발광 세균 Photobacterium과 Vibrio의 lux 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 유전자 전이시킨 발광표현형 대장균이 내는 빛의 세기를 조사하였다. 여러 대장균 균주에 형질전환 시켰는 바, 빛을 내는데 관여하는 효소들을 코드하는 유전자를 모두 포함하는 Photobacterium leiognathi lux 오페론이 삽입된 재조합플라스미드(PlXba.pT7-3)가 형질전환된 대장균 43R (Escherichia coli 43R) 균주에서는 발광세기가 다른 균주에 비해 1,000배 이상 되었으며, Vibrio harveyi luxA 유전자와 luxB 유전자를 융합시킨 유전자가 삽입된 재조합플라스미드(VhluxAB.pT7-5)가 형질전환 된 대장균 43R (E. coli 43R)에서는 기질인 fatty aldehyde를 가하면 단일 콜로니에서도 빛을 볼 수 있게 되는 대장균 형질전환체를 얻었다. 또한 이들이 중금속에 노출되었을 때 생물발광이 감소하였으며, 이들 발광 대장균 형질 전환체가 담긴 고정화된 세포에서도 빛을 내는 것을 관측함으로써 이들 실험 결과들이 lux 유전자를 활용한 바이오센서 시스템 개발의 기반 기술이 될 가능성을 보였다.
발광 세균 Photobacterium과 Vibrio의 lux 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 유전자 전이시킨 발광표현형 대장균이 내는 빛의 세기를 조사하였다. 여러 대장균 균주에 형질전환 시켰는 바, 빛을 내는데 관여하는 효소들을 코드하는 유전자를 모두 포함하는 Photobacterium leiognathi lux 오페론이 삽입된 재조합플라스미드(PlXba.pT7-3)가 형질전환된 대장균 43R (Escherichia coli 43R) 균주에서는 발광세기가 다른 균주에 비해 1,000배 이상 되었으며, Vibrio harveyi luxA 유전자와 luxB 유전자를 융합시킨 유전자가 삽입된 재조합플라스미드(VhluxAB.pT7-5)가 형질전환 된 대장균 43R (E. coli 43R)에서는 기질인 fatty aldehyde를 가하면 단일 콜로니에서도 빛을 볼 수 있게 되는 대장균 형질전환체를 얻었다. 또한 이들이 중금속에 노출되었을 때 생물발광이 감소하였으며, 이들 발광 대장균 형질 전환체가 담긴 고정화된 세포에서도 빛을 내는 것을 관측함으로써 이들 실험 결과들이 lux 유전자를 활용한 바이오센서 시스템 개발의 기반 기술이 될 가능성을 보였다.
To provide the basis of biosensor based on the lux genes from bioluminescent bacteria of Photobacterium leiognathi and Vibrio harveyi, we test the expression of lux genes in several strains of Escherichia coli. The expression of the recombinant plasmid of PlXba.pT7-3, containing all lux genes requir...
To provide the basis of biosensor based on the lux genes from bioluminescent bacteria of Photobacterium leiognathi and Vibrio harveyi, we test the expression of lux genes in several strains of Escherichia coli. The expression of the recombinant plasmid of PlXba.pT7-3, containing all lux genes requiring for light emission without adding substrate, in E. coli 43R was so strong to see the blue-green light in single colony as well as in the alginate immobilized cell. In addition, the light intensity was decreased by adding heavy metal ion such as cadmium and zinc ions. These result raise the possibility that a biosensor can be developed using the lux genes system.
To provide the basis of biosensor based on the lux genes from bioluminescent bacteria of Photobacterium leiognathi and Vibrio harveyi, we test the expression of lux genes in several strains of Escherichia coli. The expression of the recombinant plasmid of PlXba.pT7-3, containing all lux genes requiring for light emission without adding substrate, in E. coli 43R was so strong to see the blue-green light in single colony as well as in the alginate immobilized cell. In addition, the light intensity was decreased by adding heavy metal ion such as cadmium and zinc ions. These result raise the possibility that a biosensor can be developed using the lux genes system.
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문제 정의
발광 세균이 독성 물질에 노출되면 발광대사에 저해를 미치게 되어 발광량이 감소하게 되며 미량의 독성물질에도 민감하게 반응하기 때문에 독성 물질의 유무 및 독성정도를 아주 정밀하게 측정할 수 있는 장점이 있다(1, 7, 18). 따라서 본 실험에서 만들어진 대장균의 발광 체계가 중금속 물질에 대한 생물발광 반응성을 나타내는 지를 일차적으로 조사하였다.
생물 발광은 높은 민감도, 짧은 분석시간, 다양한 시험 체계를 갖출 수 있음으로써 생물 발광은 세포 생존도의 표지 역할을 할 수 있으며 세균의 biomass 결정에 매우 적합한 조건을 지닌다. 따라서 본 연구에서는 발광 세균의 lux 유전자를 추출하여 대장균에서 발현시켜 빛이 나오는 정도를 비교 분석함으로써 미생물 계수 측정 시스템 및 중금속 등을 검출할 수 있는 바이오센서로 활용될 수 있을 지를 탐색하였다.
제안 방법
발광 세기는 상대적 빛의 세기 RLU (Relative Light Units)로 10초당 1 ml의 시료에서 발생하는 빛의 양을 mV로 나타냈다. V. harveyi의 융합된 luxAB 유전자만이 삽입된 재조합플라스미드가 형질전환 된 대장균의 발광세기는 발광 반응의 기질인 decanal 0.05%를 가하여 측정하였다.
중금속에 대한 생물발광의 변화를 측정하기 위하여 PlXba. pT7-3 재조합 플라스미드를 포함하는 발광 대장균에 HgCl2, CdCl2, MnSO4, ZnSO4 첨가시의 생물 발광의 변화 양상을 조사하였다. 이들 중금속 용액을 세포에 10분간 노출시킨 후 생물발광 세기를 조사하여 상대적 발광 정도(Relative Luminescence Unit)로 최대치를 100%로 보정하여 나타냈다.
또한 발광 세포의 저장성을 증대시키고 생물발광의 안정성과 세포를 고정화시킬 수 있는 지를 시험하기 위하여 빛을 내는 대장균의 고정화를 시험하였다. 고정화 물질로는 고정화가 비교적 간단하고 발광 메카니즘에 영향을 미치지 않을 뿐만 아니라 빛의 투과성이 용이한(7) sodium alginate를 사용하여 세포의 고정화를 시도하였다. PlXba.
또한 발광 세포의 저장성을 증대시키고 생물발광의 안정성과 세포를 고정화시킬 수 있는 지를 시험하기 위하여 빛을 내는 대장균의 고정화를 시험하였다. 고정화 물질로는 고정화가 비교적 간단하고 발광 메카니즘에 영향을 미치지 않을 뿐만 아니라 빛의 투과성이 용이한(7) sodium alginate를 사용하여 세포의 고정화를 시도하였다.
5). 또한 세균의 수와 발광광도와의 상관관계를 알아보기 위해 LB 배양접시에 도말된 대장균 콜로니를 모아 luminometer로써 발광 세기를 측정하였다. Fig.
harveyi 유전자가 삽입된 재조합플라스미드가 형질 전환된 대장균 세포들은 30℃에서 100 µg/ml의 ampicillin을 넣은 Luria-Bertani (LB) 배양액에서 배양시켰다. 모든 발광은 상온에서 0.1초의 측정시간으로 Luminometer (Berthold사 제품 Lumat-LB9507, Germany)를 써서 측정하였다. 발광 세기는 상대적 빛의 세기 RLU (Relative Light Units)로 10초당 1 ml의 시료에서 발생하는 빛의 양을 mV로 나타냈다.
발광 표지형 대장균을 접종한 후 OD660 0.8 농도의 세포를 2.5% (w/v) 식염수에 100배로 희석한 후 sodium alginate와 1:10의 비율로 혼합한 후 2.4% (w/v) sodium alginate에 가하여 고정화된 반투명한 gel이 형성되도록 20분간 상온에 두었다.
들은 Sigma 사(USA)로부터 구입하였으며 원액 용액을 만들어 사용직전에 적절한 농도로 희석 하여 사용하였다. 발광표지형 대장균(E. coli 43R)에 대한 반응성은 OD660값 2.5 부근인 대장균 세포 1 ml에 적시한 농도의 중금속이온을 가하여 발광세기를 측정하였다.
빛을 내는 luciferase 유전자를 여러 생물체와 재조합 플라스미드의 한 프로모터 조절하에 좀 더 간편하게 발현하는 체계를 구축하기 위하여 V. harveyi의 2개의 subunits (αβ)으로 구성된 luciferase 유전자를 하나의 폴리펩타이드로 만들기 위해 융합시킨(3) 유전자가 삽입된 재조합플라스미드를 이용하여 발현 정도를 시험하였다.
pT7-3 재조합 플라스미드를 포함하는 발광 대장균에 HgCl2, CdCl2, MnSO4, ZnSO4 첨가시의 생물 발광의 변화 양상을 조사하였다. 이들 중금속 용액을 세포에 10분간 노출시킨 후 생물발광 세기를 조사하여 상대적 발광 정도(Relative Luminescence Unit)로 최대치를 100%로 보정하여 나타냈다. Fig.
대상 데이터
HgCl2, CdCl2, MnSO4, ZnSO4들은 Sigma 사(USA)로부터 구입하였으며 원액 용액을 만들어 사용직전에 적절한 농도로 희석 하여 사용하였다. 발광표지형 대장균(E.
2). 발광 세균 P. leiognathi 와 P. phosphoreum luxG 유전자의 하류 영역에서 고초균(Bacillus subtilis)의 riboflavin 합성에 관여하는 유전자들과 상동성이 있는 유전자들이 본 저자의 연구에 의하여 발견되었다(11, 12)(Fig. 2).
본 연구에 쓰인 주요한 대장균 균주들은 E. coli XL-1, E. coli M15, E. coli 43R 등이며 플라스미드로는 pT7-3와 pT7-5 등이다. 대장균 43R (E.
성능/효과
본 연구에서는 1) 발광 세균 Photobacterium과 Vibrio의 lux 유전자를 추출하여 발광 유전자의 발현이 잘되는 대장균을 탐색하였으며, 형질 전환된 발광표현형 대장균의 콜로니수와 발광 광도 간에 비례 관계가 있음을 관찰하였으며, 2) 이들 세포가 수질오염에서 가장 문제가 되는 수은, 카드뮴등의 주요한 중금속에 노출되었을 때 예민하게 그 발광정도가 감소됨을 보였고, 3) 이들 세포가 고정화되었을 때에도 육안으로 볼 수 있는 정도의 빛을 냄으로써 이들 세포의 안정성과 보존성을 기할 수 있음을 보였다. 발광 세균의 정밀 바이오 분석 시스템 기술 기반 구축을 위해서는 lux 유전자와 발현 시스템 및 고정화를 할 수 있는지를 탐색 하는 것이 선결 조건인데, 위의 실험 결과들은 lux 유전자를 이용한 바이오시스템의 기반 기술을 제공할 수 있을 것이다.
또한 세균의 수와 발광광도와의 상관관계를 알아보기 위해 LB 배양접시에 도말된 대장균 콜로니를 모아 luminometer로써 발광 세기를 측정하였다. Fig. 6에서 보는 바와 같이 대장균의 콜로니 수와 발광 세기와는 비례관계를 보임을 확인할 수 있었으며 이는 세균의 계수 측정에 발광세균의 lux 유전자가 유용하게 활용될 가능성을 보여 주고 있다.
이들 중금속 용액을 세포에 10분간 노출시킨 후 생물발광 세기를 조사하여 상대적 발광 정도(Relative Luminescence Unit)로 최대치를 100%로 보정하여 나타냈다. Fig. 8에서 보는 바와 같이 중금속 물질의 농도가 높을수록 대장균의 발광세기의 감소율이 증가하였으며, 감소되는 정도는 Cd와 Zn 이온을 첨가 하였을 때 감소율이 큰 편이었으며 Hg와 Mn 이온 순이었다. 이는 CdCl2와 HgCl2의 독성도가 높고 MnSO4의 독성도가 낮음을 시사해주는 결과라 할 수 있다.
고정화 물질로는 고정화가 비교적 간단하고 발광 메카니즘에 영향을 미치지 않을 뿐만 아니라 빛의 투과성이 용이한(7) sodium alginate를 사용하여 세포의 고정화를 시도하였다. PlXba.pT7-3 재조합 플라스미드가 형질전환된 대장균 접종균을 이용하여 12시간 배양한 후 다음날 LB 배양액에 희석시킨 후 배양하여 OD660 0.7~0.9 농도의 세포를 2.5% (w/v) 식염수에 102배로 희석한 후 2.4%(w/v) sodium alginate 에 가하여 고정화 발광세포를 만들었으며, Fig. 9에서 보는 바와같이 고정화된 세포에서도 암실에서 육안으로도 충분히 볼 수 있는 양의 발광이 이루어짐을 관찰할 수 있었다.
발광 세균의 luciferase는 다른 크기를 갖는 2개의 subunits (αβ)으로 이루어져 있으며, α subunit (40 kDa)은 효소 반응속도 특성을 결정하는 것으로 알려져 있으며 β subunit (36 kDa)은 효소와 환원된 flavin과의 상호작용에 영향을 미치는 flavin 기질 특이성에 관여한다고 알려져 있다(6, 15). 또한 두 폴리펩타이드는 약 30%의 아미노산 상동성을 갖고 있는 것으로 보아 두 유전자가 gene duplication에 의하여 생성되었을 것으로 추리되며 약 30개 아미노산 잔기의 삽입 혹은 삭제의 결과 두 단백질 사이에 4 kDa의 분자량의 차이가 나게 된다. 빛을 내는 luciferase 유전자를 여러 생물체와 재조합 플라스미드의 한 프로모터 조절하에 좀 더 간편하게 발현하는 체계를 구축하기 위하여 V.
이 재조합 플라스미드를 비발광성인 대장균(E. coli)의 여러 균주에 형질 전환 시킨 결과, E. coli 43R에서는 그 발현량이 매우 커서 다른 균주에서 보다 1,000~10,000배 정도 수준으로서 이는 원래의 해양 발광 세균과 같은 정도의 발광 세기를 나타냈다(Fig. 4A). 이는 현재까지 알려진 대장균 등을 포함한 비발광성 생물체에서 발현된 발광 정도에서 최고의 수준으로 추정되며, 단일 콜로니에서 내는 빛을 육안으로도 관찰 할 수 있었다(Fig.
후속연구
이는 CdCl2와 HgCl2의 독성도가 높고 MnSO4의 독성도가 낮음을 시사해주는 결과라 할 수 있다. 또한 이들 실험은 빛을 내는 발광 대장균이 중금속 모니터링 시스템 개발의 기반 기술로써 활용될 수 있음을 나타내 주고 있다.
본 연구에서는 1) 발광 세균 Photobacterium과 Vibrio의 lux 유전자를 추출하여 발광 유전자의 발현이 잘되는 대장균을 탐색하였으며, 형질 전환된 발광표현형 대장균의 콜로니수와 발광 광도 간에 비례 관계가 있음을 관찰하였으며, 2) 이들 세포가 수질오염에서 가장 문제가 되는 수은, 카드뮴등의 주요한 중금속에 노출되었을 때 예민하게 그 발광정도가 감소됨을 보였고, 3) 이들 세포가 고정화되었을 때에도 육안으로 볼 수 있는 정도의 빛을 냄으로써 이들 세포의 안정성과 보존성을 기할 수 있음을 보였다. 발광 세균의 정밀 바이오 분석 시스템 기술 기반 구축을 위해서는 lux 유전자와 발현 시스템 및 고정화를 할 수 있는지를 탐색 하는 것이 선결 조건인데, 위의 실험 결과들은 lux 유전자를 이용한 바이오시스템의 기반 기술을 제공할 수 있을 것이다.
7). 하나로 융합된 V. harveyi luciferase 유전자는 여러 환경 및 스트레스에 관여하는 유전자의 프로모터 하부에 삽입시킴으로써 보고 유전자(reporter gene)로 활용될 수 있는 의의를 지니며, 또한 짧아진 단일 유전자는 두 개의 유전자로 이루어진 재조합플라스미드에 비해 훨씬 발현이 많을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
생물발광이란 무엇인가?
생물발광(bioluminescence)은 특정 환경에서 외부의 빛 에너지 공급 없이 독자적으로 빛을 내는 것을 일컬으며 어떤 유기화합물이 효소의 작용으로 산화되면서 그때 방출되는 에너지가 빛에너지로 체외로 나오는 현상으로 일종의 광화학 반응이다(5, 8). 세균이나 균류에서는 발광기관이 없고 세포 속에 있는 발광물질을 산화하여 빛을 내지만, 어류 등의 발광생물은 대개 특수하게 분화된 발광기관을 갖고 있다(5, 8).
생체발광 영상으로 관찰하고자 하는 대상은 무엇으로 표지되어야 하는가?
생체발광(in vivo bioluminescence)영상으로 관찰하고자 하는 생물학적 대상물(박테리아, 종양세포, 면역세포, 유전자 등)은 빛을 발생하는 효소(luciferase)(1, 13, 14) 혹은 형광단백질을 코딩하는 보고유전자(reporter gene)로 표지 되어야 한다(4, 6, 19). 일련의 luciferase들은 해저 갑각류, 어류, 세균, 곤충 등에 존재하는데 이 효소가 효소 특이 기질을 산소, ATP 등의 존재 하에 산화시킴으로써 빛을 생성하게 된다(5, 8).
세균이나 균류와 어류 등의 생물발광은 어떻게 이루어지는가?
생물발광(bioluminescence)은 특정 환경에서 외부의 빛 에너지 공급 없이 독자적으로 빛을 내는 것을 일컬으며 어떤 유기화합물이 효소의 작용으로 산화되면서 그때 방출되는 에너지가 빛에너지로 체외로 나오는 현상으로 일종의 광화학 반응이다(5, 8). 세균이나 균류에서는 발광기관이 없고 세포 속에 있는 발광물질을 산화하여 빛을 내지만, 어류 등의 발광생물은 대개 특수하게 분화된 발광기관을 갖고 있다(5, 8).
참고문헌 (20)
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Lee, C.Y. and E.A. Meighen. 1992. The lux genes in Photobacterium leiognathi are closely linked with genes corresponding in sequence to riboflavin synthesis genes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 186, 690-997
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