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문제 정의
- 알아보았다.CYP3A4억제제로 잘 알려져 있는 Ketoconazole과 함께 비교 실험 하여 어느 정도 CYP3A4억제에 대해 유의성을 나타내는지를 측정해보았다.
- 본 연구에서는 지혈약의 한약재로 알려져 있는 艾葉, 槐花, 三七根, 紫草, 大薊草의 다섯 가지 한약재가 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 다양한 농도에서 약물상호작용에 크게 관여가되며, 특히간에서크게 반응성을 나타내는CYP3A4에 대한 반응성을 알아보았다.CYP3A4억제제로 잘 알려져 있는 Ketoconazole과 함께 비교 실험 하여 어느 정도 CYP3A4억제에 대해 유의성을 나타내는지를 측정해보았다.
- 그렇지만, 이에 대한 한약-양약상호작용에 대한 연구 등이 매우 부족한 실정이다. 이에다섯가지의지혈약으로간의CYP3A4효소 활성억제에관한연구를진행하여유의한결과를 얻었기에이를보고하는바이다.
제안 방법
- 넣어주고이는Control로사용되었다.CYP3A4의 대표적인inhibitor로알려져있는1mM로희석된 Ketoconazole역시1㎕을앞에서 설명한것과같 이준비된glasstube에넣어NegativeControl로써 다섯종류의한약재와비교하였다.각각의한약재 는먼저40㎎/㎖stock의농도로DMSO에녹인 후, 계산을통하여10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 농도로DMSO로 희석하였다.
- CYP3A4의 대표적인inhibitor로알려져있는1mM로희석된 Ketoconazole역시1㎕을앞에서 설명한것과같 이준비된glasstube에넣어NegativeControl로써 다섯종류의한약재와비교하였다.각각의한약재 는먼저40㎎/㎖stock의농도로DMSO에녹인 후, 계산을통하여10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 농도로DMSO로 희석하였다.각각의농 도로희석된한 약재역시준비된각각의glasstube에1㎕씩넣어 주었다.
- ) 의5종은옴니허브(Kyungbuk, Korea)에서구입하여100g정량후1L의80%에탄올을가하여 15분씩두번, 총 30분 동안 sonication 하였다.그리고Filter2여과지(Whatman, Maidstone, England) 를이용하여감압여과하였다.이여과액을감압농 축기 (Eyela, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축한 후, 얻어진농축액을동결건조하여(Freezedryer, Matsushita, Japan)각각13.
- 이때 DMSO는 control로 쓰였으므로 100%로 보면 된다.그리고나머지1mMKetoconazole과10~50㎍/㎖의각 각의한 약재가일으킨 대사반응의수치는control 을100%로 놓았을때의 비율로 계산하였다.
- 30분incubation이 끝나면, 처음 NGS를 넣었던순서에 맞추어서stopsolution을넣 어준다.그후SolidPhaseExtraction(SPE)과정 을 거쳐 N₂Evaporator에서 MeOH을 증발시킨 후, 0.1%FormicAcid와100%Acetonitrile이85: 15의비율로만들어진solution을1.5㎖microtube 들에각각50㎕씩넣고, 5분간격렬한voltexing 을한후LC/MS-MS용insert가들어있는Auto- samplingvial에그 대로옮긴후LC/MS-MSAPI 2000(Agilent, U.S.A)을 이용하여 각 sample들의 metabolite산출반응을측정하였다.
- 본 실험에서는 CYP450의 많은 isoform 들중에간에서의 가장 많이 발현되며, 간에서의 약물대사에가장 크게관여하는CYP3A4반응성을 Human LiverMicrosome을사용하여 측정하였다.
- 그리고Filter2여과지(Whatman, Maidstone, England) 를이용하여감압여과하였다.이여과액을감압농 축기 (Eyela, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축한 후, 얻어진농축액을동결건조하여(Freezedryer, Matsushita, Japan)각각13.84g, 35.4g, 24g, 39.5g, 25.5g의분말을얻어(수율:13.84%, 35.40%, 24%, 39.50%, 25.50%)농도에따라40㎎/㎖inDMSO의 stock으로부터 stock 과 DMSO의양을계산하여희석하였다(농도:10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖)(Table1).
- 최근 한약재 역시 약물상호작용에 큰 이슈가 되고있으므로, 지혈한약재인艾葉, 槐花, 三七根, 紫 草, 大薊草가 약물상호작용에 어떠한 영향을주는지에 대한 실험의첫단계로HumanLiverMicrosome 에서의반응성을각각의농도10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖ 에서측정하였다.
대상 데이터
- 1M Glucose-6-phosphate(G-6-P), 10mMNADP+, 1 unit/㎖Glucose-6-phosphatedehydrogenase(G-6-P dehydrogenase)등의 모든 시약은 Sigma에서 구입하였다. 0.1%AceticAcid, 100%Methanol(HPLC grade), 100% Acetonitrile(HPLCgrade), 0.1% FormicAcid의 용매는 J.CBaker에서 구입하여그대로 혹은 3차 증류수에 희석하여 사용하였다. 이모든시약과용매는한국과학기술연구원(KIST) 의대사유전체센터에서공급해주었다.
- SolidPhase Extraction을 위한 OasisSPE Kit는 웅기과학 (WatersKorea대리점)에서구입하여사용하였다. CYPprotocol에따른실험을위한glasstubes, 1.5㎖ microtubes그리고LC/MS-MS에서의Auto-sampling 을위한inserts와vials또한KIST대사유전체센터 에서지원을해주었다.
- 이모든시약과용매는한국과학기술연구원(KIST) 의대사유전체센터에서공급해주었다.SolidPhase Extraction을 위한 OasisSPE Kit는 웅기과학 (WatersKorea대리점)에서구입하여사용하였다. CYPprotocol에따른실험을위한glasstubes, 1.
- 본실험에서사용된chemical들(Dimethylsulfoxide (DMSO), 1MketoconazoleinDMSO:CYP3A4 indexinhibitor, 10mM midazolaminDMSO: CYP3A4substrate, 16uMTerfenadine:Internal standard, 1M Kpibuffer(pH 7.4), 0.1M Glucose-6-phosphate(G-6-P), 10mMNADP+, 1 unit/㎖Glucose-6-phosphatedehydrogenase(G-6-P dehydrogenase)등의 모든 시약은 Sigma에서 구입하였다. 0.
- 본실험에서사용한지혈약艾葉(Artemisiaprinceps Pampan), 槐花(SophorajaponicaLinne), 三七根 (PanaxnotginsengF.H.Chen), 紫草(Lithospermum ErythrorhizonSieb), 大薊草(CirsivmmaackiiMaxim.) 의5종은옴니허브(Kyungbuk, Korea)에서구입하여100g정량후1L의80%에탄올을가하여 15분씩두번, 총 30분 동안 sonication 하였다.그리고Filter2여과지(Whatman, Maidstone, England) 를이용하여감압여과하였다.
- 최소연령10세부터최고연령70세까지의다양한질환과치료경력을가진사람들을대상으로 남성기증자15명, 여성 기증자 7명의 간에서 채취한 Microsome을 한독바이오테크 (수입 :BD Biosciences)에서구입하였다.각각의Viale0.
이론/모형
- 연구의 신뢰도를 높이기 위하여 최근 CYP450 activity측정에 많이 사용되고 있는 LC/MS-MS 측정법을사용하였다.
성능/효과
- 43%로 나타내었다.10~50㎍/㎖ 에서 모두negativecontrol로사용된ketoconazole 의enzymeactivity6.22%와 비교하여ketoconazole 처럼inhibition시키지는 않았으며 오히려control인 DMSOenzymeactivity보다 높게측정됨을관 찰할수있었다(Fig.5).
- 72%로 나타내었다.10~50㎍/㎖ 에서 모두negativecontrol로사용된ketoconazole 의enzymeactivity6.22%와비교하여ketoconazole 처럼inhibition시키지는 않았으며 오히려 control인 DMSOenzymeactivity보다높게 측정됨을관 찰할수있었다(Fig.4).
- 54%로 나타내었다.40㎍/㎖에서control 인DMSO에 비하여 미세하게inhibition되었으나 이는 negativecontrol로 사용된 ketoconazole처럼 inhibition시키지는 않았음을 관찰할 수 있으며, 10, 20, 30, 50㎍/㎖에서는 control DMSO 보다 높은활성도를나타내었다(Fig.2).
- Control로 사용한 DMSO의 enzymeactivity를 100%으로하였을때negativecontrol인Ketoconazole 의enzymeactivity는6.22%로측정되었다.
- Control로 사용한 DMSO의 enzymeactivity를 100%으로하였을때negativecontrol인Ketoconazole 의enzymeactivity는6.22%로측정되었다.
- Control로 사용한 DMSO의 enzymeactivity를 100%으로하였을때negativecontrol인Ketoconazole 의enzymeactivity는6.22%로측정되었다.
- 66%로나타내었다.control인DMSO에 비하여10㎍/㎖에서는81%, 20㎍/㎖에서 미세하게 inhibition되었으나이는negativecontrol로사용된ketoconazole처럼 inhibition시키지는 않았음을 관찰할 수 있으며, 30, 40, 50㎍/㎖에서는control DMSO보다 높은활성도를 나타내었다(Fig.3).
- 三七根, 紫草, 大薊草 역시도 대부분이 컨트롤보다 낮은 억제율을 보이고 있어 CYP3A4를 억제 하지않는다는 결론이 나왔다. 또한, 이 결과들이 CYP3A4유도(induction)를 한다고 보기는어렵다.
- 그결과, 대부분의 농도가 50%의 억제율을 산출시키지못하였으며, Ketoconazole뿐만아니라, 컨트롤로 사용한 DMSO보다도 높은 평균값을 나타내었다.(n=3)이 결과는 CYP3A4가 유도되었음을 말해줄 수 있는 자료는 되지 못하지만, 다섯가지 한약재들이 약물상호작용에있어서 안정성을 나타내고 있음을 말해준다고 볼 수 있다.
- 억제하는 반응성은 있다고 볼 수 없다. 하지만, 이 결과는 CYP3A4에 대한 약물상호작용이 일어나지 않으므로 다른 약물과 함께 복용하게 되어도 큰 영향을 끼치지 않는다는 것을 추측할 수 있었다.
후속연구
- 이다.그리고 그결과들을 토대로 임상실험을 진행하여 한약재의 우수성과 안정성을 증명할수있다는 목표를 가지고 실험을 진행하여야 할것이다.
- 더 나아가서, 더 정확하고 확실한 결과를 얻기 위해서는 약재의 반응성을 시간별로 정확히 측정 하여 판독하는 KineticStudy를 비롯하여, 세포에서의 RNA, 단백질레벨측정, 동물실험을 통한 각각의 조직들에 대한 RNA, 단백질레벨측정등의 전임상단계실험이 먼저 진행이되어야 할 것 이다.그리고 그결과들을 토대로 임상실험을 진행하여 한약재의 우수성과 안정성을 증명할수있다는 목표를 가지고 실험을 진행하여야 할것이다.
- 마지막으로, 약물상호작용을 일으키는 정도는 개인마다 다양하게 나타나는데, CYP450에존재하는약물의양과CYP450에대한약물의친화도뿐만 아니라나이, 영양상태, 질환상태, 다양한CYP450에의한대사경로등에따라차이를나타내기때문에 더많은연구가invitro, invivo 상에서 뿐만 아니라 임상을 통해서진행되어야할것이다.
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