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문제 정의
- 본 연구에서는 국내에서 한국잔디류에 대표적인 난방제성 잔디병으로 알려져 있는 갈색퍼짐병의 생물학적 방제를 위해 길항 미생물의 선발, 길항 미생물의 최적 배양조건, IPM 소재로의 사용 여부, 방제 효과의 검정을 수행하였다.
제안 방법
- 0 g)에 약 250회(페트리디쉬 당 약 30회 정도가 적당) 점적하였다. 72시간 경과 후, 선택배지 위에 점적한 토양 함유 물한천배지에서 형성된 R. solani 균을 현미경 하에서 동정하고(Fig. 1), 배지에 형성된 균총의 수를 계수하였다. 특히, 2007년 10월에 야외 포장 실험이 수행된 지역 외에서 잔디 갈색퍼짐병이 새로 발생한 지역을 대상으로길 항 미생물 처리지역[처리구, 18m2(6m2X3반복)]과 처리 하지 않은 지역[무처 리구, 18 m2(6 m2 X 3반복)]으로 구분하여 추가적인 실험을 수행하였다.
- 대하여 혼용성 여부를 조사하였다. B. subtilis CJ-9를 LB배지 (yeast extract 0.5%, tryptone 1.0%, NaCl 0.5%) 에서 30℃에 12시간 동안 진탕 배양하고, IX 107 cell(spore)/ ml 수준으로 조정하여 현탁액을 제조하였다. 이 현탁액을0.
- B. subtilis CJ-9처리에 따른 토양 중 R. solani의 밀도를 조사하기 위하여 선택배지 상에서 균총을 계수하였다. 본 연구에서는 R.
- 이용하였다. RPI를 구하는 방법은 다음과 같으며, 효과는 잔디 갈색퍼짐병 억제 효과 검증 실험에서의 방제 가를 X 값으로 계산하였고, Kinetics는 후보 균들을 5 ml LBS 배지 (soluble starch, 10 g/l; Tiyptone, 10 g/7; Yeast extract, 5 g/l; NaCl, 5g/l)에서 1차 사면배양(30℃, 16시간) 한 후, 10m/ LBS 배지에서 2차 사면배양((30℃(2, 12시간) 을 진행한 후보 균들의 최종 OD600'을 X값으로 이용하였다.
- RPI를 이용한 균주 선발 과정을 통해 잔디 갈색퍼짐병균에 높은 항균활성을 나타내는 길항미생물의 동정을 위해 형태적 특성 및 생리적 특성을 조사하였다. 균주의 동정에 있어 1차적으로 Bergey's manual of determinative bacteriology, Microbiological methods, Manual of methods for general bacteriology, Bergey's manual of systemic bacteriology 등을 참고하였고, BIOLOG system, Fatty acid methyl ester(FAME) 분석과16s RNA 유전자 염기서열 분석을 통하여 최종적으로 동정하였다.
- 투명환의 크기가 10mm 이상인 것을 기준으로 순수 분리된 균총을 TSB에 배양하여 균총의 형태 및 현미경 관찰을 통해 본 결과, actinomycetes, bacteria, fungi 등 총 28종의 미생물이 조사되었다(Table 1). 각각의 순수 분리된 미생물은 지역과 분리 순서에 따라 일련의 명칭을 부여하였고, in vitro 상에서 R. solani AG2-2에 대한 활성 저 지원 실험 결과 직경이 17mm 이상인 것과 균사 억제율이 65% 이상인 균주(CJ-9, CJ-4, G-47, G-50)를 대상으로 잔디 갈색퍼짐병 억제력을 측정할 폿트 수준의 생물검정 실험에 사용하였다.
- 국내 골프장 페어웨이에 식재되어있는 한국잔디에 문제가 되고 있는 잔디 갈색 퍼짐 병원균인 R. solani AG2-2에 대해 항균 활성을 갖는 미생물을 선발하기 위해서 경기 9개 지역, 충북 2개 지역, 충남 1개 지역의 골프장 토양과 밭 토양, 산림 토양을 채취하여, 삼중층 평판배지를 이용하여 길항균을 분리하였다. 삼중 층 평판배지를 만들기 위한 과정은 다음과 같이 진행하였다.
- 균주의 동정에 있어 1차적으로 Bergey's manual of determinative bacteriology, Microbiological methods, Manual of methods for general bacteriology, Bergey's manual of systemic bacteriology 등을 참고하였고, BIOLOG system, Fatty acid methyl ester(FAME) 분석과16s RNA 유전자 염기서열 분석을 통하여 최종적으로 동정하였다.
- 의 배양 조건을 참고하여 실제 생물적 방제법에 사용될 수준의 길항 미생물제제 시제품을 생산하여 외부 포장 실험에 사용하였다. 길항 미생물제제는 외부의 오염균으로부터 보호하고자 H2SO4를 이용하여 pH를 4.2 정도로 낮추고, 멸균 증류수를 이용하여 미생물의 밀도를 1.0 X108 수준으로 조제하였다.
- solani AG2-2에 대해 생육 저지환의 유무로 길항성 미생물을 선발하여 trytic soy broth(TSB) 배지를 이용하여 배양한 다음 대칭배양법과 생육 저지환(clear zone) 측정법을 이용하여 우수한 길항력이 있는 미생물을 선별하였다. 대칭배양법의 경우 다음의 식에 의해 생육 저해율을 계산하였고, 생육 저지환 측정법은 투명환의 직경으로서 길항력을 평가하였다.
- 실험 대상 지역에서의 시비, 통기, 예초 등의 관리는 비발디파크 Par 3 골프 코스의 관행 관리에 따라 진행하였다. 병 발생여부는 해당 실험 기간인 5월부터 11월까지 주기적으로 방문하여 조사하였다.
- 이상 재배한 것을 사용하였다. 병원균 접종원은 1일 간격으로 2회 연속 살균한 sand-oatmeal 배지(1,000ml 삼각플라스크에 모래 380 g, oatmeal 20 g을 넣어 혼합하고, 증류수 76ml를 첨가)에 감자한천배지(PDA)에서 5일간 배양한 R. solani AG2-2의 균총을 코르크보아로 채취한 것을 5개씩 이식하여 251 항온기에서 20일간 배양하여 준비하였다. 준비된 병원균의 접종은 길항미생물 처리 전에 지름이 1 cm인 실린더를 이용하여 깊이 5~10 cm로 구멍을 뚫고, pot 당 접종원을 20 g 수준으로 처리하였으며, 길항미생물 처리는 대상 길항미생물이 충분히 자랄 수 있도록 potato dextrose broth(PDB)나 TSB에서 150rpm으로 3(TC에서 48hr동안 배양 후 배양액을 100배 희석하여 pot당 200 m씨 처리하였다.
- solani의 밀도를 조사하기 위하여 선택배지 상에서 균총을 계수하였다. 본 연구에서는 R. solani AG2-2의 밀도를 따로 조사하지 않고, R. solanie 밀도 변화와 거의 일치할 것으로 예상하고 조사를 수행하였다. B.
- 85% topping용 soft agar 5 mZ에 100을 첨가하고 잘 혼합한 후, LB agar plate에 부어 풍건하여 합성농약 혼용성 평가용 배지를 제조하였다. 살균수 처리를 대조 구로하고, 78개 검정 대상 농약의 권장희석배수의 1/10배, 1배, 2배 희석액을 제조하여 0.8mm thick paper disc에 100 B씩 처리하여서 미리 제작한 농약 혼용성 평가용 배지 위에 치상한 다음 30℃에서 배양하여 생육 저지 원의 유무로 농약 혼용성을 평가하였다. 혼용성 여부는 전 농도에 걸쳐서 생육 저지원이 생기지 않는 것을 기준으로 하였다.
- 해당 골프장의 전체 페어웨이 중 16번과 8번 홀 사이에 1000 n?의 면적으로 길항 미생물을 처리한 실험구(처리구)를 조성하였고, 실험구 아래의 5번과 3번 홀 주변을 합성농약 처리구인 관행구(대조구)로 정하였다, 두 지역에서 실험에 영향을 줄만한 환경의 차이는 없었다. 실험 기간 동안 길항 미생물을 7회(5/30, 7/10, 8/ 23, 9/3, 9/19, 10/1, 10/19) 처리하였고, 합성농약은 발병과 기상조건을 고려하여 7회(7/27, 8/10, 8/24, 8/27, 9/5, 9/16, 11/2) 처리하였다. 관행구에 처리된 합성농약으로는터부코나졸 유제(상표명, 호리쿠어)를 1,000배 희석하여 1 "n?로 처리하였다.
- 야외 포장 약효 실험지역을 대상으로 길항 미생물제제 (Bacillus subtilis CJ-9; 제품명 CJ-9)를 1차 처리 시점 직후부터 3차례(6월 16일, 7월 13일, 8월 3일)에 걸쳐길항미생물 처리지역(처리구)과 무처리지역(대조구)의 토양을 채취하여 잔디 갈색퍼짐병원균인 R. solani AG2-2 의 토양 내 밀도를 조사하였다. 각 시기별로 처리구와 대조 구를 대상으로 3곳을 무작위로 선택하여 표면으로부터 15cm 내외의 깊이로 토양을 채취하여 음지에서 24시간 이상 풍건한 후 실험에 사용하였다.
- 5%) 에서 30℃에 12시간 동안 진탕 배양하고, IX 107 cell(spore)/ ml 수준으로 조정하여 현탁액을 제조하였다. 이 현탁액을0.85% topping용 soft agar 5 mZ에 100을 첨가하고 잘 혼합한 후, LB agar plate에 부어 풍건하여 합성농약 혼용성 평가용 배지를 제조하였다. 살균수 처리를 대조 구로하고, 78개 검정 대상 농약의 권장희석배수의 1/10배, 1배, 2배 희석액을 제조하여 0.
- 여액을 증류수를 사용하여 1Z로 조정한 다음 한천 (agar) 15 g을 첨가하고 30 m/용 시험관에 10 ml씩 분주한 다음, 통상의 방법으로 가압 멸균하여 50℃의 항온수조에 보관하였다. 이어서 채취한 토양시료 1g을 멸균한 생리식염수 100ml 에 현탁한 다음, 현탁액 2~3방울을 상기 시험관에 넣고 잘 혼합하여 배양기를 제조하였다. 제조한 배양기 위에 1.
- 야외 포장 실험이 이루어진 비발디파크 Par 3 골프장의 경우 잔디 갈색퍼짐병에 의한 피해가 매년 발생되는 곳으로 실험이 이루어진 당 해（2007년）의 강수량과 강수 빈도와 같은 조건하에서는 발병이 충분히 예상될 수 있는 곳이었다. 잔디 갈색퍼짐 병의 방제를 위한 길항 미생물과 살균제의 처리는 발병 전부터 이루어졌으며, 본 병의 방제 적기는 발병 직전으 로 병의 발생 후에는 방제가 쉽지 않기 때문에 전년 코 스 관리 일지를 참고하여 미리 약제 처리 일정을 계획하였다. 또한, 길항 미생물의 경우는 토양 병원균의 서식처 인 탯취층에 정착하여 항균 물질 혹은 먹이 경쟁을 통해 병원균의 밀도를 낮추는 방법으로 병을 방제하기 때문에 병 발생 전 예방 시약이 살균제에 비해 더욱 중요하다.
- solani AG2-2를 코르크보아를 이용하여 약 3g 채취하여 20ml의 멸균 증류수를 넣고 homogeniger를 이용하여 분쇄하여 50℃ 항온기에 준비된 PDA 배지 10ml에 2~3방울 첨가하고 잘 혼합한 후에 상기의 배양기에 다시 분주하여 삼중층 평판배지를 제조하였다. 제조된 평판배지를 30℃ 항온기에서 3~7일간 배양하고, 잔디 갈색 퍼짐 병원균인 R. solani AG2-2에 대해 생육 저지환의 유무로 길항성 미생물을 선발하여 trytic soy broth(TSB) 배지를 이용하여 배양한 다음 대칭배양법과 생육 저지환(clear zone) 측정법을 이용하여 우수한 길항력이 있는 미생물을 선별하였다. 대칭배양법의 경우 다음의 식에 의해 생육 저해율을 계산하였고, 생육 저지환 측정법은 투명환의 직경으로서 길항력을 평가하였다.
- 이어서 채취한 토양시료 1g을 멸균한 생리식염수 100ml 에 현탁한 다음, 현탁액 2~3방울을 상기 시험관에 넣고 잘 혼합하여 배양기를 제조하였다. 제조한 배양기 위에 1.5% 물한천배지 용액 5ml를 넣어 굳힌 후, 마지막으로감자한천배지(PDA)에서 25℃ 항온 조건으로 7일간 배양한 R. solani AG2-2를 코르크보아를 이용하여 약 3g 채취하여 20ml의 멸균 증류수를 넣고 homogeniger를 이용하여 분쇄하여 50℃ 항온기에 준비된 PDA 배지 10ml에 2~3방울 첨가하고 잘 혼합한 후에 상기의 배양기에 다시 분주하여 삼중층 평판배지를 제조하였다. 제조된 평판배지를 30℃ 항온기에서 3~7일간 배양하고, 잔디 갈색 퍼짐 병원균인 R.
- solani AG2-2의 균총을 코르크보아로 채취한 것을 5개씩 이식하여 251 항온기에서 20일간 배양하여 준비하였다. 준비된 병원균의 접종은 길항미생물 처리 전에 지름이 1 cm인 실린더를 이용하여 깊이 5~10 cm로 구멍을 뚫고, pot 당 접종원을 20 g 수준으로 처리하였으며, 길항미생물 처리는 대상 길항미생물이 충분히 자랄 수 있도록 potato dextrose broth(PDB)나 TSB에서 150rpm으로 3(TC에서 48hr동안 배양 후 배양액을 100배 희석하여 pot당 200 m씨 처리하였다. 대조구는 펜시쿠론 수화제를 1, 000배 희석액을 살포하였다.
- 각 시기별로 처리구와 대조 구를 대상으로 3곳을 무작위로 선택하여 표면으로부터 15cm 내외의 깊이로 토양을 채취하여 음지에서 24시간 이상 풍건한 후 실험에 사용하였다. 채취한 토양 5 g을 50 ml 물한천배지 (water agar, WA; agar 함량 0.03%)에 넣고 잘 교반하여 희석한 후, micro-pipet으로 1 ml 취하여 Ko와 Hora(1971)가 제시한 R. solani 선택배지를 변형한 배지(멸균 증류수 l, OOOnZ에 K2HPO4 1.0 g, MgSO4-H2O 0.5 g, KC1 0.5 g, FeSO4 . 7H2O 10.0 mg, NaNO2 0.2 g, gallic acid 0.4 g, dexon 70% WP 90.0 mg, fosetyl-Al 0.25 g, chloramphenicol 50.0 mg, streptomycin 50.0 mg, agar 20.0 g)에 약 250회(페트리디쉬 당 약 30회 정도가 적당) 점적하였다. 72시간 경과 후, 선택배지 위에 점적한 토양 함유 물한천배지에서 형성된 R.
- 최종 길항 미생물의 선정은 병원균에 대한 길항력과 생장 속도를 복합적으로 고려할 수 있도록 세균의 생장 속도와 세포 분열 속도를 기본 값으로 하여 종합적인 세균의 배양 속도를 측정하는 RPI 기법 (Slininger 등, 2003)을 본 실험에 적합하게 변형하여 이용하였다. RPI를 구하는 방법은 다음과 같으며, 효과는 잔디 갈색퍼짐병 억제 효과 검증 실험에서의 방제 가를 X 값으로 계산하였고, Kinetics는 후보 균들을 5 ml LBS 배지 (soluble starch, 10 g/l; Tiyptone, 10 g/7; Yeast extract, 5 g/l; NaCl, 5g/l)에서 1차 사면배양(30℃, 16시간) 한 후, 10m/ LBS 배지에서 2차 사면배양((30℃(2, 12시간) 을 진행한 후보 균들의 최종 OD600'을 X값으로 이용하였다.
- 최종 선발된 길항미생물 Bacillus subtilis CJ-9에 대하여 골프장에서 통상적으로 사용하고 있는 살균제, 살충제, 제초제 78 개에 대하여 혼용성 여부를 조사하였다. B.
- 1), 배지에 형성된 균총의 수를 계수하였다. 특히, 2007년 10월에 야외 포장 실험이 수행된 지역 외에서 잔디 갈색퍼짐병이 새로 발생한 지역을 대상으로길 항 미생물 처리지역[처리구, 18m2(6m2X3반복)]과 처리 하지 않은 지역[무처 리구, 18 m2(6 m2 X 3반복)]으로 구분하여 추가적인 실험을 수행하였다.
대상 데이터
- solani AG2-2 의 토양 내 밀도를 조사하였다. 각 시기별로 처리구와 대조 구를 대상으로 3곳을 무작위로 선택하여 표면으로부터 15cm 내외의 깊이로 토양을 채취하여 음지에서 24시간 이상 풍건한 후 실험에 사용하였다. 채취한 토양 5 g을 50 ml 물한천배지 (water agar, WA; agar 함량 0.
- 관행구에 처리된 합성농약으로는터부코나졸 유제(상표명, 호리쿠어)를 1,000배 희석하여 1 "n?로 처리하였다. 길항 미생물은 앞에서의 균주 선발실험과 본 연구에 기재하지 않은 수차례의 외부 포장 실험을 통해 효력이 입증된 길항미생물(B. subtilis CJ -9)을액상수화제로 제형화한 길항 미생물제제[CJ-9, (주)그린바이오텍]을 사용하였다. 길항미생물의 처리는 골프장의 지하수를 이용하여 200배로 희석액을 제조하고, 희석액을 처리할 대상 페어웨이에 1 /lI n?로 관주처리 하되, 희석액은 살포 직전에 제조하여 사용하였다.
- 준비된 병원균의 접종은 길항미생물 처리 전에 지름이 1 cm인 실린더를 이용하여 깊이 5~10 cm로 구멍을 뚫고, pot 당 접종원을 20 g 수준으로 처리하였으며, 길항미생물 처리는 대상 길항미생물이 충분히 자랄 수 있도록 potato dextrose broth(PDB)나 TSB에서 150rpm으로 3(TC에서 48hr동안 배양 후 배양액을 100배 희석하여 pot당 200 m씨 처리하였다. 대조구는 펜시쿠론 수화제를 1, 000배 희석액을 살포하였다. 약제 처리 후에 습실상(온도 25℃(2, 상대습도 100%)에 두고 발병을 유도하였다.
-
상대적 길항효과 지수(Relative Performance Indies, RPI)를 이용한 길항미생물 선정.
- 실험에 사용할 한국잔디(zoysiagrass)는 한국잔디 포장에서 채취하여 30X45 cm 사각 pot로 옮긴 후에 20~30℃ 의 온실에서 30일 이상 활착시킨 것과 종자를 파종 후 60일 이상 재배한 것을 사용하였다. 병원균 접종원은 1일 간격으로 2회 연속 살균한 sand-oatmeal 배지(1,000ml 삼각플라스크에 모래 380 g, oatmeal 20 g을 넣어 혼합하고, 증류수 76ml를 첨가)에 감자한천배지(PDA)에서 5일간 배양한 R.
- 동정 자료를 토대로 일반적인 Bacillus spp.의 배양 조건을 참고하여 실제 생물적 방제법에 사용될 수준의 길항 미생물제제 시제품을 생산하여 외부 포장 실험에 사용하였다. 길항 미생물제제는 외부의 오염균으로부터 보호하고자 H2SO4를 이용하여 pH를 4.
- 약제 처리 후에 습실상(온도 25℃(2, 상대습도 100%)에 두고 발병을 유도하였다. 처리 10일 후에 발병 면적율을 조사하고, 무처리 대비 방제 가(%)를 구하여 높은 항균활성을 나타내는 미생물을 선발하였다.
성능/효과
- subtilis CJ-9를 액상수화제로 제형화한 것을 처리한 지역（처리구）과 살균제를 이용한 관행 관리 지역（관행구）에서 의 갈색퍼짐병의 발병 현황을 조사한 결과（Fig. 3）, 관행 구에서는 7월 중순과 10월 중순에 갈색퍼짐병이 발생하 였지만, 처리구에서는 조사기간 동안 갈색퍼짐병이 발생하지 않았다. 이와 같은 결과를 통해 B.
- 10 XlWCFU에 비해 현저하게 낮았다. 7월 10일 2차 처리 후 7월 13일 토양을 채취하여 무처리구와 비교한 결과 토양 g 당 R. solanie 검출빈도는 평균 2.50X103cfu으 로 무처리구의 검출빈도 4.20X 103CFU에 비해 낮았고, 8월 3일 토양을 채취하여 무처리구와 비교한 결과 토양 g 당 R. solani의 검출빈도는 평균 2.27X lO/FU으로 무처 리구의 검출빈도 3.63X103CFU에 비해 낮았다(Fig. 4). 상대적으로 7월 13일과 8월 3일의 검출빈도가 6월 16일에 비해 낮은 것은 R solani가 여름과 같은 고온보다는 봄, 가을 같은 서늘한 기온에서 토양 내 밀도가 높아지며 발병률이 높아지는 생리적 특성에 기인한 것으로 판단된다.
- solanie 밀도 변화와 거의 일치할 것으로 예상하고 조사를 수행하였다. B. subtilis CJ-9을 5월 30일에 최초 처리한 후, 6월 16일 토양을 채취하여 무처리구와 비교한 결과 실험구의 토양 g 당 R. solanie 검출빈도는 평균 4.97X103CFU으로 무처리구의 검출빈도 7.10 XlWCFU에 비해 현저하게 낮았다. 7월 10일 2차 처리 후 7월 13일 토양을 채취하여 무처리구와 비교한 결과 토양 g 당 R.
- 또한, 친환경적인 방제를 위해 화학 농약의 사용을 전면적으로 중지하더라도 기존의 화학 농약이 토양 내에서 완전히 소멸되기에는 많은 시간이 필요하기 때문에 화학 농약에 대한 영향을 검정하는 것이 필요하였다. 골프 장에서 널리 사용되고 있는 화학 농약 제품 중 살균제 43 종, 살충제 11종, 제초제 22종, 생장조절제 1종에 대하여 B. subtilis CJ-9에 미치는 영향에 대해 조사한 결과（Table 4） 살균제의 경우, 카바메이트계, 피리미딘계, 이족사놀계, 카르복시아니라이드계, 아실아라닌계, 요소계 등 22종, 살 충제는 유기인계, 카바메이트계, 합성 피레스로이드계 등 6종이 혼용 가능하였고, 제초제에 있어서는 디니트로아니 린계, 설포닐우레아계, 카바메이트계 등 4종이 가능하였다. 이와 같은 결과를 토대로 골프장에서의 포장실험에서는 방제 계획 중 길항 미생물에 영향을 미칠 수 있는 농약의 사용 여부를 미리 점검하여 방제 계획에 반영하였다.
- 실내실험을 통해 R. solani AG2-2에 대해 길항 능력이 뛰어난 것으로 조사된 4개 균주에 대해 폿트를 이용한 생물 검정 실험을 실시한 결과(Table 2), CJ-9과 CJ- 4가 무처리 대조구 대비 방제가(%)에서 비교적 높은 병 발생 억제력을 나타냈으며, 두 균주는 통계적으로 화학농약 처리와 동일한 수준의 우수한 방제력을 나타냈다. 폿트에서의 실험은 비교적 빠른 시간 안에 여러 후보 균주에 대해 in vivo 상에서의 잔디 갈색퍼짐병의 방제 가을 검정할 수 있다는 장점이 있다.
- subtilis CJ-9을 처리하기 전(10/12)에 토양을 채취하여 토양 g 당 R soZam.의 검출빈도를 조사 한 결과, 길항 미생물 처리 전에는 평균 1.97X 103CFU으로 무처리구의 2.20X 103CFU와 비슷하였으나, B. subtilis CJ-9을 처리한 7일 후(10/19)에는 무처리구와 비교한 결과, 토양 g 당 R. solani의 검출빈도가 평균 1.53X 103CFU 으로 다소 감소하는 경향을 나타냈지만, 무처리구에서는 2.60X103CFU으로 증가하였다. 이는 B.
- 토양 전염성 병원균의 방제를 목적으로 하는 미생물 제제로 이용되기 위하여 길항 미생물은 병원균에 대한 길항력 외에도 토양 내에서 밀도를 유지하고 병원균에 대한 계속적인 억제력을 갖기 위하여 병원균 대비 높은 생장 속도를 가지고 있어야 한다. 이에 본 연구에서는 상대적 길항효과 지수(RPI) 개념을 도입하여 위 능력에 대해 검증한 결과 (Fig. 2), RPI 값을 기준으로 보았을 때, CJ-9이 약 60으로 가장 높은 RPI 값을 가진 것으로 나타나 잔디 갈색 퍼짐 병에 대한 미생물 제제의 후보 균주로 최종 선정 되었다.
- 3）, 관행 구에서는 7월 중순과 10월 중순에 갈색퍼짐병이 발생하 였지만, 처리구에서는 조사기간 동안 갈색퍼짐병이 발생하지 않았다. 이와 같은 결과를 통해 B. subtilis CJ-90］ 갈색퍼짐병 방제를 위한 대안으로 사용될 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다
- 또한, 길항 미생물의 경우는 토양 병원균의 서식처 인 탯취층에 정착하여 항균 물질 혹은 먹이 경쟁을 통해 병원균의 밀도를 낮추는 방법으로 병을 방제하기 때문에 병 발생 전 예방 시약이 살균제에 비해 더욱 중요하다. 잔디 갈색퍼짐병의 방제를 위해 선발된 길항미생물 B. subtilis CJ-9를 액상수화제로 제형화한 것을 처리한 지역（처리구）과 살균제를 이용한 관행 관리 지역（관행구）에서 의 갈색퍼짐병의 발병 현황을 조사한 결과（Fig. 3）, 관행 구에서는 7월 중순과 10월 중순에 갈색퍼짐병이 발생하 였지만, 처리구에서는 조사기간 동안 갈색퍼짐병이 발생하지 않았다.
- 이때, 토양 현탁액에 존재하는 사상형 미생물(filamentous soil microorganism)의 경우 물한천 층까지 생장하여 병원균 접종 시 오염원으로 작용할 수 있으므로 토양 현탁액이 희석된층이 일체의 외부 오염 없이 완전히 건조된 후, 물한천을 붓도록 함으로써 사상형 미생물의 간섭을 방지하였다(이 등, 1997). 투명환의 크기가 10mm 이상인 것을 기준으로 순수 분리된 균총을 TSB에 배양하여 균총의 형태 및 현미경 관찰을 통해 본 결과, actinomycetes, bacteria, fungi 등 총 28종의 미생물이 조사되었다(Table 1). 각각의 순수 분리된 미생물은 지역과 분리 순서에 따라 일련의 명칭을 부여하였고, in vitro 상에서 R.
- . 형태학적 특성을 조사하고, 염기서열의 분석을 실시한 결과, GenBank의 Bacillus 와 16s rRNA 서열의 동일성이 98% 이상 나타나 최종적으로 B. subtilise 동정하였다(Table 3). 동정 자료를 토대로 일반적인 Bacillus spp.
후속연구
- subtilis CJ-9처리 에 따라 토양내 병원균의 밀도가 줄어든 것으로 판단된다. 따라서 본 길항 미생물을 실제 골프장에 적용하여 잔디 갈색퍼짐병 방제에 사용할 경우 병발생을 줄여 잔디 갈색퍼짐병에 사용되는 합성농약 사용량을 효과적으로 줄일 수 있을 것으로 판단된다.
- 그러나 집중적인 화학적 방제는 병원균의 저항성 발현과 주변 환경의 오염, 인축 독성 등 많은 부작용을 초래한다(Nelson, 1997; Uddin와 Viji, 2002). 적절한 경종적 방제는 골프장 관리에 있어서 필수 요소이지만, 골프장 운영의 특성상 플레이어들의 경기 시간과 코스 관리자들의 작업 시간이 상충되고, 장마와 같은 기후적인 영향으로 충분히 이루어질 수 없는 경우가 많으므로 이를 보완할 수 있는 새로운 관리가 필요하다. 또한, 최근에는 골프장에서의 농약사용에 의한 환경문제가 대두되면서 우리나라에서도 농약사용 저감을 위한 환경친화적 병해 관리가 요구되고 있다.
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