sigma 에서 구입하였다. Lactobacillus casei (ATCC 80382)는 한국 미생물보존센터에서 공급받았으며, MRS (Difco) 배지에 증식시킨 다음 colony 를 멸균된 식염수에 현탁하여 3000 rpm 으로 5 분간 원심 분리한 다음 침전물을 얻어 다시 멸균 식염수로 현탁하고 이를 발효용 균주액으로 사용하였다.
- 오가피는 시중에서 구입하였으며, 오가피 1 kg 에 정제수 10 리터를 넣고 80~90℃ 를 유지하면서 3 시간 동안 추출하고 여과하였다. 다시 동일하게 1회 더 반복 추출한 다음 여액을 모아 60C 이하를 유지하면서 총량이 1 kg 이 되도록 감압농축하여 만들었다.
데이터처리
- 통계분석은 Student's t-test 와 ANOVA 를 이용하였고, p<0.05 를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
이론/모형
- 5 일째 마우스를 희생시키고, 혈액을 채취하여 1 mg/ml EDTA가 들어있는 tube에 보관하여 insulin과 glucose 농도를 측정하였다. Glucose 농도는 glucose oxidase 방법 (Sigma) 을 통해 측정하였고, insulin 농도는 radioimmunoassay kit (Linco Research)를 통해 측정하였다. 동물 실험에 관한 모든 사항은 전북대학교 실험동물위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee at Chonbuk National University) 의 승인을 얻은 후 시행하였다.
- In vitro 실험을 통해 확인한 오가피의 항당뇨 효과를 in vivo 실험에서 확인하고자 streptozotocin 유발 당뇨쥐 모델을 사용하였다. ICR mice에 오가피 (5 g/kg/day)을 3 일간 복강 내로 투여하였다.
- 면역염색을 위해, DAKO Envision system (DAKO)을 이용하였, 다. 췌장을 떼어서 즉시 고정액 (10% formalin solution in 0.
- 췌장 isletse 수컷 Sprague-Dawley rats로부터 collagenase digestion 방법에 의해 분리하였다46). * 분리한 후 isletse 2 mM L-glutamine, 10% heat-inactivated fetal calf serum, 100 units/ml penicillin, 100 1 g/ ml streptomycin 이 첨가 된 RPMI-1640 medium 에서 하루 동안 안정화 시킨 후 실험에 사용하였다.
성능/효과
- 비록 본 연구에서 세포 수준에서 오가피가 싸이토카인에 의한 NF- B 활성을 억제함을 보여주지는 못했지만, 오가피 특히 발효된 오가피를 전처리 하면 islets 의 인슐린 분비능이 거의 정상 islets 과 비슷한 정도로 회복함을 관찰할 수 있었다. 또한 multiple low-dose streptozotocin 을 투여하는 제 1형 당뇨병 동물 모델을 만들었을 때 형태학적으로 췌장 islets 에서 인간의 제 1형 당뇨병과 비슷한 immune cell infiltration, β-cell degeneration, 인슐린에 대한 immunoreactivitiy 등의 소견이 나타났지만, 오가피를 전처리 했을 때 이런 소견이 사라지고, 기능적으로 혈중 glucose 및 인슐린 농도가 정상군과 비슷한 농도로 회복됨을 관찰할 수 있었다. 따라서 오가피는 제 1형 당뇨병의 진행 예방 및 islets transplantation 후 생존율을 높이는데 좋은 보조제로 사용이 가능함을 의미해 주고 있다.
- 또한 오가피를 처리한 마우스에 있어 공복시 혈중 glucose 농도와 인슐린 농도는 streptozotocin 유발 당뇨쥐와 비교했을 때 glucose 농도는 더 낮고, 인슐린 농도는 더 높았다 (Fig. 4). 마찬가지로 발효 오가피를 사용한 경우 혈중 혈중 fucose 농도 및 인슐린 농도는 더욱더 정상쥐에 가까운 수치를 보였다.
- 01). 발효된 오가피 (FE) 를 처리한 경우 발효되지 않은 오가피 (NFE) 에 비해 인슐린 분비능 유지가 뚜렷하게 증가함을 관찰하였다 (Fig. 1).
- 싸이토카인에 의한 islets 의 손상기전은 NF- B 활성과 밀접한 관계가 있다. 비록 본 연구에서 세포 수준에서 오가피가 싸이토카인에 의한 NF- B 활성을 억제함을 보여주지는 못했지만, 오가피 특히 발효된 오가피를 전처리 하면 islets 의 인슐린 분비능이 거의 정상 islets 과 비슷한 정도로 회복함을 관찰할 수 있었다. 또한 multiple low-dose streptozotocin 을 투여하는 제 1형 당뇨병 동물 모델을 만들었을 때 형태학적으로 췌장 islets 에서 인간의 제 1형 당뇨병과 비슷한 immune cell infiltration, β-cell degeneration, 인슐린에 대한 immunoreactivitiy 등의 소견이 나타났지만, 오가피를 전처리 했을 때 이런 소견이 사라지고, 기능적으로 혈중 glucose 및 인슐린 농도가 정상군과 비슷한 농도로 회복됨을 관찰할 수 있었다.
- 오가피를 미리 먹인 쥐의 경우 혈중 glucose 농도의 증가가 유의하게 감소하였으며, 발효 시킨 오가피 (FE) 의 경우 그렇지 않은 오가피 (NFE) 에 비해 혈중 glucose 농도 증가가 더 유의하게 감소하였다. 또한 오가피를 처리한 마우스에 있어 공복시 혈중 glucose 농도와 인슐린 농도는 streptozotocin 유발 당뇨쥐와 비교했을 때 glucose 농도는 더 낮고, 인슐린 농도는 더 높았다 (Fig.
후속연구
- 본 실험에서는 C2C12 myotubes 를 사용하여 glucose uptake 를 관찰하는 in vitro 실험만을 수행하였기 때문에 제 2형 당뇨병 동물 모델에서 오가피의 항당뇨 효과를 보일 수 있는 가능성을 배제할 수 없다. Liu 등의 보고와 다른 결과를 보인 까닭은 아마도 본 연구에 사용한 오가피의 종류, 재배지역의 차이 및 추출 방법의차이 등에 기인할 것으로 추측한다.
- 예를 들면 직접 인슐린 신호 전달 체계를 증가시킬 수도 있고, 인슐린에 영향을 받는 지방세포나 근육세포의 분화 및 성장에 영향을 미쳐 인슐린의 효과를 배가시킬 수도 있다27). 본 실험에서는 C2C12 myotubes 를 사용하여 glucose uptake 를 관찰하는 in vitro 실험만을 수행하였기 때문에 제 2형 당뇨병 동물 모델에서 오가피의 항당뇨 효과를 보일 수 있는 가능성을 배제할 수 없다. Liu 등의 보고와 다른 결과를 보인 까닭은 아마도 본 연구에 사용한 오가피의 종류, 재배지역의 차이 및 추출 방법의차이 등에 기인할 것으로 추측한다.
- 천연물질은 오랫동안 경험을 통해 그 안정성 및 효능이 이 입증되었고, 특정한 유산균을 통한 천연물질의 선택적인 활성화는 그 천연물질의 효능을 배가시킬 뿐만 아니라 복용량의 감소로 인해 예상되는 부작용을 최소화 할 수 있는 장점이 있다. 이에 본 연구는 발효 과정을 통한 천연물 질의효능 증가에 대한 좋은 예가 될 수 있을 뿐만 아니라 제 1형 당뇨병의 예방 및 치료에 오가피를 사용할 수 있는 이론적 토대를 제공할 것으로 생각한다.
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