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문제 정의
- 하지만 적합한 실험모델에서 그 효과 및 작용기전은 분명하게 규명되지 않았다. 본 연구에서는 대식세포와 splenocyte 를 이용하여 세포 독성에 영향을 주지 않는 농도에서 천초의 면역 조절 효과를 검토했다.
- 방어하는 리셉터로 알려져 있다. 본 연구에서는 천 초 추출물이 세포 표면 마커인 CD86과 CD14, TLR4 발현에 영향을 미치는지 알아보았다. C57BL/6 마우스로부터 대식세포를 분리하여 1x106 세포에 100 ㎍/㎖ 천초 추출물과 TLR4의 리간드로 알려진 LPS 을 24시간 처리한 뒤 flow cytometry 를 이용하여 발현 정도를 측정하였다.
제안 방법
- Splenocyte 를 세척하여 RPMI-1640으로 부유한 후 cell수를 측정하였다. C57BL/6 마우스 복강에 3% thioglycollate 를 주입하고, 4일 뒤 경추 탈골하여 도살시킨 다음, 복강에 PBS 를넣어 peritoneal macrophage를 분리하였다. 분리된 macrophage 는 세척하여 RPMI-1640으로 부유한 후cell 수를 측정하였다.
- 본 연구에서는 천 초 추출물이 세포 표면 마커인 CD86과 CD14, TLR4 발현에 영향을 미치는지 알아보았다. C57BL/6 마우스로부터 대식세포를 분리하여 1x106 세포에 100 ㎍/㎖ 천초 추출물과 TLR4의 리간드로 알려진 LPS 을 24시간 처리한 뒤 flow cytometry 를 이용하여 발현 정도를 측정하였다. 세포표면 마커인 CD86 그리고 LPS와 LBP 복합체의 공동 수용체인 TLR4와 CD14 의 발현이 천초를 처리하지 않은 군에 비해 증가하는 것을 관찰하였고 또한 그 양상은 LPS 와 유사하였다 (Fig.
- C57BL/6 마우스로부터 분리한 splenocyte에 천초 추출물 또는 Con A를 처리하고 24시간 후에 상충액에서 TNF- 와 IFN- 생성을 측정하였다. IFN- 생성은 천초 추출물 50, 100 ㎍/㎖ 에서 Con A 보다 많이 증가하였고, TNF- 생성은 천초 추출물 50, 100 ㎍/㎖에서 controle 비해 10-12배 정도 증가하는 것을 확인하였다(Fig.
- 하였다. Monoclonal antibody, isotype-matched contr이로 ice에서 30분간 staining을 하였다. Staining된 세포는 FITC anti-mouse CD 86, PE anti-mouse TLR4, PE-anti-mouse CD14 로 staining 을 한 후 FACS Cabilibur (Becton-Dickinson)으로 분석을 하였다.
- 7 세포에서 NO 와 염증 매개 물질(inflammatory mediator)인 TNF- 생성을 측정하였다. Raw 264.7 세포에 천초 추출물 50, 100, 500 ㎍/㎖과 positive contr이로서 LPS 1 ㎍/㎖을 24시간 처리한 후 Griess 방법과 ELISA 방법으로 NO와 TNF- 의 생성을 각각 측정한 결과 LPS 처리군과 비슷한 양상으로 증가하는 것을 관찰하였다 (Fig. 1A, B). 천초 500 ㎍/㎖에서 가장 많이 분비되는 것을 관찰 하였다.
- 1200rpm 에서 10분간 원심분리 한 후 증류수를 이용하여 적혈구를 파괴하였다. Splenocyte 를 세척하여 RPMI-1640으로 부유한 후 cell수를 측정하였다. C57BL/6 마우스 복강에 3% thioglycollate 를 주입하고, 4일 뒤 경추 탈골하여 도살시킨 다음, 복강에 PBS 를넣어 peritoneal macrophage를 분리하였다.
- Monoclonal antibody, isotype-matched contr이로 ice에서 30분간 staining을 하였다. Staining된 세포는 FITC anti-mouse CD 86, PE anti-mouse TLR4, PE-anti-mouse CD14 로 staining 을 한 후 FACS Cabilibur (Becton-Dickinson)으로 분석을 하였다.
- peritoneal macrophage와 splenocytes를 96 웰 마이크로 플레이트에 웰 당 4x105 cells 씩 분주한 후 50 ㎍/㎖ 또는 100 ㎍/㎖의 천초 추출물을 37C, 5% CO2 조건에서 24시간 처리하였다. LPS는 대조군으로 1 ㎍/㎖을 처리하였다.
- 대식 세포를 이용하여 inflammatory mediator의 생산, CD86, TLR4와 CD14 발현을 관찰하고 splenocyte 를 이용하여 세포 증식과 Th1 cytokine 생성에 관한 연구를 통하여 천초의 면역조절 효과를 조사하였다.
- 천초 추출물은 NO, TNF- 생성과 CD86 그리고 TLR4, CD14의 발현을 증가시켰다. 또한 splenocyte의 증식과 Th1 사이토카인인 IFN- , TNF- 생성을 증가시켰다. 지금까지 현존하는 모든 생물체들은 자기와 생물학적으로 구별되는 비자기 감염원과의 끊임없는 상호작용을 통하여 자신을 감염원으로부터 방어할 수 있는 면역체계를 발전시켜왔다.
- 본 연구에서는 선천 면역과 후천 면역에 관여하는 인자를 중심으로 천초 추출물의 면역 조절 효과를 대식세포와 splenocyte를 이용하여 확인하였다. 천초 추출물은 NO, TNF- 생성과 CD86 그리고 TLR4, CD14의 발현을 증가시켰다.
- C57BL/6 마우스 복강에 3% thioglycollate 를 주입하고, 4일 뒤 경추 탈골하여 도살시킨 다음, 복강에 PBS 를넣어 peritoneal macrophage를 분리하였다. 분리된 macrophage 는 세척하여 RPMI-1640으로 부유한 후cell 수를 측정하였다.
- 분주한다. 천초 추출물 50 ㎍/㎖을 24시간 동안 Con A 없이 혹은 Con A를 넣은 다음 mouse splenocyte의 증식을 MTS assay 를 통해 조사해 보았다
- 이용하여 확인하였다. 천초 추출물은 NO, TNF- 생성과 CD86 그리고 TLR4, CD14의 발현을 증가시켰다. 또한 splenocyte의 증식과 Th1 사이토카인인 IFN- , TNF- 생성을 증가시켰다.
- 천초 추출물의 면역 조절 효과를 알아보기 위해 Raw 264.7 세포에서 NO 와 염증 매개 물질(inflammatory mediator)인 TNF- 생성을 측정하였다. Raw 264.
- 천초 추출물이 세포 증식에 영향을 주는지 알아보기 위해, 마우스로부터 분리한 splenocytes(1x106 cells/well)에 천초 100 ug/ml 을 24시간 동안 천초 단독 또는 Con A 와 함께 처리하였을 때 mouse splenocyte 의 증식을 MTS assay 를 통해 조사해 보았다. 천초 Con A 와 함께 처리하였을 때뿐만 아니라 추출물 단독처리했을 때에도 모두 세포증식을 증가시킴을 확인하였다 (Fig.
- 받아 실험에 이용하였다. 천초을 자연 건조시킨 후 잘게 세절하여, 건조된 천초 1 kg 에 증류수 2 L 를 가하여 70℃ 에서 가열추출을 3회 행한 후, 여과하고 가압 농축하여 동결건조 한 후 천 초 추출물 3 g 을 수득하였다.
대상 데이터
- 이에 저자들은 천초 추출물을 가지고 선천 면역과 후천 면역에 관계되는 여러가지 인자를 연구의 대상으로 하여 실험하였다. 대식 세포를 이용하여 inflammatory mediator의 생산, CD86, TLR4와 CD14 발현을 관찰하고 splenocyte 를 이용하여 세포 증식과 Th1 cytokine 생성에 관한 연구를 통하여 천초의 면역조절 효과를 조사하였다.
- 한국식물추출물은 행으로부터 전통적인 생약추출 방법인 약탕기를 사용하여 추출한 후 여과하여 건조 시킨 생약시료를 분양 받아 실험에 이용하였다. 천초을 자연 건조시킨 후 잘게 세절하여, 건조된 천초 1 kg 에 증류수 2 L 를 가하여 70℃ 에서 가열추출을 3회 행한 후, 여과하고 가압 농축하여 동결건조 한 후 천 초 추출물 3 g 을 수득하였다.
이론/모형
- Culture supernatant was collected from none and Con A (1㎍/㎖ ) or ZP (100 ㎍/㎖) treated splenocytes, which are culture 24h. IFN- and TNF- level in culture supernatant was measured using ELISA.
- Isolated splenocytes (1X106/ml) from C57BL/6N mice were cultured with ZP at 37℃ in a humidified 5% CO2 atmosphere for 24hr. Proliferation of splenocytes was performed by MTS assay.
- LPS는 대조군으로 1 ㎍/㎖을 처리하였다. 상충액을 취하여 sandwich ELISA 방법으로 TNF- 의 양을 측정하였다.
성능/효과
- 측정하였다. IFN- 생성은 천초 추출물 50, 100 ㎍/㎖ 에서 Con A 보다 많이 증가하였고, TNF- 생성은 천초 추출물 50, 100 ㎍/㎖에서 controle 비해 10-12배 정도 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 4A, B).
- NO는 유도성 산화질소 합성 효소로부터 guanidine nitrogen 을 이용해 합성되며 생체내에서 강력한 활성을 나타내며 생체 방어에 대단히 중요한 인자이다. 따라서 천초가 직접적으로 대식세포를 활성화시키는지 알아보기 위하여, 대식세포로부터 분비되는 중요한 매개 물질인 NO와 TNF- 의 생성을 먼저 측정한 결과, positive contr이로 사용한 LPS 와 유사한 양상으로 NO, TNF- 생성량을 증가시킴을 확인하였다 (Fig. 1A, B). NO는 macrophage 가 분비하는 세포 독성물질로13), TNF-α는 LPS에 의해 자극된 macrophage 에서 분비되는 항암작용 cytokine 으로 잘 알려져 있기 때문에14), 이와 같이 천초에 의한 NO 와 TNF- 의 생성 증가는 macrophage 활성화를 통한 선천 면역 반응에 관여함을 나타낸다.
- 즉, TLR4, MD2, CD14 로 구성된 수용체 복합체는 LPS 를 인식하여 숙주세포에 위험신호를 보내고 면역 반응을 시작한다15). 본 연구에서 천초는 LPS 와 유사하게 TLR4와 co-receptor 인 CD14 의 발현을 증가시킴을 확인했다 (Fig. 2).
- Th1 세포로부터 분비되는 사이토카인 중에 TNF-α는 IFN- 에 의해 생성이 증가하며, 또한 IFN- 에 의해 유도된 NO의 생성을 증폭시킴으로서 auto-crine signal로서 작용을 한다. 본 연구에서는 splenocyte를 이용하여 천 초 추출물이 Th1 사이토카인인 IFN- 와 TNF- 의 생성을 증가시킴을 확인하였다.
- C57BL/6 마우스로부터 대식세포를 분리하여 1x106 세포에 100 ㎍/㎖ 천초 추출물과 TLR4의 리간드로 알려진 LPS 을 24시간 처리한 뒤 flow cytometry 를 이용하여 발현 정도를 측정하였다. 세포표면 마커인 CD86 그리고 LPS와 LBP 복합체의 공동 수용체인 TLR4와 CD14 의 발현이 천초를 처리하지 않은 군에 비해 증가하는 것을 관찰하였고 또한 그 양상은 LPS 와 유사하였다 (Fig. 2).
- 보았다. 천초 Con A 와 함께 처리하였을 때뿐만 아니라 추출물 단독처리했을 때에도 모두 세포증식을 증가시킴을 확인하였다 (Fig. 3).
후속연구
- 이 연구를 통해 천초 추출물은 면역 조절제로서 동물을 비롯한 사람에게도 면역 증강을 유도 할 수 있는 가능성을 시사하며 인수 공통감염 모델에의 적용에도 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
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