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문제 정의
- 주로 중부 이남에 분포하는데 오래전부터 고혈압과 간 해독, 비만증 치료와 신장, 방광에 효험이 있는 식물로 알려져μ1] 왔으나 아직까지 해홍나물에 관한 연구가 미흡한 상태이다. 본 연구에서는 약용 작물로서 해흥나물에 보존 활용가치가 높다고 생각되어 해홍나물을 물과 메탄올 추출물을 가지고 식품 유해 미생물에 대하여 항균 활성을 검색하여 천연 항균제로서의 사용 가능성을 비교 분석하고자 한다.
제안 방법
- pmihaemolyticus를 대상으로 추출물 처리 농도에 따른 생육곡선을 측정 비교하였다. B. cer- s와 V. parahaemolyticus 섕육곡선 측정은 각각의 액체 배지 10 ml에 시험균을 18시간 배양 한 후 세균 배양액을 650 nm 에서 QD 값 "(I" CFU/mi)로 조절한 후 다시 배 희석하여 96 well plate (SPL, Korea)에 무균적으로 100 μ1 분주하고, 뿌리 추출물을 well plate (SPL. KOREA)에 0z 0.5, 1.0, 1.5Z 2.0 mg/mU에 농도로 첨가하고 각각 30℃와 37℃에서 24 시간 배양하면서 4시간 마다 세균의 증식 정도를 microplatereader (Bio-Tek Instruments Incv USA)를 통해 650 nm에서측정하였다.
- 측정하였다. 각 균주는 10 ml의 액체배지에서 18시간 정도 배양하여 세균 배양액을 650 nm에서 Optical Density (O.D) 값 0.4(106 CFU/ml)가 되게 조절한 후 멸균된 면봉을 사용하여 Muller Hinton agar (Difco, USA)에 회 전하면서 배지 전면에 균액을 골고루 도말하였다. 항균측정용 시료액은 0 05 1, 2, 3, 5 mg/ml로 희석하여 멸균된 8 mm paper disc (ADVANTEQ Japan) 에 50 μ1 를 흡수 건조시켜시험용 평판배지위에 놓아 밀착시켜서 각 시험균의 최적 배양온도에서 24시간 배양 후 disc 주변에 생성된 생육저해환 (clear zonex mm)을 측정하여 물 주줄물과 메탄올 주줄물의항균활성을 비교 분석하였다.
- 미생물의 최소저해농도(MIC)는 broth microdilution 방법[2]을 응용하여 다음과 같이 측정하였다. 각각의 시험균을 18 시간 배 양한 후 세균 배양액을 650 nm에서 Optical Density (O.D) 값CFU/ml)가 되게 조절한 후 96 well plate (SPL, Korea)에 각 시험균 배양액을 100 μm씩 분주하고, 각시료를 0, 0.10, 0.25, 0.50, 1.00, 1.50, 2.00 mg/ml 농도로 100μ1씩 처 리하여 24시간 배 양한 후 해홍나물 물 추출물과 메탄올 추출물이 세균의 증식에 미치는 영향은 microplate reader (Bio-Tek Instruments Inc.z USA)를 통해 650 nm에서 측정하여 비교 분석하였다.
- 또한 해홍나물 부위별 추출물 중 가장 생육저해율이 높은뿌리 물 추출물과 메탄올 추출물을 가지고 그람 양성균인 B. s와 그람 음성균인 V.fims에 대하여0.5, 1.0, 1.5, 2.0 mg/ml에 농도로 추출물을 처 리하여 4시간 마다24시간 동안 균주의 성장 속도를 측정 비교 분석하여 보았다. B.
- 생육저해율(%) 확인은 다음 식으로 확인하였다. 미생물의 생육저해율은 균의 정지기인 24시간에서 그 값을 측정 하였다.
- 미생물의 최소저해농도(MIC)는 broth microdilution 방법[2]을 응용하여 다음과 같이 측정하였다. 각각의 시험균을 18 시간 배 양한 후 세균 배양액을 650 nm에서 Optical Density (O.
- 5일 이상 건조하여 수분을 충분히 제거하였다. 음건된 식물체는 각 부위별로 마쇄기를 이용하여 마쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.
- 4(106 CFU/ml)가 되게 조절한 후 멸균된 면봉을 사용하여 Muller Hinton agar (Difco, USA)에 회 전하면서 배지 전면에 균액을 골고루 도말하였다. 항균측정용 시료액은 0 05 1, 2, 3, 5 mg/ml로 희석하여 멸균된 8 mm paper disc (ADVANTEQ Japan) 에 50 μ1 를 흡수 건조시켜시험용 평판배지위에 놓아 밀착시켜서 각 시험균의 최적 배양온도에서 24시간 배양 후 disc 주변에 생성된 생육저해환 (clear zonex mm)을 측정하여 물 주줄물과 메탄올 주줄물의항균활성을 비교 분석하였다.
- 해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물 중 가장 항균 활성이 높게 나타난 뿌리 추출물을 가지고 그람 양성균인 B. #와 그람 음성균인 V. pmihaemolyticus를 대상으로 추출물 처리 농도에 따른 생육곡선을 측정 비교하였다. B.
- 해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물에 대한 미생물의 생육저해율 측정은 각각의 액체 배지 10 ml에 시험 균을 18시간 배양 한 훅 세균 배양액을 650 nm에서 QD 값0.4(106 CFU/ml)가 되게 조절한 후 96 well plate (SPL, Korea)ofl 분주하고, 각각의 시료를 2 mg/ml 농도로 처리하여 24시간 배양한 후 세균의 증식 저해 정도는 microplatereader (Bio-Tek Instruments Inc.z USA)를 통해 650 nm에서측정하였다. 생육저해율(%) 확인은 다음 식으로 확인하였다.
- 해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물의 농도를 2 mg/ml로 하여 각 시험균의 액체배지에 첨가한 후 미생물에 대한 생육 저해율을 측정하였다(Fig. 1). Paper disc법에 의한 항균력 측정이나 MIC 측정에서도 나타났듯이 해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물 중 뿌리에서 추출한 시료에서 미생물에 대한 생육 저해율이 높게 나타났으며 생육 저해율은 각 균주마다 차이를 나타냈지만 평균적으로 물 추출물은 45% 메탄올 추출물은 51%에 생육저해효과를 나타내었다.
- 해홍나물 추출물의 미생물에 대한 최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정 은 해홍나물 부위별 추출물 중 항균활성이 가장 높게 나타난 뿌리의 추출물을 가지 고물 추출물과 메탄올 추출물의 MIC를 측정 비교하였다(Table 4). 해홍나물 뿌리 추출물에 대한 최소저해농도는 물 추출물인경우 그람 음성균에서는 A hydrophila 그리고 그람 양성균에서는 S.
- 해홍나물의 부위별 메탄올 추출물은 시료 10 g에 메탄올 300 ml로 24시간 동안 상온에서 교반 침출 시킨 후 1차 추출한 후 Whatman No. 2 여 과지를 사용하여 1차 여과과정을 거 친 후 pore size 0.45 gm syringe용 멸균 필터를 사용하여 무균적으로 추출액을 조제하였다. 위 과정을 3회 반복하여 얻어진 시료는 40℃ 수욕 상에서 감압 농축하여 얻은 물질을 4℃에 보관하면서 필요한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.
- 해흥나물의 부위별 항균 효과를 알아보기 위한 추출물 조제는 각각 부위별로 증류수 300 ml 당 10 g의 식물시료를 혼합하여 100℃ 수욕 상에서 약 30분간 중탕한 다음 Whatman No.2 여과지를 사용하여 1차 여과과정을 거친 후 pore size 0.45 gm syringe용 멸균 필터를 사용하여 무균적으로 식물열수 추출액을 조제하였다. 위 과정을 3회 반복하여 얻어진 시료는 40℃ 수욕 상에서 감압 농축하여 얻은 물질을 4℃에 보관하면서 필요한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 본 실험의 공시 재료인 해홍나물은 2006년 5월에서 8월까지 제주도 해안가에서 채집하여 뿌리, 줄기, 열매로 나누어 실험에 이용하였다. 식물분류는 한국식물도감[1 이과 제주식물도감 인터넷 사이트(http://www.
- 본 연구에 사용된 균주는 Table 1에 나타낸 바와 같이 한국미생물보존센터 (Korean Culture Center of Microorganism, KCCM), 한국생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC) 그리고 American Type Culture Collection(ATCC)에서 그람 양성균 5종과 그람 음성균 7종으로 총 12종을 분양받아 사용하였다. 사용 배지는 Tryptic soybean agar(TSA)/ Tryptic soybean broth (TSB)Z Brain heart infusion agar (BHIA), Brain heart infusion broth (BHIB), Marine agar (MA), Marine broth (MB), Nutrient agar (NA), Nutrient broth (NB) Difco (USA)사의 제품을 사용하여 stab culture하여 4℃에서 보관하면서 3주마다 계대하여 실험에 사용하였다.
- 분양받아 사용하였다. 사용 배지는 Tryptic soybean agar(TSA)/ Tryptic soybean broth (TSB)Z Brain heart infusion agar (BHIA), Brain heart infusion broth (BHIB), Marine agar (MA), Marine broth (MB), Nutrient agar (NA), Nutrient broth (NB) Difco (USA)사의 제품을 사용하여 stab culture하여 4℃에서 보관하면서 3주마다 계대하여 실험에 사용하였다.
- 나누어 실험에 이용하였다. 식물분류는 한국식물도감[1 이과 제주식물도감 인터넷 사이트(http://www.nfo.kr)를참고하였다.
이론/모형
- 추출물에 대한 항균활성 측정은 Murry [17] 등의 방법을 응용하여 측정하였다. 각 균주는 10 ml의 액체배지에서 18시간 정도 배양하여 세균 배양액을 650 nm에서 Optical Density (O.
성능/효과
- 0 mg/ml에 농도로 추출물을 처 리하여 4시간 마다24시간 동안 균주의 성장 속도를 측정 비교 분석하여 보았다. B.s에 추출물을 첨가하지 않은 대조구에서는 배양 4시간 이후부터 급격한 증가를 보여 빠른 성장이 일어남을 관찰할 수가 있었으나 물 추출물을 첨가한 실험구에서는 8시간 때부터 1 mg/ml와 1.5 mg/ml 농도에서 균의 증식 이 완만하게 일어나 24시간 동안 억제됨을 확인할 수가 있었다. 메탄올 추출물은 첨가한 실험구에서는 0.
- 1). Paper disc법에 의한 항균력 측정이나 MIC 측정에서도 나타났듯이 해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물 중 뿌리에서 추출한 시료에서 미생물에 대한 생육 저해율이 높게 나타났으며 생육 저해율은 각 균주마다 차이를 나타냈지만 평균적으로 물 추출물은 45% 메탄올 추출물은 51%에 생육저해효과를 나타내었다. 줄기 부위에서는 물 추출물 37% 메탄올 추출물 42%, 열매 부위에서는 물 추출물에서는 36%, 메탄올 추출물은 41% 에 생육저해효과를 나타내었다.
- μg haemolyticus (55%)에 대해서 높은 저해율을 나타내었다. 메탄올 추출물에서는 그람 양성균 B. subtilis (62%), B. cereus(61%)에 대해 강한 활성을 나타냈었고 그람 음성균에서는 V. parahaemolyticus (62%)에 대해 가장 높은 활성을 나타냈다.
- 5 mg/ml 농도에서 균의 증식 이 완만하게 일어나 24시간 동안 억제됨을 확인할 수가 있었다. 메탄올 추출물은 첨가한 실험구에서는 0.5 mg/ml 농도에서부터 균의 증식이 완만하게 일어나 24시간 동안 억제됨을 확인할 수가 있었다(Fig. 2). V.
- 해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물에 항균활성을 보았을 때 뿌리, 줄기, 열매 순으로 항균활성을 나타내었는데 그람 음성균 7종에 대한 해홍나물 추출물의 항균활성을 보면 물 추출물이나 메탄올 추출물 모두 뿌리 추출물에서 강한 항균활성을 나타내었다. 물 추출물인 경우 V. alginolyticus, V. parahaemolyticus, A. hydrophila, P. aeruginosa 순으로 메탄올 추출물 또한 물 추출물과 같은 V. algi-nolyticus, V. parahaemolyticus, A hydrophila, P. aeruginosa 순으로 항균활성을 나타내었고 그람 양성균 5종에 대한 해흥나물 추출물의 항균활성 또한 그람 음성균에서와 마찬가지로 줄기나 열매보다는 뿌리 추출물에서 높은 항균활성을 나타내었는데 물 추출물인 경우 B, subtilis, B. cereus, S. aureus 순으로 메탄올 추출물은 B. cereus, S. aureus, B. subtilis 순으로 강한 항균활성을 나타내었고 추출물 처리농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 저해환 크기가 비례적으로 증가하는 것을 알 수가 있는데 이는 추출물의 항균활성은 추출물의 농도에 의존적으로 증가한다는 것을 시사한다, 또한 메탄올 추출물 같은 경우는 줄기와 열매 추출물에서도 뿌리 물 추출물과 유사하거나 좀 더 강한 항균활성을 나타내고 있다. 메탄올 추출물에서 물 주출물보다 강한 항균활성을 나타내는 것은 해흥나물의 주 항균성 물질이 물 보다는 메탄올에 더 잘 녹는 물질로 추정 된다' 해홍나물 메탄올 추출물이나 물 추출물을 paper disc방법에 의한 항균활성 측정에서 줄기나 열매 추출물과 비교 하였을 때 뿌리 추출물에서는 0.
- 뿌리 부위 물 추출물에서는 그람 양성균 B. cereus (56%) 에가장 높은 저해율을 나타냈으며 그람 음성균에서는 V. μg haemolyticus (55%)에 대해서 높은 저해율을 나타내었다. 메탄올 추출물에서는 그람 양성균 B.
- parahaemolyticus 같은 경우도B. 에서와 같이 농도가 증가할수록 균의 증식 이 완만하게 일어나 물 추출물을 첨가한 실험구에서는 12시간 때부터1 mg/ml와 1.5 mg/ml 농도에서 균의 증식이 완만하게 일어나 24시간 동안 억제됨을 확인할 수가 있었고 메탄올 추출물은 첨가한 실험구에서는 0.5 mg/ml 농도에서부터 균의 증식이 완만하게 일어나 24시간 동안 억제됨을 확인할 수가있었다(Fig. 3).
- 5-1 mg/ml 농도에서 부터 생육 저지환이 뚜렷이 나타났다. 위에 나타난 결과로 보았을 때는 해홍나물에서는 뿌리에서 메탄올로 항균성 물질을 추출하는 것이 효과적일 것으로 생각된다.
- 10 mg/ml 농도가 최소저해농도로 나타났다. 전체적으로 미생물의 MIC 결과를 분석해 보면 해홍나물 뿌리 추출물이 그람 양성균에서 그람 음성균보다 높은 항균활성을 나타냈다. 이는 항균활성이 그람음성 균인 E.
- Paper disc법에 의한 항균력 측정이나 MIC 측정에서도 나타났듯이 해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물 중 뿌리에서 추출한 시료에서 미생물에 대한 생육 저해율이 높게 나타났으며 생육 저해율은 각 균주마다 차이를 나타냈지만 평균적으로 물 추출물은 45% 메탄올 추출물은 51%에 생육저해효과를 나타내었다. 줄기 부위에서는 물 추출물 37% 메탄올 추출물 42%, 열매 부위에서는 물 추출물에서는 36%, 메탄올 추출물은 41% 에 생육저해효과를 나타내었다.
- 해홍나물 열수 추출물이나 메탄올 추출물의 항균활성은 전반적으로 항균 disc에 흡수시 킨 추출물의 농도가 증가할수록 항균 활성은 크게 나타났다. 해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물에 항균활성을 보았을 때 뿌리, 줄기, 열매 순으로 항균활성을 나타내었는데 그람 음성균 7종에 대한 해홍나물 추출물의 항균활성을 보면 물 추출물이나 메탄올 추출물 모두 뿌리 추출물에서 강한 항균활성을 나타내었다. 물 추출물인 경우 V.
- 해홍나물 뿌리 추출물에 대한 최소저해농도는 물 추출물인경우 그람 음성균에서는 A hydrophila 그리고 그람 양성균에서는 S. aureus, B. cereus, B. wbt에서 0.50 mg/ml 농도에서 생육을 저해 했으며 나머지 균에 대해서는 1.00 mg/ml, 메탄올 추출물은 그람 양성균에서는 B. cereus, B. subtilis 그람 음성균에서는 A. hydrophilaee 0.10 mg/ml 농도가 최소저해농도로 나타났다. 전체적으로 미생물의 MIC 결과를 분석해 보면 해홍나물 뿌리 추출물이 그람 양성균에서 그람 음성균보다 높은 항균활성을 나타냈다.
- 해홍나물 열수 추출물이나 메탄올 추출물의 항균활성은 전반적으로 항균 disc에 흡수시 킨 추출물의 농도가 증가할수록 항균 활성은 크게 나타났다. 해홍나물 부위별 물 추출물과 메탄올 추출물에 항균활성을 보았을 때 뿌리, 줄기, 열매 순으로 항균활성을 나타내었는데 그람 음성균 7종에 대한 해홍나물 추출물의 항균활성을 보면 물 추출물이나 메탄올 추출물 모두 뿌리 추출물에서 강한 항균활성을 나타내었다.
후속연구
- [18], 생활수준의 향상함으로서 건강 지향적으로 소비자의 욕구가 변화하고 있어서 식품을 보다 안전하게 공급할 수 있는 방안이 필요하게 되었다. 그 중에서도 가장 바람직한 것은 인체에 무해할 뿐만 아니라 영양성분이 함유되어 있어서 식품 보존료 역할과 더불어 인체 생리활성 증강 작용을 할 수 있는 천연 항균물질을 개발하는 것일 것이다. 천연 항균물질에는 예전부터 사용해 온 소금, 식초 등 일반식품 소재 외에도 동물, 식물, 미생물 등에서 유래한 것들이 많다[4, 10] 최근 자생식물이 가진 다양한 생리활성 중 항균효능에 관한 연구는 식품 의약품, 화장품, 축산업, 양식업 등 관련 분야에서 관심이높아져 가고 있다[1, 15, 16, 22].
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