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문제 정의
- 본 연구에서는 streptozotocin(STZ) 으로 유발된 당뇨 흰쥐에 송이버섯 균사체와 동충하초 균사체를 혼합 배양한 한방 복합배지를 유산균과 효모를 이용하여 발효한 추출물을 경구 투여하여 혈당에 미치는 영향을 관찰한 바 다음과 같은 결과를 얻었다. 각각의 추출물에 대한 -이ucosidase 의 저해활성을 10
- 한편 번데기 동중하초 (Cordyceps militaris)는 주로 나비목(Lepidoptera) 의 유충 또는 번데기를 기주로 하여 주황색의 곤봉형 자좌를 형성하는 곤충기생균(Entommopathogenic fungi)의 일종으로 에너지원인 탄수화물이나 당의 비율은 낮지만 비타민 A 나 미네랄 등을 다른 종에 비해 풍부하게 함유하고 있어 건강 기능성 식품으로도 인지도가 높아지고 있다10). 이에 본 연구에서는 streptozotocin(STZ) 으로 유발된 당뇨 흰쥐에 송이버섯과 동충하초 균사체를 혼합 배양한 한방복합배지를 유산균과 효모를 이용하여 발효한 추출물을 경구 투여하여 혈당에 미치는 영향을 살펴보고자 하였다.
제안 방법
- 실험군의 분류는 정상 대조군(이하 NC 군)과 당뇨유발군으로 분류하였으며 당뇨 유발 군은 다시 당뇨대조군(이하 DC군)과 양성대조군(이하 PC군), UMPM 비발효 추출물 투여군(이하 UM군), UMPM 비발효 추출물의 조다당체 투여군(이하 UME 군), UMPM 발효 추출물 투여군 (이하 UF군), UMPM 발효 추출물의 조다당체 투여군(이하 UFE 군) 총 7군으로 나누었다. NC 군과 DC 군은 0.9% 식염수를, PC 군은 acarbose(50 ㎎/㎏ body weight), 각 추출물은 식염수에 300 ㎎/㎏ body weight 농도로 희석하여 1일 1회 일정시간에 경구투여하였으며 고형사료와 물은 자유롭게 섭취하도록 하였다.
- 2 배의 증류수를 넣고 송이버섯 균사체와 동충하초 균사체 현탁액을 5% 접종하여 24 ℃ 에서 7일간 통기성암배양 하였다. 균사체가 배양된 OCM 배지를 95℃에서 30분간 살균하여 유산균과 효모를 각각 0.5%씩 접종하여 24℃에서 36~48시간 발효(최종 pH 4.0) 시킨 후 UMPM 추출기 (ultra sonic waves, micro wave, Micro bubble, MEDIPS, umex, Korea)를 이용하여 60C 에서 4시간 추출한 후 추출물을 얻었다. 또한 추출물에 4배의 ethan이을 가하여 4C 에서 24시간 침전시킨 후 증류수를 이용하여 세척한 후 다시 4C 에서 12시간 방치 후 조다당체를 얻었다.
- 정상군은 동일한 스트레스를 주기 위해 동량의 citrate buffer 용액을 주사하였다. 당뇨병의 유발확인은 24시간 후 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 비공복시 혈당농도가 300 mg/dl 이상인 것을 당뇨가 유발된 것으로 간주하여 실험에 사용하였다. 실험군의 분류는 정상 대조군(이하 NC 군)과 당뇨유발군으로 분류하였으며 당뇨 유발 군은 다시 당뇨대조군(이하 DC군)과 양성대조군(이하 PC군), UMPM 비발효 추출물 투여군(이하 UM군), UMPM 비발효 추출물의 조다당체 투여군(이하 UME 군), UMPM 발효 추출물 투여군 (이하 UF군), UMPM 발효 추출물의 조다당체 투여군(이하 UFE 군) 총 7군으로 나누었다.
- 후 각 군으로 분류하였다. 당뇨유발은 실험동물을 16시간 절식시킨 후 췌장의 -세포에만 특이적으로 작용하여 다른 기관에 영향을 미치지 않는다고 알려진 streptozotocin(STZ, Sigma. Co, U.S.A)을 0.01M citrate buffer(pH 4.5)에 50 ㎎/㎏ body weight 농도로 녹여 복강에 투여하여 유도하였다. 정상군은 동일한 스트레스를 주기 위해 동량의 citrate buffer 용액을 주사하였다.
- 비공복시 혈당측정은 일주일 간격으로 일정시간에 꼬리 정맥에서 채혈하여 혈당측정기 (Accuchek Active. Roche Diagnostics Cmb, Germany) 를 이용하여 측정하였다.
- 당뇨병의 유발확인은 24시간 후 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 비공복시 혈당농도가 300 mg/dl 이상인 것을 당뇨가 유발된 것으로 간주하여 실험에 사용하였다. 실험군의 분류는 정상 대조군(이하 NC 군)과 당뇨유발군으로 분류하였으며 당뇨 유발 군은 다시 당뇨대조군(이하 DC군)과 양성대조군(이하 PC군), UMPM 비발효 추출물 투여군(이하 UM군), UMPM 비발효 추출물의 조다당체 투여군(이하 UME 군), UMPM 발효 추출물 투여군 (이하 UF군), UMPM 발효 추출물의 조다당체 투여군(이하 UFE 군) 총 7군으로 나누었다. NC 군과 DC 군은 0.
- 실험기간 동안의 식이섭취량은 매일, 체중은 3일 간격으로 일정 시간에 측정하였으며 식이효율 (food efficiency ratio, FER) 은 전체 중 증가량을 같은 기간 동안의 식이섭취량으로부터 계산하였다.
- 5)에 50 ㎎/㎏ body weight 농도로 녹여 복강에 투여하여 유도하였다. 정상군은 동일한 스트레스를 주기 위해 동량의 citrate buffer 용액을 주사하였다. 당뇨병의 유발확인은 24시간 후 꼬리정맥에서 혈액을 채취하여 비공복시 혈당농도가 300 mg/dl 이상인 것을 당뇨가 유발된 것으로 간주하여 실험에 사용하였다.
- 채취한 혈액은 2시간 방치한 후 3000 rpm 에서 20분간 원심 분리하여 혈청을 분리하여 분석시료로 사용하였다. 채혈 후 즉시 간, 신장, 고환을 분리 적출하여 생리식염수로 세척한 후 거즈로 수분을 제거하였고 각각의 무게를 측정하였으며 체중 100 g 당 장기 무게로 환산하였다.
- 1 M 임ycine-NaOH를 가하여 반응을 정지시킨 후 405 m에서 흡광도를 측정하여 저해율을 계산하였다. 추출물에 대한 양성 대조군으로 acarbose를 사용하였다.
- 혈청 중의 ALT와 AST, ALP, total cholesterol, triglyceride, creatinine, BUN, uric acid의 농도는 각각의 측정용 kit(Bayer, USA) 를 이용하여 자동분석기 (Advia 1650, Tokyo, Japan) 로 측정하였다.
대상 데이터
- 또한 발효에 사용한 유산균(Lactobacillus plantarum 3108)과 효모(Saccharomyces cerevisiae 7268)는 한국생명공학연구원에서 분양받아 실험에 사용하였다. 한방복합배지(Oriental medicine & cereal medium, 이하 OCM) 추출물 제조는 Fig.
- 본 연구에 사용한 한약재와 곡물 (Table 1)은 금강제약에서 구입하여 원광대학교 한방병원에서 검증 후 사용하였으며, 송이버섯 균사체(Trichloloma matsutake mycelium)는 국립산림과학원에서, 번데기 동충하초균사체(Cordyceps militaris mycelium)는 전북농업기술원에서 분양받아 계대배양 후 사용하였다. 또한 발효에 사용한 유산균(Lactobacillus plantarum 3108)과 효모(Saccharomyces cerevisiae 7268)는 한국생명공학연구원에서 분양받아 실험에 사용하였다.
- 실험동물은 6주령의 Sprague Dawley 계(我의 흰쥐를 (주)샘 타코에서 분양받아 실험실 환경(온도 22 ±2℃, 습도 50 ± 5%, 암주기 12시간)에서 한 마리씩 stainless cage에 넣어 일주일간 적응시킨 후 각 군으로 분류하였다. 당뇨유발은 실험동물을 16시간 절식시킨 후 췌장의 -세포에만 특이적으로 작용하여 다른 기관에 영향을 미치지 않는다고 알려진 streptozotocin(STZ, Sigma.
데이터처리
- All values are mean±S.D.Different superscripts in the table indicate significant difference by Duncan's multiple range test. NC: normal control group, DC: diabetes contr이 group, PC: positive control group(treated by acabose)UM: non-fermented OCM extracts group, UME: crude polysaccharide of non-fermented extracts group, UF: fermented OCM extracts group, UFE: crude polysaccharide of fermented OCM extracts group.
- All values are mean±S.D.Different superscripts in the table indicate significant difference by Duncan's multiple range test. NC: normal control group, DC: diabetes contr이 group, PC: positive control group(treated by acabose)UM: non-fermented OCM extracts group, UME: crude polysaccharide of non-fermented extracts group, UF: fermented OCM extracts group, UFE: crude polysaccharide of fermented OCM extracts group.
- extraction condition. Different superscripts in the table indicate significant difference by Duncan's multiple range test.
- 모든 자료의 통계분석은 SPSS program 을 이용하여 one-way ANOVA로 검정하여 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 유의성 검정은 Duncan's multiple range test 에 따라 p<0.05 수준에서 검정하였다.
성능/효과
- 2주간의 체중 증가량은 NC군에서는 2.75 g/day로 체중이 증가한 반면, DC군 1.6 g/day, PC군 0.17 g/day, UM군 0.24 g/day, UME 0.75 g/day, UF 1.79 g/day, UFE 0.64 g/day 으로 체중이 감소되었다. 식이섭취량은 NC군이 15.
- 그러나 UFE군을 제외한 UM군, UME군 UF군에서는 DC군에 비해 약간의 감소함을 보였다. ALP 활성도는 DC군에서 가장 높게 나타났으며 ALT활성도와 마찬가지로 UFE 군을 제외한 나머지 실험군에서 DC 군에 비해 유의적으로 낮게 나타났다. 본 실험에서는 정상 시보다는 당뇨일 때 추출물의 투여가 AST활성도를 낮추는 경향을 보였으며 ALT, ALP 활성도 역시 UFE군을 제외한 나머지 실험군에서 감소하였으며 이는 STZ 로 인한 간 손상이 어느 정도까지 회복시킨 것으로 사료된다.
- DC군의 creatinine 의 함량은 NC 군과 비교하여 증가하는 경향은 보였으나 통계적 유의성은 없었다. 이는 당뇨가 유발된 흰쥐의 혈청 중 creatinine 의 함량이 증가한다고 보고한 Yun 등20)과 Kwack 등21) 의 결과와는 다르게 나타났다.
- g/ml 의 농도 측정한 결과 UFE 에서 acarbose 와 가장 유사한 활성을 보였으며, UF> UM> UME 순으로 나타났다. 실험기간 동안 당뇨 유발 쥐들의 체중 증가량, 식이섭취량, 식이효율은 NC 군에서는 높게 나타난 반면 STZ 로 유발된 실험군에서 감소되었으나간, 신장 및 고환의 무게는 NC 군에 비해 STZ 로 유발된 실험군이 유의적으로 높게 나타났다.
- 30 g/day에 비해 모든 군이 높게 나타났다. 그 결과 식이효율은 NC군에서는 19.69%로 나타난 반면 DC 군 -7.55%, PC 군 -1.33%, UM 군 -1.10%, UME 군 -3.68%, UF 군 -7.89%, UFE 군 -2.63%로 NC 군을 제외한 모든 군에서 감소되었다. 이는 STZ처리가 실험동물에서 췌장의 -cell을 선택적으로 파괴하여 insulin 생성의 이상을 초래하여 당 대사의 불균형을 일으켜 체지방조직과 체단백의 파괴로 체중이 감소하게 되고11), 다식증의 현상12)이 나타난 것이라 할 수 있다.
- 본 실험에서 AST 활성도가 NC 군에 비해 실험군 모두에서 감소하였으나 유의적인 차이는 보이지 않아 이는 Choi 등19)은 당뇨 쥐에 nicotinamide를 투여한 실험군의 혈장 AST 및 ALT 활성도가 유의적인 차이를 보이지 않았음은 당뇨에 의한 간의 합병증이 이어나지 않았기 때문이라고 보고한 것과 일치한 결과라 볼 수 있다. 또한 ALT 활성도에서는 NC 군에 비해 모든 실험군에서 다소 증가하였으며 특히 PC 군에서 유의적으로 높아지는 결과를 보였다. 그러나 UFE군을 제외한 UM군, UME군 UF군에서는 DC군에 비해 약간의 감소함을 보였다.
- 시료 투여군의 경우 DC 군에 비해 creatinine 의 함량이 감소하였으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 또한 혈청 중 BUN 함량은 DC군의 경우 매우 높은 수준이었으며 실험군의 경우 NC 군과 비교했을 때 유의적인 수준으로 나타났으며, DC군에 비해 유의적 감소를 보였다. Uric acid 의 경우 DC 군에 비해 acarbose 를 투여한 PC 군에서 유의적으로 높게 나타났으며 각 추출물의 에탄올 침전 조다당체인 UME 군과 UFE 군에서도 유사하게 나타나 이는 추후 좀 더 세밀한 분석을 필요할 것으로 보여 진다.
- 33 mg/dl 수준으로 약물의 효과로 인해 마지막까지 변화 없이 유지되었다. 마지막 14일 째의 혈당은 NC, DC, PC, UM, UME, UF, UFE 군의 순으로 133.20 mg/dl, 563.00 mg/dl, 344.33 mg/dl, 391.80 mg/dl, 444.16 mg/dl, 370.20 mg/dl, 333.33 mg/dl 로 4가지 시료 투여군이 DC군보다 유의적으로 낮은 혈당수준으로 나타났으며, 특히 과 UF 군과 UFE 군의 경우 지속적으로 혈당이 저하되는 PC 군의 혈당과 유사한 경향으로 나타났다.
- ALP 활성도는 DC군에서 가장 높게 나타났으며 ALT활성도와 마찬가지로 UFE 군을 제외한 나머지 실험군에서 DC 군에 비해 유의적으로 낮게 나타났다. 본 실험에서는 정상 시보다는 당뇨일 때 추출물의 투여가 AST활성도를 낮추는 경향을 보였으며 ALT, ALP 활성도 역시 UFE군을 제외한 나머지 실험군에서 감소하였으며 이는 STZ 로 인한 간 손상이 어느 정도까지 회복시킨 것으로 사료된다.
- 실험기간 동안 당뇨 유발 쥐들의 체중 증가량, 식이섭취량, 식이효율은 NC 군에서는 높게 나타난 반면 STZ 로 유발된 실험군에서 감소되었으나간, 신장 및 고환의 무게는 NC 군에 비해 STZ 로 유발된 실험군이 유의적으로 높게 나타났다. 시료 추출물 투여에 따른 혈당 농도를 측정한 결과는 NC 군은 정상 혈당을 유지하였으며 DC 군역 시 STZ 유발 후 고혈당을 유지하였다. Acarbose 를 투여한 PC 군은 당뇨 유발 시킨 후 1일째의 혈당이 336.
- 이는 당뇨가 유발된 흰쥐의 혈청 중 creatinine 의 함량이 증가한다고 보고한 Yun 등20)과 Kwack 등21) 의 결과와는 다르게 나타났다. 시료 투여군의 경우 DC 군에 비해 creatinine 의 함량이 감소하였으나 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 또한 혈청 중 BUN 함량은 DC군의 경우 매우 높은 수준이었으며 실험군의 경우 NC 군과 비교했을 때 유의적인 수준으로 나타났으며, DC군에 비해 유의적 감소를 보였다.
- 혈청 중 간 기능 지표로 사용되는 ALT, AST, ALP는 정상 보다는 당뇨일 때 추출물의 투여가 AST 활성도를 낮추는 경향을 보였으며 ALT, ALP 활성도 역시 UFE 군을 제외한 나머지 실험군에서 감소하였으며 이는 STZ 로 인한 간 손상이 어느 정도까지 회복시킨 것으로 사료된다. 신기능 지표로 사용되는 creatinine, BUN, uric acid 로 creatinine 의 함량은 NC 군과 비교하여 증가하는 경향은 보였으나 통계적 유의성은 없었다. BUN 함량은 실험군들의 경우 NC 군과 비교했을 때 유의적인 수준으로 나타났으며 Uric acid는 DC군에 비해 acarbose를 투여한 PC군에서 유의적으로 높게 나타났으며 UME 군과 UFE 군에서도 유사하게 나타나 이는 추후 좀 더 세밀한 분석이 필요할 것으로 사료된다.
- 66 mg/dl 수준이었으며 약물의 효과로 인해 마지막까지 큰 변화 없이 유지되었다. 실험 종료 시 4가지 시료 투여군은 DC 군보다 유의적으로 낮은 혈당 수준으로 나타났으며, 특히 UF 군과 UFE 군의 경우 지속적으로 혈당이 저하되는 PC 군의 혈당과 유사한 경향으로 나타났다. 혈청 중 간 기능 지표로 사용되는 ALT, AST, ALP는 정상 보다는 당뇨일 때 추출물의 투여가 AST 활성도를 낮추는 경향을 보였으며 ALT, ALP 활성도 역시 UFE 군을 제외한 나머지 실험군에서 감소하였으며 이는 STZ 로 인한 간 손상이 어느 정도까지 회복시킨 것으로 사료된다.
- 보였으며, UF> UM> UME 순으로 나타났다. 실험기간 동안 당뇨 유발 쥐들의 체중 증가량, 식이섭취량, 식이효율은 NC 군에서는 높게 나타난 반면 STZ 로 유발된 실험군에서 감소되었으나간, 신장 및 고환의 무게는 NC 군에 비해 STZ 로 유발된 실험군이 유의적으로 높게 나타났다. 시료 추출물 투여에 따른 혈당 농도를 측정한 결과는 NC 군은 정상 혈당을 유지하였으며 DC 군역 시 STZ 유발 후 고혈당을 유지하였다.
- 2와 같다. 양성대조군으로 사용한 acarbose 의 경우 77.28%의 높은 저해 활성을 보였으며 UFE의 경우 77.10%로 acarbose 와 비교했을 때 가장 유사한 활성을 보였으며, UF 72.71%, UM 69.93%, UME 67.96%를 보였다.
- 실험 종료 시 4가지 시료 투여군은 DC 군보다 유의적으로 낮은 혈당 수준으로 나타났으며, 특히 UF 군과 UFE 군의 경우 지속적으로 혈당이 저하되는 PC 군의 혈당과 유사한 경향으로 나타났다. 혈청 중 간 기능 지표로 사용되는 ALT, AST, ALP는 정상 보다는 당뇨일 때 추출물의 투여가 AST 활성도를 낮추는 경향을 보였으며 ALT, ALP 활성도 역시 UFE 군을 제외한 나머지 실험군에서 감소하였으며 이는 STZ 로 인한 간 손상이 어느 정도까지 회복시킨 것으로 사료된다. 신기능 지표로 사용되는 creatinine, BUN, uric acid 로 creatinine 의 함량은 NC 군과 비교하여 증가하는 경향은 보였으나 통계적 유의성은 없었다.
후속연구
- 신기능 지표로 사용되는 creatinine, BUN, uric acid 로 creatinine 의 함량은 NC 군과 비교하여 증가하는 경향은 보였으나 통계적 유의성은 없었다. BUN 함량은 실험군들의 경우 NC 군과 비교했을 때 유의적인 수준으로 나타났으며 Uric acid는 DC군에 비해 acarbose를 투여한 PC군에서 유의적으로 높게 나타났으며 UME 군과 UFE 군에서도 유사하게 나타나 이는 추후 좀 더 세밀한 분석이 필요할 것으로 사료된다.
- 또한 혈청 중 BUN 함량은 DC군의 경우 매우 높은 수준이었으며 실험군의 경우 NC 군과 비교했을 때 유의적인 수준으로 나타났으며, DC군에 비해 유의적 감소를 보였다. Uric acid 의 경우 DC 군에 비해 acarbose 를 투여한 PC 군에서 유의적으로 높게 나타났으며 각 추출물의 에탄올 침전 조다당체인 UME 군과 UFE 군에서도 유사하게 나타나 이는 추후 좀 더 세밀한 분석을 필요할 것으로 보여 진다. 또한 UM 군과 UF 군의 경우 NC 군과 유사한 수준으로 나타났다.
- Uric acid는 purine 의 정상적인 대사산물로 신기능이 감소하면 혈청 요산 수준이 높아진다끄. 본 실험의 결과로 볼 때 NC 군과 비교했을 때 acarbose 를 투여한 PC 군과 발효추출물을 투여한 UF 군과 UFE 군에서 유사한 수준으로 나타나 발효추출물의 투여가 당대사 장애를 회복시켜 단백 이화작용을 감소시키고, 당뇨합병증이 acidosis 를 완화시킬 수 있을 것으로 보여 지며 이는 좀 더 심도 있는 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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