[논문]환경 스트레스에 의한 세포 내 신호의 이동 경로와 유전적 조절

김일섭; 김현영; 강홍규; 윤호성

[국내논문] 환경 스트레스에 의한 세포 내 신호의 이동 경로와 유전적 조절
Genetic Regulation of Cellular Responses and Signal Targeting Pathways Invoked by an Environmental Stress 원문보기

환경생물 = Korean journal of environmental biology, v.26 no.4, 2008년, pp.377 - 384

김일섭 (경북대학교 생물학과) , 김현영 (경북대학교 생물학과) , 강홍규 (제주대학교 아열대 원예산업 연구소) , 윤호성 (경북대학교 생물학과)

Abstract ▼ AI-Helper

A cell is the product of a long period of evolution and can be represented as an optimized system (homeostasis). Stimuli from the outside environment are received by sensory apparatus on the surface of the cell and transferred through complicated pathways and eventually regulate gene expression. These signals affect cell physiology, growth, and development, and the interaction among genes in the signal transduction pathway is a critical part of the regulation. In this study, the interactions of deletion mutants and overexpression of the extracopies of the genes were used to understand their relationships to each other. Also, green fluorescent protein (GFP reporter gene) was fused to the regulatory genes to elucidate their interactions. Cooverexpression of the two genes in extracopy plasmids suggested that patS acts at the downstream of hetR in the regulatory network. The experiments using gfp fusion in different genetic background cells also indicated the epistasis relationships between the two genes. A model describing the regulatory network that controls cell development is presented.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

또한 과발현 벡터를 이용해서 하나의 유전자 또는 두 개의 유전자를 동시에 과발현함으로써 두 유전 자간의 상호작용을 이해하고자 하였다 (Table 1). 단백질 형성 자체를 못하게 하는 돌연변 이 (deletion mutants)를 시행하여 단백질 일부만 돌연변이를 일으키는 경우 (point mutation/insertion mutation) 가 잠재적으로 연구 결과에 끼칠 수 있는 여러 문제점을 사전에 예방하고자 하였다. 예를 들어, AnPCC 7120에서 유전자의 179 번째 염기에 점 돌연변이가 일어나 serine이 asparagine 으로 바뀐 hetR 유전자의 돌연변 이 형 (mutant allele)과 정상적인 염기서열을 가진 야생형 유전자형 (wild-type allele) 이 한 세포 내에 동시에 존재할 경우, 돌연변 이 유전자형이 야생형 유전자형보다 우성이라는 사실이 보고된 바 있다(Huang et al.
이러한 목적하에 7120의 hetR과 유전자를 대상으로 단일 돌연변이와 이 중 돌연변이의 경우에는 한 유전자의 발현이 다른 관련 유전자 발현을 제어하는 등의 유전자 간 상호작용 (epistasis)을 분석하였다. 또한 과발현 벡터를 이용해서 하나의 유전자 또는 두 개의 유전자를 동시에 과발현함으로써 두 유전 자간의 상호작용을 이해하고자 하였다 (Table 1). 단백질 형성 자체를 못하게 하는 돌연변 이 (deletion mutants)를 시행하여 단백질 일부만 돌연변이를 일으키는 경우 (point mutation/insertion mutation) 가 잠재적으로 연구 결과에 끼칠 수 있는 여러 문제점을 사전에 예방하고자 하였다.
이들 신호는 세포의 생리대사, 생장, 발달에 영향을 미치게 되며 유전자 간의 상호 작용 또한 중요한 부분이다. 본 연구는 세포 발생을 제어하는 핵심적인 조절 유전자들 간의 상호 조절 연관 관계를 reporter gene (GFP) fusion, double knock-out 및 double overexpression과 같은 분자생물학적인 방법으로 탐구하여, 유전자 조절경로 네트워크 (genetic regulatory network)를 밝히고자 하였다. 다양한 유전자 돌연변이의 상호작용은 우리가 유전자 간의 조절 관계를 상세히 논하는데 사용되었다.
본 연구에서는 이형세포의 패턴을 형성하는데 필수적인 유전자들의 돌연변이를 유발하였을 경우, 이러한 유전적 변화가 이형세포의 발생에 미치는 영향을 알아보았다. 이러한 목적하에 7120의 hetR과 유전자를 대상으로 단일 돌연변이와 이 중 돌연변이의 경우에는 한 유전자의 발현이 다른 관련 유전자 발현을 제어하는 등의 유전자 간 상호작용 (epistasis)을 분석하였다.
기능적 인 관계를 파악하는데 이용될 수 있다. 본 연구에서는과 paAS 유전자의 단일돌연변이체 및 이 중 돌연변이 간의 표현형을 비교하고, hetR과 patS 유전자 동시 과발현 형질을 분석함으로써 이들 유전자 간의 상 위성 (epistasis) 및 이형세포분화와 패턴형성 과정의 관계를 알아봄으로써 유전자 조절경로 네트워크(genetic regulatory network)^ 밝히 고자 하였다

가설 설정

1). HetR 이외의 다른 양성 조절인자들이 HetR에 의해 직접적으로 조절된다는 증거가 제시된 바 없다는 사실로부터 HetR의 중요한 기능 중 하나가 분화과정을 직접적으로 조절하는 PatS와 같은 분화억제 자를 저해한다는 가정을 할 수 있다. 만약 이 가정이 사실이라면, pms의 비활성이 ZietR의 비활성에 상위성을 가질 것이다.

제안 방법

이 유전자는 CheY 서 열과 유사한 C-말단과 신호전달과 관련이 있는 조절인자서열의 N-말단으로 이루어져 있는 두 개의 도메인을 암호화하고 있다. CheY의 인산화에 필수적인 세 개의 아미노산이 보존되어 있다는 사실은 PatA의 조절이 인산화와 관련될 수 있다는 것을 제안한다. 돌연변이체는 사상체 중간에 나타나는 이형세포가 거의 형성되지 않으나, filament의 길이에 상관없이 filament의 끝에서 하나의 이형세포로 분화된다.
1에서 제시된 시간 동안 즉정되었다. Multiple-contiguous-heterocyst 형성의 백분율을 결정하기 위해서, 100개의 이형세포가 계산되었고 인접한 이형세포의 수도 각각 기록되었다. 모든 결과는 표준편차를 제시하는 오차율을 포함하는 3번의 반복실험의 평균을 기록하였다.
308-bp 단편은 pGEM-T 벡터로 클로닝되었고, 프라이머 내부에 포함된 제한효소 절단부위를 사용하는 BamHl- SacI 단편으로서 결합체를 포함하는 pDR119 로 이 동되었다. 결과물로 생 긴 VgE-hetR patS 합성 오페론은 그 후에 pDR151 을 만들기 위해 Kgl-SacI 단편으로서 pAM504로 클로닝 되었다. 모든 PCR 생산물은 다음의 단계에 사용되기 전에 염기서열 분석에 사용되어 Taq 돌연변이가 없는지 검증되었다.
UHM111 과 UHM113은 5% 자당, 스펙티노마이신 그리고 스트렙토마이신을 포함하는 BG-11 배지에 저항성을 보였다. 돌연변이 구조를 확인하기 위해서 설계된 프라이머로 돌연변이의 영역을 증폭하였고, PCR 생산물의 크기는 돌연변이 구성체가 야생형 영역으로 복귀했는지를 확인하는데 사용되었다. 이 중 재조합에서 결실 돌연변이의 초기 선발을 위해서, 군체 (colony) PCR이 사용되었다.
또 다른 경우로서, 삽입 돌연변이, 정지억제 돌연변이, 틀이동 돌연변이에 의해 초래될 수 있는 불완전 펩티드들이 그 기능이 변화하는 것으로 나타났고 (Egland and Greenberg 2000), 전위 인자에의 삽입은 주위 유전자들의 조절에 영향을 주는 것으로 나타났다(Wang and Roth 1988). 이 연구에서 사용된 돌연변이들 각각은 스펙티노마이신과 스트렙토마이신 모두에게 저항성을 부여하는 interposon을 가진 유전자로 교체하여 특정유전자가 완전히 결실될 수 있도록 유도하였다.
이러한 돌연변이들의 유도는 박테리아에서는 가능한 일 이고, Nostoc punctijbrnie ATCC 29\33 같은 다른 선상 (filamentous) 의 남조류에서는 이루어져 왔으나,7120에서의 실험은 많지 않았다. 이 연구에서는 CaiandWolk(1990)의 연구에 제시된 방법을 약간 변형시켜 돌연변이 선택 마커를 남기지 않는 돌연변이체들을 만들었다. 특히, 단일 재조합형 (single recombinants)은 단일 세포들 내에서 표지되지 않은 염색체들이 완전한 분리되도록 충분한 시간을 주어 자라도록 하였으며 filament들은 서로 섞이기 않도록 두 번째 재조합(double recombinants) 전에 서로 나누었다.
이러한 목적하에 7120의 hetR과 유전자를 대상으로 단일 돌연변이와 이 중 돌연변이의 경우에는 한 유전자의 발현이 다른 관련 유전자 발현을 제어하는 등의 유전자 간 상호작용 (epistasis)을 분석하였다. 또한 과발현 벡터를 이용해서 하나의 유전자 또는 두 개의 유전자를 동시에 과발현함으로써 두 유전 자간의 상호작용을 이해하고자 하였다 (Table 1).

대상 데이터

Plasmid pSMC 164는 각각 유전자를 UHM101 과 UHM103 계통으로부터 결실시켜 UHM111과 UHM113 계통을 형 성 하기 위해 사용되었다. pSMC 164는 pSMC₁₄7 에서 유래되었고, pSMC 147은 patS$] 결실을 유도하도록 설계되었다.
그리고 hetRe 그 후에 의 3'말단과 hetR의 5'말단에서 pDR119를 만들기 위해 프라이머에 의해 만들어진 Ndelsite들을 이용하는 Ndel-pst단편으로서 이 벡터 안으로 이동되었다. 결합체는 pDR120을 만들기 위해 단편으로서 pDR119 에서 pAM504로 이동되었다. Plasmid pDR151은 PCR에 의해 생성되는 암호화 영역의 35 bp 상류에서 시작하는 308-bp 단편의 첨가에 의해 만들어진 pDR120과 다르다(프라이머 pafSF-BamHI과 을 사용함).
1998). 이형세포 형성과정에서의 pafS의 이형세포 저해작용이hetR 전사의 하류조절로 작동하는지를 알아보기 위해, 구리 유도성 pefE 프로모터의 조절하에 #이나 #과 patS 두 유전자를 포함한 재조합 오페론을 가지는 pDR120과 pDR151 plasmid가 야생형 계통과 patS 또는 # 돌연변이체로 도입되었다. 구리의 존재하에 이들 플라스미드가 포함된 균주를 배 양한 경우,#이나 hetR 과 patS7\ 동시에 과발현되었다.

데이터처리

Multiple-contiguous-heterocyst 형성의 백분율을 결정하기 위해서, 100개의 이형세포가 계산되었고 인접한 이형세포의 수도 각각 기록되었다. 모든 결과는 표준편차를 제시하는 오차율을 포함하는 3번의 반복실험의 평균을 기록하였다.

성능/효과

벡터의 결손은 네오마이신에 대한 감수성과 벡터에 의해 암호화되는 몇몇의 저항성을 시험함으로써 증명된다. UHM111 과 UHM113은 5% 자당, 스펙티노마이신 그리고 스트렙토마이신을 포함하는 BG-11 배지에 저항성을 보였다. 돌연변이 구조를 확인하기 위해서 설계된 프라이머로 돌연변이의 영역을 증폭하였고, PCR 생산물의 크기는 돌연변이 구성체가 야생형 영역으로 복귀했는지를 확인하는데 사용되었다.
2004). hetR 결실 돌연변이체의 He 표현형을 억제하는 돌연변이들을 분리하는 데 실패한 상위성 실험결과는 R이 직접적으로 분화에 필요한 hetR과 pa/S 유전자들뿐만 아니라 다른 인자의 활성을 직접적으로 조절한다는 것을 나타낸다.
이 연구에서 증명 된 것처 럼 PatS, HetN 중에서 patS의 과발현은 hetR의 것에 대해 우위이기 때문에 hetR 전사 upstream고} 마찬가지로 hetR downstream 의 활성이 조절되는 것으로 볼 수 있다. hetR 상위 실험 결과는, 분화에 필요한 부가적 인 요소들은 그들의 활성에 HetR이 거의 직접적으로 관여하지 않는다는 것을 나타낸다. PatA는 분화에서 PatS와 HetN의 음성 적 인 영 향의 전사감쇠를 보여주고 우위 실험 결과에 의해 제안된 것처럼 PatS와 HetN의 상반되는 영향에 독립인 분화를 촉진한다.
특히, 단일 재조합형 (single recombinants)은 단일 세포들 내에서 표지되지 않은 염색체들이 완전한 분리되도록 충분한 시간을 주어 자라도록 하였으며 filament들은 서로 섞이기 않도록 두 번째 재조합(double recombinants) 전에 서로 나누었다. 그다음, colony PCRe 두 번째 재조합을 통해 원하는 유전형을 지닌 filaments를 선별하기 위해 사용되었는데, 조사된 이 중 재조합형들의 대략 절반이 원하는 돌연변이들을 가졌음을 확인되었다.
그 결과, Q Sp7Smr cassette을 포함하지 않는 pa결실 단일 돌연변이체는 이전에 보고된 바와 같이, patS Q Spr/Smr cassette대체돌연변이와 표현형 이 같았다 (Yoon and Golden 1998, 2001). 또한, hetR, patS5\ 이 중 돌연변이들이 단일 돌연변이체와의 표현형 비교분석 및 가능한 상위 작용 (epistasis)을 알아보기 위해 만들어졌으며, 각각의 돌연변이들이 이형세포 발생 및 패턴 형성에 관한 확실한 표현형을 나타냄으로써, 어떤 경우의 돌연변 이가 이 중 돌연변 이의 표현형 에 기반을 둔 상위인가를 확인하는 것이 가능하였다.
반면에, HetR이 직접적으로 분화에 필요한 다른 인자들을 조절하고 분화과정에 절대적으로 필요하다면, 의 비활성이 상위성을 가져야만 하고 이 중 돌연변이 표현형들은 He가 되어야만 한다. 실험 결과, (/ze deletion) 배경하에 pafS 유전자 이 중 돌연변이체가 단일-삭제 돌연변이체인 He와 같은 표현형을 나타냄으로써, 이형세포의 분화과정에 있어서 HetR의 주된 역할이 PatS에 의한 분화억제자에 의해 저해되지 않는다는 사실을 제시해 준다고 할 수 있다(Table 1).

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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