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문제 정의
- 본 연구에서는 국내에서 이용할 수 있는 생물검정법의 하나로발광박테리아를 이용한 독성 테스트 방법을 소개하였다. 발광박테리아 독성 테스트 방법은 이미 선진국에서 많은 검증을 통해 신속성, 정밀성, 경제성 등에서 우수하다고 평가받아 왔다.
- 본 연구에서는 발광박테리아 독성 테스트 시스템으로의 적합성을 평가하기 위해 기본 항목 평가와 화학물질 및 현장시료평가, 정도관리평가를 수행하였다. 기본 항목 평가에서는 시약 분주의정확도 및 정밀도 평가, 발광박테리아 시약의 시간에 따른 발광안정성 평가를 실시하였다.
- 이에 본 연구에서는 전문인력이 부족한 국내 실정에 맞게 누구나 쉽게 수행할 수 있는자동화 방식의 발광박테리아 생물검정법을 자체적으로 개발하여국내 현장 해양오염 평가에 이용할 수 있도록 하였다. 여기에서는국내에서 개발된 발광박테리아 독성평가키트(N-Tox)를 이용하여실시된 발광박테리아 시험법의 적합성 테스트 결과 및 실험정도관리(QA/QC)와 현장 적용 테스트 결과 및 실험정도관리(QA/QC), 발광박테리아 독성평가 공정시험법(안)의 내용을 소개하고자 한다.
- 어려움으로 활용된 사례가 드물었다. 이에 본 연구에서는 전문인력이 부족한 국내 실정에 맞게 누구나 쉽게 수행할 수 있는자동화 방식의 발광박테리아 생물검정법을 자체적으로 개발하여국내 현장 해양오염 평가에 이용할 수 있도록 하였다. 여기에서는국내에서 개발된 발광박테리아 독성평가키트(N-Tox)를 이용하여실시된 발광박테리아 시험법의 적합성 테스트 결과 및 실험정도관리(QA/QC)와 현장 적용 테스트 결과 및 실험정도관리(QA/QC), 발광박테리아 독성평가 공정시험법(안)의 내용을 소개하고자 한다.
가설 설정
- 발광도는 테스트 샘플의 생물활동 외의 원인에 의해서도 시간에 따라 변할 수 있다. 그러나 테스트 과정에서 나타날 수 있는 모든 변이는대조구 테스트 반응을 고려함으로써 상쇄시킬 수 있다고 가정하여 대조구와 샘플 사이의 발광도 차이를 시료 독성에 의한 영향이라고 간주한다.
제안 방법
- N-Tox 발광박테리아 시약의 발광 안정도를 평가하기 위해 실험생물을 100µl씩 자동분주하여 10분 간격으로 발광도를 측정하였다(Table 4). N-Tox 발광박테리아 독성 시험에서는 시험용기로 불투명하고 웰 바닥이 평평한 흰색 96웰 플레이트를 이용한다.
- N-Tox를 이용한 표준독성물질 민감도 측정 시험은 96웰플레이트에 최고 농도 200 mg/L부터 연속 2배씩 희석된 10개의 농도 구배를 4반복 실험으로 실시하였고 대조구는 물질당 8개를 두었다. 현장 시료 독성 실험은 250µl에 발광박테리아 시약 25µl를 분주하게 한 것을 4반복으로 처리하였다.
- 수행하였다. 기본 항목 평가에서는 시약 분주의정확도 및 정밀도 평가, 발광박테리아 시약의 시간에 따른 발광안정성 평가를 실시하였다. 모든 시료는 테스트 전에 염분을 보정하였다.
- 발광박테리아의 독성 측정 방법은 매우 신속하게 이루어진다. 물벼룩, 어류 등의 독성 테스트 방법이 24시간, 48시간, 96시간 등을 요구하는 반면(ASTM, 1996; USEPA, 2002), 본 시험방법은 5분, 15분, 혹은 30분 만에 생물에 대한 영향 유무를 점검해낼 수 있다. 또한 본 시험법은 반복성이 매우 우수하여 반복구간의 상대표준오차는 10% 이내이다.
- 시약 자동 주입량 테스트는 N-Tox 기기와 NTI 100 소프트웨어를 이용하여 증류수 25µl, 50µl, 75µl, 100µl에 해당되는 양을 자동주입하게 한 후 해당되는 각각의 무게를 소수 4째자리까지 표시되는 저울(AX200, Shimazu)로 측정하여 총 10회 반복하였다. 발광량 측정 테스트는 N-Tox 기기에 96웰플레이트를 장착시키고 발광박테리아 시약을 96well 각각에 100µl씩 자동 분주 시키면서 즉시 발광량을 자동 측정하게 하는 방식으로 수행하였고 발광량 자료는 각 행의 값중 첫 번째 열개 값을 100으로 표준화하여 나머지 각 행의 값을 상대적으로 전환시켜 표현하였다.
- 표준독성물질 노출시간은 국제표준시험법(ISO, 1998c)에 의거 발광박테리아 시약 주입후 30 분을 주었고 30분후 발광량은 N-Tox 기기에 의해 자동 측정되었다. 발광박테리아 독성 시험 결과 비교가 필요한 경우 반수 영향농도(EC50, Median Effective Concentration)를 산출하였다.
- 발광박테리아 시약은 N-Tox기기에서 자동 주입되는데 그 정밀도를 알아보고자 증류수로 프로그램에 입력된 주입량 수치와 분주되었을 때 실제 무게를 비교하여 정확도 및 정밀도 측정을 실시하였다. 실험은 증류수를 이용하여 지정된 양을 자동 주입방식으로 주입하고 주입된 양을 소수 넷째자리 전자저울을 이용하여매번 측정하는 방식으로 각 주입량에 대해 총 10회씩 진행되었다 (Table 3).
- 본 시험 방법이 유해물질에 대한 평가에 적합함이 위의 결과로입증되었으나 현장 시료에 대해 적용 가능할 정도의 민감도를 보유하고 있는지 증명하기 위해 현장에서 채취한 육수(D1, D2, D3), 기수(D4), 해수(D5) 시료에 대하여 N-Tox 발광박테리아 독성 평가를 실시하였다(Fig. 2). 채취된 육수 시료의 염분이 없어(0 psu) 미리 20 psu로 염분을 보정하여 독성 시험을 실시하였으며, 기수시료의 염분은 17 psu로 염분 보정을 하지 않았으며, 해수 시료역시 염분이 32 psu에 달해 염분 보정없이 독성 시험을 실시하였다.
- 본 연구에서 개발된 N-Tox 시스템이 문제없이 잘 작동되고 있는 지 점검하고 생산된 자료에 대하여 신뢰성을 확보하기 위해 표준 독성물질을 이용하여 정도관리하였다(Fig. 3). 표준 독성물질로는 국제표준화기구에서 추천한 3, 5-dichlorophenol을 이용하였다.
- 본 연구에서 소개하고자 하는 발광박테리아 독성평가기법은 자연적으로 해양에 서식하며 발광하는 발광박테리아(Vibrio fischeri) 에게 오염물질이 유입될 경우 독성 영향에 의해 미생물의 발광 도가 줄어들며 줄어드는 정도는 오염물질의 강도와 비례한다는 원리를 이용하여 독성을 측정한다. 이 방법은 외국의 Microtox나 국내의 N-Tox 같이 상업화된 독성키트의 형태로 판매되고 있으며 상대적으로 짧은 시간에 많은 시료의 독성을 검색할 수 있고, 반복성이 좋으며, 오염물질에 대한 용량-반응 관계가 뚜렷하고, 비용 절감효과가 뛰어나 국제적으로도 좋은 평가기술로 인정받고 있어 국내 연구자들에게도 잘 알려진 방법이다(Giesy and Hoke, 1990; 이 등, 2007).
- 화학물질에 대한 테스트는 희석수 DW100을 이용하였고 해양기원의 표층수나 고체상 테스트에는 희석수 DW200을 이용하였다. 시약 자동 주입량 테스트는 N-Tox 기기와 NTI 100 소프트웨어를 이용하여 증류수 25µl, 50µl, 75µl, 100µl에 해당되는 양을 자동주입하게 한 후 해당되는 각각의 무게를 소수 4째자리까지 표시되는 저울(AX200, Shimazu)로 측정하여 총 10회 반복하였다. 발광량 측정 테스트는 N-Tox 기기에 96웰플레이트를 장착시키고 발광박테리아 시약을 96well 각각에 100µl씩 자동 분주 시키면서 즉시 발광량을 자동 측정하게 하는 방식으로 수행하였고 발광량 자료는 각 행의 값중 첫 번째 열개 값을 100으로 표준화하여 나머지 각 행의 값을 상대적으로 전환시켜 표현하였다.
- 발광박테리아 시약은 N-Tox기기에서 자동 주입되는데 그 정밀도를 알아보고자 증류수로 프로그램에 입력된 주입량 수치와 분주되었을 때 실제 무게를 비교하여 정확도 및 정밀도 측정을 실시하였다. 실험은 증류수를 이용하여 지정된 양을 자동 주입방식으로 주입하고 주입된 양을 소수 넷째자리 전자저울을 이용하여매번 측정하는 방식으로 각 주입량에 대해 총 10회씩 진행되었다 (Table 3).
- 용량-반응 관계가 명확해야 한다. 이를 증명하기 위해 중금속인 potassium dichromate와 유기독성물질인 3, 5-dichlorophenol 에 대한 용량-반응 평가를 수행하였다(Fig. 1). 발광박테리아는 potassium dichromate에 30분간 노출될 때 3.
- 2). 채취된 육수 시료의 염분이 없어(0 psu) 미리 20 psu로 염분을 보정하여 독성 시험을 실시하였으며, 기수시료의 염분은 17 psu로 염분 보정을 하지 않았으며, 해수 시료역시 염분이 32 psu에 달해 염분 보정없이 독성 시험을 실시하였다. 시험결과, 육수인 D1, D2, D3 시료에서는 노출 5분만에 40% 이상의 발광저해가 발생하였고 D4 시료에서는 노출 5분에 약 17% 발광저해가 야기되었으나 해수시료인 D5에서는 노출 5분 경과시발광도가 대조구보다 증가하는 현상을 보였다.
- 두었다. 현장 시료 독성 실험은 250µl에 발광박테리아 시약 25µl를 분주하게 한 것을 4반복으로 처리하였다. 표준독성물질 노출시간은 국제표준시험법(ISO, 1998c)에 의거 발광박테리아 시약 주입후 30 분을 주었고 30분후 발광량은 N-Tox 기기에 의해 자동 측정되었다.
- 15 psu 이하의 시료는 염분조절액을 이용하여 20 psu로조절하였고 15 psu에서 35 psu사이의 시료는 염분 보정을 하지않았다. 화학물질 및 현장시료 평가에서는 potassium dichromate 나 3, 5-dichlorophenol과 같은 물질의 EC50 값을 테스트하였고 육상-기수역-해양에 대한 현장시료의 독성 검출 능력을 테스트하였다. 정도관리평가 실험에서는 표준독성물질을 이용하여 주기적으로 EC50을 측정하고 이를 국제표준규격 범위에 부합되는지 살펴보았다(ISO, 1998c).
대상 데이터
- (1981)에 의해 발광박테리아의 발광량 저하 현상이 독성의 지표로 이용될 수 있는 가능성이 밝혀진 후부터 발광박테리아 공정시험법의 시험생물로 널리 이용되고 있다. 본 연구에서 사용한 시험생물 및 관련 시약은 네오엔비즈(Korea)에서 제공되는 N-Tox 제품을 이용하였다. 이 제품의 구성은 시험생물(V.
- fischeri 가 있다. 세부적인 strain까지 덧붙이면 시험생물은 Vibrio fischeri(NRRL B- 11177) 이다. 다른 균주로 V.
- fischeri; NRRL B-11177)을 동결건조형 분말로 제공하는 발광박테리아시약(VF 100), 휴면상태의 발광박테리아를 깨우는 재활성화시약(RS 100), 시료 및 시약 희석에 이용되는 무독성시약(DW 100 & DW 200), 삼투압 조절 목적의 염분 조절 시약(SA 100) 등으로 구성되어 있으며 평상시에 상온 또는 -20 oC 상태로 보관하다가 시험이 필요할 때 발광박테리아 시약에 재활성화시약을 넣어주면 휴면상태의 박테리아가 깨어나 발광하기 시작하게 되어있어 즉시 독성시험에 이용할 수 있다. 시험용기는 간편화 및 대량시료처리화를 위해 96웰플레이트를 이용하였으며 발광박테리아 시약 주입 및 발광량 측정은 자동화기기인 N-Tox Model 300(네오엔비즈)을 이용하였다. 정도관리를 위하여 국제표준화기구에서 추천한 표준독성물질 K2Cr2O7, 3, 5-Dichlorophenol, ZnSO4·7(H2O)를 사용하였다.
- 본 연구에서 사용한 시험생물 및 관련 시약은 네오엔비즈(Korea)에서 제공되는 N-Tox 제품을 이용하였다. 이 제품의 구성은 시험생물(V. fischeri; NRRL B-11177)을 동결건조형 분말로 제공하는 발광박테리아시약(VF 100), 휴면상태의 발광박테리아를 깨우는 재활성화시약(RS 100), 시료 및 시약 희석에 이용되는 무독성시약(DW 100 & DW 200), 삼투압 조절 목적의 염분 조절 시약(SA 100) 등으로 구성되어 있으며 평상시에 상온 또는 -20 oC 상태로 보관하다가 시험이 필요할 때 발광박테리아 시약에 재활성화시약을 넣어주면 휴면상태의 박테리아가 깨어나 발광하기 시작하게 되어있어 즉시 독성시험에 이용할 수 있다. 시험용기는 간편화 및 대량시료처리화를 위해 96웰플레이트를 이용하였으며 발광박테리아 시약 주입 및 발광량 측정은 자동화기기인 N-Tox Model 300(네오엔비즈)을 이용하였다.
- 시험용기는 간편화 및 대량시료처리화를 위해 96웰플레이트를 이용하였으며 발광박테리아 시약 주입 및 발광량 측정은 자동화기기인 N-Tox Model 300(네오엔비즈)을 이용하였다. 정도관리를 위하여 국제표준화기구에서 추천한 표준독성물질 K2Cr2O7, 3, 5-Dichlorophenol, ZnSO4·7(H2O)를 사용하였다.
- 3). 표준 독성물질로는 국제표준화기구에서 추천한 3, 5-dichlorophenol을 이용하였다. 표준독성물질 민감도 측정 자료는 2007년 3월부터 2008년 4월까지 약 1년의 기간동안 N-Tox test를 수행할 일이 있을 때마다 표준독성물질에 대한 민감도 측정 시험을 실시하여 생산되었다.
- 표준 독성물질로는 국제표준화기구에서 추천한 3, 5-dichlorophenol을 이용하였다. 표준독성물질 민감도 측정 자료는 2007년 3월부터 2008년 4월까지 약 1년의 기간동안 N-Tox test를 수행할 일이 있을 때마다 표준독성물질에 대한 민감도 측정 시험을 실시하여 생산되었다. 국제표준화기구에서 제시한 3, 5-dichlorophenol의 EC50 값은 3.
- 화학물질에 대한 테스트는 희석수 DW100을 이용하였고 해양기원의 표층수나 고체상 테스트에는 희석수 DW200을 이용하였다. 시약 자동 주입량 테스트는 N-Tox 기기와 NTI 100 소프트웨어를 이용하여 증류수 25µl, 50µl, 75µl, 100µl에 해당되는 양을 자동주입하게 한 후 해당되는 각각의 무게를 소수 4째자리까지 표시되는 저울(AX200, Shimazu)로 측정하여 총 10회 반복하였다.
이론/모형
- 현장 시료 독성 실험은 250µl에 발광박테리아 시약 25µl를 분주하게 한 것을 4반복으로 처리하였다. 표준독성물질 노출시간은 국제표준시험법(ISO, 1998c)에 의거 발광박테리아 시약 주입후 30 분을 주었고 30분후 발광량은 N-Tox 기기에 의해 자동 측정되었다. 발광박테리아 독성 시험 결과 비교가 필요한 경우 반수 영향농도(EC50, Median Effective Concentration)를 산출하였다.
성능/효과
- 3으로 주입 초기와 거의 유사한 것으로 나타났으며 웰의 위치에 관계없이 일정하였다. 20분이 경과하였을 때도 평균 상대 발광도는 101±3.3을 보여 큰 차이 없이 96개 각각의 웰에서 발광도가 유지되는 것으로 분석되었다. 상대표준편차(RSD)도 3%대로 다른 생물검정의 반복 결과보다 매우 뛰어난 것으로 관측되었다.
- 노출 15분 자료의경우 노출 5분 자료에 비해 모든 시료에서 독성이 증가하여 D1, D2, D3에서는 발광저해도가 50% 내외에 이르렀고 D4에서도 발광저해도가 25% 수준으로 증가하였으며 D5도 초기에 나타났던발광 증가분이 상쇄되어 대조구 수준으로 떨어졌다. 30분 노출되었을 때 D1-D3 시료는 60-70%의 발광저해를 보였고 D4에서는 30% 수준의 발광저해를 보였으며 D5에서도 미약한 수준이지만대조구와 통계적 유의성을 보이는 수준까지 발광저해도가 증가하였다. 이 결과는 이 시료들 내에 발광박테리아에 지속적으로 영향을 미치는 물질이 존재함을 암시하고 있으며 본 독성 시험 방법론이 현장 시료에 대해 적용가능한 수준의 민감도를 확보하고 있음을 증명해준다.
- Potassium dichromate와 3, 5-dichlorophenole 국제표준화기구 (ISO)에서 발광박테리아 독성 시험에서 민감도 시험을 위한 표준독성물질로 추천하였으며, EC50 값은 각각 18.7 mg/L와 3.4 mg/L로제시하였는데 본 연구에서 개발된 N-Tox 발광박테리아 독성 실험결과는 ISO에서 제시된 값과 거의 일치함을 보여 국제 표준프로토콜 기준에 만족하였다.
- 표준독성물질 민감도 측정 자료는 2007년 3월부터 2008년 4월까지 약 1년의 기간동안 N-Tox test를 수행할 일이 있을 때마다 표준독성물질에 대한 민감도 측정 시험을 실시하여 생산되었다. 국제표준화기구에서 제시한 3, 5-dichlorophenol의 EC50 값은 3.4 mg/L 수준임을 앞서 밝힌 바 있는데, 총 8번의 시험 결과 3, 5-dichlorophenol 의 EC50 값은 최소 2.7 mg/L에서 4.5 mg/L 까지 변동하는 것으로 측정되었는데 각 시기에 사용된 발광박테리아 시약의 제조일이 동일하지 않고, 보관 기간도 다른데다, 시기적으로 정해지지 않은 불특정한 시기에 독성 시험 이루어졌음에도 불구하고 표준독성물질 EC50 값의 최소 최대 변동 범위가 평균 ± 30% 수준이어서 정도관리가 잘 되고 있는 것으로 판단되었다.
- 시험결과, 육수인 D1, D2, D3 시료에서는 노출 5분만에 40% 이상의 발광저해가 발생하였고 D4 시료에서는 노출 5분에 약 17% 발광저해가 야기되었으나 해수시료인 D5에서는 노출 5분 경과시발광도가 대조구보다 증가하는 현상을 보였다. 노출 15분 자료의경우 노출 5분 자료에 비해 모든 시료에서 독성이 증가하여 D1, D2, D3에서는 발광저해도가 50% 내외에 이르렀고 D4에서도 발광저해도가 25% 수준으로 증가하였으며 D5도 초기에 나타났던발광 증가분이 상쇄되어 대조구 수준으로 떨어졌다. 30분 노출되었을 때 D1-D3 시료는 60-70%의 발광저해를 보였고 D4에서는 30% 수준의 발광저해를 보였으며 D5에서도 미약한 수준이지만대조구와 통계적 유의성을 보이는 수준까지 발광저해도가 증가하였다.
- 3 mg/L에서 80% 발광저해를 보이는것으로 나타났다. 또한 3, 5-dichlorophenol에 30분간 노출될 때 1.8 mg/L에서 20% 발광저해, 3.2 mg/L에서 50% 발광저해, 5.4 mg/L에서 80% 발광저해를 보이는 것으로 분석되었다. 이 두 물질은 노출시간 증가에 따라 독성영향이 다른 패턴을 보이는데 중금속인 potassium dichromate는 노출시간이 증가할수록 발광저해도는 증가하는 유형이 나타나고 유기독성물질인 3, 5-dichlorophenol 은에 대해서는 노출시간이 증가하여도 발광저해도는 초기에 발생했던 발광저해도 값과 유사하여 변동이 없는 형태을 보였다.
- 측정시기 온도와 습도는 각각 25 oC와 80% 이상으로 온도 습도는 보정되지 않은 수치였다. 또한 발광박테리아 독성시험에서 발광량은 상대적으로 측정되기 때문에 발광박테리아 시약이 절대량으로 얼마가 주입되었느냐보다는 시험구마다 얼마나 정밀하게 주입되었느냐가 더 중요할 수 있는데, 본 기기의 시약주입 정밀도는 25µl 주입시 상대표준오차 4.8%, 50µl 주입시 상대표준오차 1.2%, 100µl 주입시 상대표준오차 0.6%, 250µl 주입시 상대표준오차 0.2%로 수동으로피펫팅하는 결과보다도 더 정밀한 편이었다. 주입량이 많을수록 편차는 더욱 작아지는 것으로 분석되었는데 이러한 결과는 일반수동 피펫 사용의 경우에서도 유사하다.
- 주입량이 많을수록 편차는 더욱 작아지는 것으로 분석되었는데 이러한 결과는 일반수동 피펫 사용의 경우에서도 유사하다. 발광박테리아 독성 시험에서는 주로 100µl 주입을 사용하는데 100µl를 자동 분주하는경우 실제 분주되는 양은 98.9±0.6µl 정도로 매우 정확하고 정밀하여 사용자가 수동방식으로 직접 분주하는 경우보다 더 좋은 시험 결과가 산출될 수 있을 것으로 기대되었다.
- 1). 발광박테리아는 potassium dichromate에 30분간 노출될 때 3.125 mg/L 이상의 농도에서 발광저해현상이 일어나기 시작하며 농도가 증가됨에 따라발광저해는 계속 증가하여 6.8 mg/L 수준에서 20% 발광저해, 18.6 mg/L에서 50% 발광저해, 40.3 mg/L에서 80% 발광저해를 보이는것으로 나타났다. 또한 3, 5-dichlorophenol에 30분간 노출될 때 1.
- 3을 보여 큰 차이 없이 96개 각각의 웰에서 발광도가 유지되는 것으로 분석되었다. 상대표준편차(RSD)도 3%대로 다른 생물검정의 반복 결과보다 매우 뛰어난 것으로 관측되었다.
- 채취된 육수 시료의 염분이 없어(0 psu) 미리 20 psu로 염분을 보정하여 독성 시험을 실시하였으며, 기수시료의 염분은 17 psu로 염분 보정을 하지 않았으며, 해수 시료역시 염분이 32 psu에 달해 염분 보정없이 독성 시험을 실시하였다. 시험결과, 육수인 D1, D2, D3 시료에서는 노출 5분만에 40% 이상의 발광저해가 발생하였고 D4 시료에서는 노출 5분에 약 17% 발광저해가 야기되었으나 해수시료인 D5에서는 노출 5분 경과시발광도가 대조구보다 증가하는 현상을 보였다. 노출 15분 자료의경우 노출 5분 자료에 비해 모든 시료에서 독성이 증가하여 D1, D2, D3에서는 발광저해도가 50% 내외에 이르렀고 D4에서도 발광저해도가 25% 수준으로 증가하였으며 D5도 초기에 나타났던발광 증가분이 상쇄되어 대조구 수준으로 떨어졌다.
- 실험결과 전체적으로는 지정된 양보다 약간 적은 양이 들어가는 것으로 측정되었다. 자동시료주입 장치는 시약 분주 속도 분주량 등을 보정하는 일이 가능하여 오차가 너무 많이 발생하는 경우에는 보정해주어야 할 필요가 있으나 본 실험의 경우 참값과의차이는 매우 작아 특별히 보정하지는 않았다.
- 30분 노출되었을 때 D1-D3 시료는 60-70%의 발광저해를 보였고 D4에서는 30% 수준의 발광저해를 보였으며 D5에서도 미약한 수준이지만대조구와 통계적 유의성을 보이는 수준까지 발광저해도가 증가하였다. 이 결과는 이 시료들 내에 발광박테리아에 지속적으로 영향을 미치는 물질이 존재함을 암시하고 있으며 본 독성 시험 방법론이 현장 시료에 대해 적용가능한 수준의 민감도를 확보하고 있음을 증명해준다.
- 4 mg/L에서 80% 발광저해를 보이는 것으로 분석되었다. 이 두 물질은 노출시간 증가에 따라 독성영향이 다른 패턴을 보이는데 중금속인 potassium dichromate는 노출시간이 증가할수록 발광저해도는 증가하는 유형이 나타나고 유기독성물질인 3, 5-dichlorophenol 은에 대해서는 노출시간이 증가하여도 발광저해도는 초기에 발생했던 발광저해도 값과 유사하여 변동이 없는 형태을 보였다.
- 7로 웰의 위치와 주입된 시간에 관계없이 일정한 것으로 나타났다. 주입 후 10분 경과시 평균 상대 발광도는 101±3.3으로 주입 초기와 거의 유사한 것으로 나타났으며 웰의 위치에 관계없이 일정하였다. 20분이 경과하였을 때도 평균 상대 발광도는 101±3.
- N-Tox 발광박테리아 독성 시험에서는 시험용기로 불투명하고 웰 바닥이 평평한 흰색 96웰 플레이트를 이용한다. 주입과 동시에 측정하였을 때 96웰 평균 상대 발광도는 100±2.7로 웰의 위치와 주입된 시간에 관계없이 일정한 것으로 나타났다. 주입 후 10분 경과시 평균 상대 발광도는 101±3.
- 자동시료주입 장치는 시약 분주 속도 분주량 등을 보정하는 일이 가능하여 오차가 너무 많이 발생하는 경우에는 보정해주어야 할 필요가 있으나 본 실험의 경우 참값과의차이는 매우 작아 특별히 보정하지는 않았다. 측정시기 온도와 습도는 각각 25 oC와 80% 이상으로 온도 습도는 보정되지 않은 수치였다. 또한 발광박테리아 독성시험에서 발광량은 상대적으로 측정되기 때문에 발광박테리아 시약이 절대량으로 얼마가 주입되었느냐보다는 시험구마다 얼마나 정밀하게 주입되었느냐가 더 중요할 수 있는데, 본 기기의 시약주입 정밀도는 25µl 주입시 상대표준오차 4.
후속연구
- 분석 기술만을 사용하여 왔다. 그러나 이러한 이화 학적 분석 결과는 중금속이나 유기화합물 등 다양한 유해물질이 생물에 미치는 영향을 평가하는데 한계가 있다. 그 이유는 분석되고 관리되는 항목은 20여개에 그치는 반면, 국내에 약 36, 000 종의 유해화학물질이 유통되고 있고, 매년 새롭게 만들어지는 유해화학물질이 수백종에 달하여 모두 분석하여 관리하는 것이 불가능하기 때문이다(환경부, 2002).
- ISO와 같은 국제공인시험법에는 luminescent bacteria test라고 명명되어 있는데 이를 해석하면 발광박테리아 시험법이라는 말로 해석되는 것이 적절하므로 향후 공정시험법 개정안에서는 그 제목을 발광박테리아 독성 시험법이라 명명하는 것이 바람직해 보인다(ISO, 1998a; 1998c). 또한 국내에 서식하는 다양하고 민감한 생물들을 보다 안전하게 보호하고 생태계를 지속 가능하게 유지하기 위해서는 한 종류의 생물검정법에만 의존할 것이 아니라 그동안 국내 시험종으로 개발되어 그 타당성이 입증된 시험법들을 공정시험법화하고 다른 국내 시험종 개발도 지속적으로추진하는 정책방향 설정이 필요해 보인다.
- 이 방법은 외국의 Microtox나 국내의 N-Tox 같이 상업화된 독성키트의 형태로 판매되고 있으며 상대적으로 짧은 시간에 많은 시료의 독성을 검색할 수 있고, 반복성이 좋으며, 오염물질에 대한 용량-반응 관계가 뚜렷하고, 비용 절감효과가 뛰어나 국제적으로도 좋은 평가기술로 인정받고 있어 국내 연구자들에게도 잘 알려진 방법이다(Giesy and Hoke, 1990; 이 등, 2007). 또한 다른 생물검정법과는 달리 응용될 수 있는 분야가 넓어, 중금속, 유기금속 및 유기화합물 등과 같은 유해물질의 독성, 하천수, 기수 및 해수와 같은 표층수의 독성, 하수, 폐수, 오수 및 방류수와 같은 배출수의 독성, 지하수 및 공극수에 대한 독성, 슬러지, 폐기물 및 해양배출물질 등의 독성, 퇴적물 및 준설물질의 독성, 토양의 독성 평가에 이용될 수 있다.
- 본 시험생물을 독성시험종으로 이용하기 위해서는 유해물질에대한 용량-반응 관계가 명확해야 한다. 이를 증명하기 위해 중금속인 potassium dichromate와 유기독성물질인 3, 5-dichlorophenol 에 대한 용량-반응 평가를 수행하였다(Fig.
- 우리나라 육상과 해양의 물환경 정책목표와 관리 기준은 과거 BOD, COD 등 일반 환경 지표에 의거하여 설정되고 관리되어 왔으나 현재는 위해성, 생태성 개념이 새로운 환경 관리의 패러다임이며(환경부, 2006), 이러한 정책목표 달성을 위해서는 향후 10년간 생태독성평가기술(생물검정기술)이 수계 생태 위해성평가와 환경관리기준설정을 위한 가장 기본적인 자료 생산 구조 역할을 담당하게 될 것으로 예상된다.
- 발광박테리아 독성 테스트 방법은 이미 선진국에서 많은 검증을 통해 신속성, 정밀성, 경제성 등에서 우수하다고 평가받아 왔다. 이 방법은 국내 연구진에 의해 자동화, 대량시료처리화가 가능한 96웰플레이트 방식의 생물독성평가 방법으로 개발되어 누구나 쉽게 사용할 수 있으면서도 신속하고 정확하며 민감한 측정 자료를 산출해 줄 수 있는 것으로 평가되어, 국내 공정시험법의 하나로 도입하여 활용하면 비용 절감 등의 효과가 뛰어날 것으로 사료된다.
- 그 예로, 환경부에서는 2007년 물벼룩을 이용한 생물검정법을 공정시험법에 등재하였고(환경부, 2007), 해양수산부에서는 2002년부터 2006년까지 5개년 연구사업을 통해 해양환경공정시험법 등재를 위한 생물검정기술개발 사업을 실시하여 발광박테리아, 식물플랑크톤, 동물플랑크톤, 저서성 단각류, 어류 등 6개의 시험법을 개발한 바 있다. 이 중 물벼룩 생물검정법은 산업폐수 방류수에 대한생태독성 배출허용기준 검사 항목으로 지정하는 방안이 2007년입법되어 2011년부터 본격 적용될 예정이며, 발광박테리아 독성시험법, 단각류 독성시험법, 성게 독성시험법은 오염퇴적물 독성평가를 위한 사후모니터링 항목으로 지정되어 있으며, 해양배출물질의 생태독성기준 항목으로도 활용될 예정이다.
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