개비자나무의 유효성분으로 알려진 homoharringtonine의 암세포주 K562에 대한 세포증식 저해 활성을 분석하였고, 마우스를 이용한 만성독성시험을 수행하였다. 총 약물처리 시간에 따른 최적 투여조건 결정 실험에서는 HHT를 9일, 6일, 3일 동안 매일 처리할 경우 각각 0.27, 0.37, 1.10mM의 농도에서 K562세포의 성장을 50% 감소시킴을 확인하였다. 기존 백혈병 치료제로 사용되고 있는 adriamycin과의 비교실험 결과 HHT는 K562 세포주에 대하여 adriamycin보다 낮은 저해율을 나타냈으나 비교적 근사한 값을 가졌다. HHT의 만성독성 실험 결과 혈액학적 지표 측정 실험에서 적혈구수(RBC)는 대조군과 HHT 투여군 사이에 유의적인 차이가 없었고, 간 기능 관련 효소의 혈액을 분석한 결과, 간 손상과 관련된 효소glutamate-oxalate-transferase, glutamate-pyruvate- transferase, cholesterol 및 alkaline phosphatase 모두 정상 범위에 있었다. 그러나 간 조직학적 검사에서는 HHT를 투여한 마우스의 간 조직에서 밴드형의 호중구를 침착시키는 것이 확인되었다.
개비자나무의 유효성분으로 알려진 homoharringtonine의 암세포주 K562에 대한 세포증식 저해 활성을 분석하였고, 마우스를 이용한 만성독성시험을 수행하였다. 총 약물처리 시간에 따른 최적 투여조건 결정 실험에서는 HHT를 9일, 6일, 3일 동안 매일 처리할 경우 각각 0.27, 0.37, 1.10mM의 농도에서 K562세포의 성장을 50% 감소시킴을 확인하였다. 기존 백혈병 치료제로 사용되고 있는 adriamycin과의 비교실험 결과 HHT는 K562 세포주에 대하여 adriamycin보다 낮은 저해율을 나타냈으나 비교적 근사한 값을 가졌다. HHT의 만성독성 실험 결과 혈액학적 지표 측정 실험에서 적혈구수(RBC)는 대조군과 HHT 투여군 사이에 유의적인 차이가 없었고, 간 기능 관련 효소의 혈액을 분석한 결과, 간 손상과 관련된 효소glutamate-oxalate-transferase, glutamate-pyruvate- transferase, cholesterol 및 alkaline phosphatase 모두 정상 범위에 있었다. 그러나 간 조직학적 검사에서는 HHT를 투여한 마우스의 간 조직에서 밴드형의 호중구를 침착시키는 것이 확인되었다.
Cell proliferation inhibitory effects of homoharringtonine (HHT), an active drug substance in Cephalotaxus koreana, against blood cancer cell line K562 were evaluated. In addition, in vivo chronic toxicity test with mouse was carried out. When K562 cell line was treated everyday for 9, 6, 3 days,
Cell proliferation inhibitory effects of homoharringtonine (HHT), an active drug substance in Cephalotaxus koreana, against blood cancer cell line K562 were evaluated. In addition, in vivo chronic toxicity test with mouse was carried out. When K562 cell line was treated everyday for 9, 6, 3 days, $IC_{50}$ values of HHT were determined as 0.27, 0.37, and 1.10 mM respectively. The anticancer activity of HHT was comparable to adriamycin, a known anticancer drug compound for blood cancer treatment. in vivo chronic toxicity test of the HHT, the number of red blood cell (RBC) showed no significant difference. From the analysis of the liver-functional enzymes in blood, all of liver damage related enzymes such as glutamate-oxalate-transferase (GOT), glutamate-pyruvate-transferase (GPT), cholesterol (Chol) and alkaline phosphatase (ALP) showed no significant change. However, from the histologic test, a neutrophil of the band type in liver tissue was observed.
Cell proliferation inhibitory effects of homoharringtonine (HHT), an active drug substance in Cephalotaxus koreana, against blood cancer cell line K562 were evaluated. In addition, in vivo chronic toxicity test with mouse was carried out. When K562 cell line was treated everyday for 9, 6, 3 days, $IC_{50}$ values of HHT were determined as 0.27, 0.37, and 1.10 mM respectively. The anticancer activity of HHT was comparable to adriamycin, a known anticancer drug compound for blood cancer treatment. in vivo chronic toxicity test of the HHT, the number of red blood cell (RBC) showed no significant difference. From the analysis of the liver-functional enzymes in blood, all of liver damage related enzymes such as glutamate-oxalate-transferase (GOT), glutamate-pyruvate-transferase (GPT), cholesterol (Chol) and alkaline phosphatase (ALP) showed no significant change. However, from the histologic test, a neutrophil of the band type in liver tissue was observed.
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문제 정의
본 연구에서는 개비자나무의 유효성분으로 알려진 HHT의 항암 활성 및 독성을 조사하기 위하여 HHT의 처리 시간에 따른 최적 투여조건을 결정하였고, 기존 항암제와 비교검토 하였다. 또한 마우스를 실험동물로 하여 HHT를 투여한 후 간에 대한 조직학적 관찰과, 간 기능 관련 효소분석을 통해 HHT의 만성 독성을 검토하였다.
제안 방법
기존 항임제와 homoharringtoninee] 비교실험. HHT을 항암제로 개발하기 위해 자궁경부암과 난소암, 백혈병 등의 항암치료제로 널리 사용되는 adriamyc 비교실험을 하였다. 대조군인 adriamyciire Streptomyces peucetiuse 의해 생합성되는 안토시안계 Type II polyketide 화합물로서, DNA topoisomerase II의 작용을 저해하여 DNA double strand를 파괴하는 기작을 통해 항암제로서의 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 1이 백혈병과 임파종, 육종 등 다양한 악성 종양 세포를 효과적으로 살상하는 효능이 보고된 바 있다.
만성독성 실험에 사용할 8주령의 수컷 SPFICR 마우스와 6주령 수컷 nude mice를 The Jackson Lab(Bar Harbor, MA, USA)으로부터 구입하여 사용하였다. SPF ICR 생쥐 20마리를 주 1회 90일간에 걸쳐 L* 량 HHT(1.34mg/m/) 을 미정맥에 투여 하고, 동수의 대조군에는 동량의 식염수를 투여하였다.
지표에 미치는 영향을 조사하였다. 각각의 생쥐를 마취한 다음 혈액을 3차에 걸쳐 채취하였다. 슬라이드에 스프레드한 다음 May-Griinwald-Giemsa 방법으로 염색을 한 다음 각각의 혈액 세포를 측정하였다.
간 기능 관련효소의 혈액분석을 위하여 HHT를 주 1회 90일간 투여하고 5일 경과 후 heparine이 처리된 capillary tube를 이용하여 각 실험군 마우스의 후안와정맥총(retHAorbital sinus) 으로부터 혈액을 채취하였다. 채취된 혈액을 즉시 5,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층부의 혈장을 분리하여 혈액화학분석기 (CIBA Coming 550 Express, USA)를 이용하여 간 기능과 관련된 효소인 glutamate-oxalate-transferase(GOT)5 glutamate- pyruvate-transferase(GPT), cholesterol(Chol) 및 alkaline phosphatase(ALP)를 혈액자동분석기 (Hithachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 실험군간의 차이를 분석하였다.
간의 조직학적 검사에서는 HHT를 주 1회 90일간 투여하고 5일 경과 후 마우스를 희생시켜 곧바로 복강을 절개하여 육안적으로 간 표면의 특이소견 유무를 확인한 다음, 10% 중성 포르말린에 넣어 24시간 이상 고정하였다. 고정시킨 후 각 조직들을 흐르는 물로 충분히 수세하고 70, 80, 90 및 100% 에틸알코올로 단계적으로 탈수시킨 다음 paraffin 투과과정을 거쳐 포매장치 (Histocentre 2, Shandon, USA)를 이용하여 포매하고 박절편기 (Leica, RM2045, Germany)로 약 4의 두께로 조직 절편을 제작하여 Hematoxylin & Eosin(H & E) 염색을 하고 xylene으로 투명화 과정을 거친 다음 permount로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
넣어 24시간 이상 고정하였다. 고정시킨 후 각 조직들을 흐르는 물로 충분히 수세하고 70, 80, 90 및 100% 에틸알코올로 단계적으로 탈수시킨 다음 paraffin 투과과정을 거쳐 포매장치 (Histocentre 2, Shandon, USA)를 이용하여 포매하고 박절편기 (Leica, RM2045, Germany)로 약 4의 두께로 조직 절편을 제작하여 Hematoxylin & Eosin(H & E) 염색을 하고 xylene으로 투명화 과정을 거친 다음 permount로 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
기존 항임제와 homoharringtoninee] 비교실험. HHT을 항암제로 개발하기 위해 자궁경부암과 난소암, 백혈병 등의 항암치료제로 널리 사용되는 adriamyc 비교실험을 하였다.
하였다. 또한 마우스를 실험동물로 하여 HHT를 투여한 후 간에 대한 조직학적 관찰과, 간 기능 관련 효소분석을 통해 HHT의 만성 독성을 검토하였다.
모든 실험구는 동일한 조건에서 동시에 3회씩 반복하여 측정하였다.
암세포 중식 저해율 분석. 암세포에 대한 증식 저해율을 분석하기 위한 실험에서는 sulforhodamine B(SRB)법을 사용하였다.
T의 처리 시간에 따른 최적 투여조건 결정 실험에서는 계대배양한 K562 세포주를 6-well plate에 3x1 cells/well 수준으로 부유시키고 37℃, 5% 가스 존재 하에 24시간 예비배양하였다. 예비배양 후 K562 세포주 용액 10m2에 HUT를 91.6, 183.3, 366.6, 733.1, 1466.2, 1832.8 μM의 농도가 되도록 1m/씩 처리하고 3, 6, 9일 경과할 때까지 매일 정해진 동일 농도로 처리하면서 성장을 관찰하였다. 기존 항암제와 T의 비교 실험에서는 전 배양된 K562 세포주를 6-well plateHl 5xl06 ceUs/well 수준으로 부유시키고 37℃, 5% CO2가스 존재 하에 24시간 예비배양하였다.
기존 항암제와 T의 비교 실험에서는 전 배양된 K562 세포주를 6-well plateHl 5xl06 ceUs/well 수준으로 부유시키고 37℃, 5% CO2가스 존재 하에 24시간 예비배양하였다. 예비배양 후 K562 세포주 용액 10mZ 에 HHT를 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mZ의 농도가 되도록 1m㎛ 처리하고 48시간 더 배양하였다. 배양이 종료된 후 96-well plate로 옮겨 cold 50% TCA> 각 well에 50 씩 가하고 4℃에서 1시간 동안 고정시켜 주었다, 고정이 끝나고 PBS 로 5회 세척하여 공기 중에서 건조하고 0.
주 1회 90일간 투여하고 5일 경과 후 혈액 중 혈액학적 지표에 미치는 영향을 조사하였다. 각각의 생쥐를 마취한 다음 혈액을 3차에 걸쳐 채취하였다.
혈액을 채취하였다. 채취된 혈액을 즉시 5,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층부의 혈장을 분리하여 혈액화학분석기 (CIBA Coming 550 Express, USA)를 이용하여 간 기능과 관련된 효소인 glutamate-oxalate-transferase(GOT)5 glutamate- pyruvate-transferase(GPT), cholesterol(Chol) 및 alkaline phosphatase(ALP)를 혈액자동분석기 (Hithachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 실험군간의 차이를 분석하였다.
대상 데이터
실험재료 및 시약. 개비자나무의 유효성분으로 알려진 homohairingtonine(HHTD는 Sigma사(MO, USA)로부터 구입하여 phosphate buffered saline(PBS, pH 7.4, GIBCO, MD, USA)로 희석하여 사용하였다. HHT의 순도는 Jingyi 등의 방법(2)에 따라 HPLC(high performance liquid chromatography)로 분석한 결과 98.
만성 독성 분석. 만성독성 실험에 사용할 8주령의 수컷 SPFICR 마우스와 6주령 수컷 nude mice를 The Jackson Lab(Bar Harbor, MA, USA)으로부터 구입하여 사용하였다. SPF ICR 생쥐 20마리를 주 1회 90일간에 걸쳐 L* 량 HHT(1.
항암활성 분석에 사용된 혈액암 세포주(K562, blood leukemia, chronic myelogenous)는 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB:에서 분양받아 사용하였고, 배지는 RPMI-1640 배지(Hycione, USA)에 10% fetal bovaine serum(FBS) 와 1% penicillin-streptomycin( 10, 000 units/mZ pencillin G sodium, 10, 000 gg/mZ streptomycin)을 혼합하여 사용하였다. 양성 대조군으로는 백혈병 치료제로 사용되고 있는 항암제 adriamycin(IL-Dong, Korea)을 사용하였다.
6%임을 확인하였다. 항암활성 분석에 사용된 혈액암 세포주(K562, blood leukemia, chronic myelogenous)는 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB:에서 분양받아 사용하였고, 배지는 RPMI-1640 배지(Hycione, USA)에 10% fetal bovaine serum(FBS) 와 1% penicillin-streptomycin( 10, 000 units/mZ pencillin G sodium, 10, 000 gg/mZ streptomycin)을 혼합하여 사용하였다. 양성 대조군으로는 백혈병 치료제로 사용되고 있는 항암제 adriamycin(IL-Dong, Korea)을 사용하였다.
이론/모형
각각의 생쥐를 마취한 다음 혈액을 3차에 걸쳐 채취하였다. 슬라이드에 스프레드한 다음 May-Griinwald-Giemsa 방법으로 염색을 한 다음 각각의 혈액 세포를 측정하였다. 혈액학적 지표 측정 결과 적혈구수(RBC) 는 대조군과 HHT 투여군 사이에 유의성이 없었다(Table 1).
암세포 중식 저해율 분석. 암세포에 대한 증식 저해율을 분석하기 위한 실험에서는 sulforhodamine B(SRB)법을 사용하였다.T의 처리 시간에 따른 최적 투여조건 결정 실험에서는 계대배양한 K562 세포주를 6-well plate에 3x1 cells/well 수준으로 부유시키고 37℃, 5% 가스 존재 하에 24시간 예비배양하였다.
성능/효과
즉 3일 동안 매일 처리한 후 50%의 성장 저해를 보인 농도(ICa, 50% inhibitory concentration)는 1099 μM이었으며 . 6일 동안 매일 처리한 후와 9일 동안 매일 처리한 후의 50%의 성장 저해를 보여주는 HHT 농도는 감소하여 각각 366.6 과 274.9 μM 수준이었다. 이것으로부터 K562 세포주에 HHT을 장기간에 걸쳐 처리(9 day treatment)할 경우 비교적 낮은 처리 농도(183.
HHT를 주 1회 90일간 투여하고 5일 경과 후, 간기능 관련 효소의 혈액을 분석한 결과, 간 손상과 관련된 효소인 GOT,GPT, ester이(Choi) 및 alkaline phosphatase(ALP) 모두 정상 범위에 있었다(Fig. 4).
4, GIBCO, MD, USA)로 희석하여 사용하였다. HHT의 순도는 Jingyi 등의 방법(2)에 따라 HPLC(high performance liquid chromatography)로 분석한 결과 98.6%임을 확인하였다. 항암활성 분석에 사용된 혈액암 세포주(K562, blood leukemia, chronic myelogenous)는 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB:에서 분양받아 사용하였고, 배지는 RPMI-1640 배지(Hycione, USA)에 10% fetal bovaine serum(FBS) 와 1% penicillin-streptomycin( 10, 000 units/mZ pencillin G sodium, 10, 000 gg/mZ streptomycin)을 혼합하여 사용하였다.
간의 조직학적 관찰을 위하여 육안적으로 부검을 한 결과, 대조군 마우스의 경우에는 간 표면에 이상을 발견할 수 없었으나, HHT 투여군 마우스의 경우에는 간 표면에 1mm 내외의 hyperplastic nodules을 발견할 수 있었다. 또한 현미경으로 간에 대한 소견을 관찰한 결과, 대조군 마우스의 경우에는 별다른 이상을 발견할 수 없었으나, HHT 투여군 마우스의 경우에는 밴드형의 호중구를 침착시키는 것이 확인되었다(Fig.
nodules을 발견할 수 있었다. 또한 현미경으로 간에 대한 소견을 관찰한 결과, 대조군 마우스의 경우에는 별다른 이상을 발견할 수 없었으나, HHT 투여군 마우스의 경우에는 밴드형의 호중구를 침착시키는 것이 확인되었다(Fig. 5).
9 μM 수준이었다. 이것으로부터 K562 세포주에 HHT을 장기간에 걸쳐 처리(9 day treatment)할 경우 비교적 낮은 처리 농도(183.3- 366.6 μM)에서도 K562세포주의 성장을 현저히 감소시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이상의 결과로부터 HHT로 혈액암 세포주에 장기간 반복처리 시 혈액암의 증식을 효과적으로 저해하는 것을 확인하였고, 마우스를 이용한 독성시험결과 혈액학적 지표상으로는 특이적인 변화를 발견할 수 없었으나 조직학적인 관찰 결과상으로는 대조군에 비해 다소 차이있는 관찰결과를 얻을 수 있었다.
슬라이드에 스프레드한 다음 May-Griinwald-Giemsa 방법으로 염색을 한 다음 각각의 혈액 세포를 측정하였다. 혈액학적 지표 측정 결과 적혈구수(RBC) 는 대조군과 HHT 투여군 사이에 유의성이 없었다(Table 1).
후속연구
따라서 추가적이고 면밀한 독성학적 연구를 통하여 HHT를 항암제로서 개발할 수 있을 것으로 판단된다.
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