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문제 정의
- 일반성분 분석. 개비자나무 추출물(Korean Plum-yem extract, KPE)를 식품소재로서 이용가능성을 확인하기 위해 KPE의 기초적인 일반성분을 조사하였디-. 일반성분 시험법은 시료 중에 일반적으로 함유되어 있는 성분에 관한 시험법으로서 시료의 규격과 순도 및 영양가를 평가하기 위한 방법이다.
- 이는 HHT의 항암제로서의 응용 가능성을 시사하는 결과였다. 따라서 본 실험에서는 고순도의 HHT 대신 HHT를 함유하고 있는 crude 상태의 추출물인 KPE의 세포증식 저해활성을 검토하였다. 본 연구에서 조제한 KPE는 HPLC로 분석한 결과 HHT의 체류 시간이 22.
- 이것은 의약품으로서 활용이 기대되는 결과로서 식품이나 기능성식품에서는 의약품과 다르게 생리활성 물질을 분리하지 않고 추출물인 상태에서도 기능성 소재로서의 활용성이 기대된다. 따라서 본 연구에서는 개비자나무의 잎과 줄기를 70% 에탄올을 이용하여 추출한 개비자나무 주줄 물(Korean Plum-yem extract, KPE)의 항균활성 및 세포독성을 탐색하고 개비자나무의 이용가치를 규명함으로써 기초적인 연구정보를 확보하고, 기능성 소재로서의 이용 가능성을 검토하였다.
- 적혈구 막지질의 붕괴는 용혈을 수반하기 때문에 간편한 용혈율의 측정은 막지질 붕괴정도를 판단할 수 있는 수단으로서 흔히 이용된다. 본 실험에서는 KPE를 섭취하였을 때 유발되는 용혈율을 측정하여 KPE의 적혈구 막지질 붕괴의 유무를 조사하였다. 이를 통하여 in vitro 독성분석의 기초 자료로 사용하고자 하였다.
- 항균활성 분석. 수목 유래의 추출성분이 항균, 항진균 등의약리작용을 갖는 것으로 보고된 바 있어 본 연구에서도 KPE 의 항균활성에 대하여 검토하였다. KPE의 농도에 따른 항균 활성은 Fig.
- 본 실험에서는 KPE를 섭취하였을 때 유발되는 용혈율을 측정하여 KPE의 적혈구 막지질 붕괴의 유무를 조사하였다. 이를 통하여 in vitro 독성분석의 기초 자료로 사용하고자 하였다. KPE의 hemolysis 분석 결과(Fig.
제안 방법
- 변이원성 시험에 사용한 Salmonella typhimurium LT2 유래의 TA98, TA 100 균주는 한국생명공학연구원에서 분양받아 계대 유지한 것을 사용하였다. AmeE의 원법을 변형하여 유전독성의 검색과 감도가 높은 preincubation 법을 수행하였다[Quiladet 등, 1982; Pang 등, 1990], 24시간 동안 배양된 균주 TA98(3.3xlO9 cells/mL)과 TA100(3.8xl09 cells/mL)의 배양액을 각각 O.lmL씩 취히여 KPE(6.25, 25, 50, 100 mg/tnL) 0.05 mL과 인산완충액 (phosphate buffer, pH 7.4) 0.5 mL를 cap tube에 넣어 혼합한 후 37<>C에서 30분간 preincubation하였다. Preincubation 후 4?C 에서 용해한 histidine/biotine이 첨가된 top agar 2mL을 변이원성 검색용 배지 (minimal glucose agar) 위에 중층으로 배양하여 콜로니 수를 계측하였다.
- 5 mL를 cap tube에 넣어 혼합한 후 37<>C에서 30분간 preincubation하였다. Preincubation 후 4?C 에서 용해한 histidine/biotine이 첨가된 top agar 2mL을 변이원성 검색용 배지 (minimal glucose agar) 위에 중층으로 배양하여 콜로니 수를 계측하였다. 각 시험구당 3개의 plate를 이용하여, 콜로니 수의 평균치를 수집하였고, 시험물질을 처리한 모든 군에 있어 복귀 변이 체수가 음성대조군의 2배 이상이면 복귀돌연변이 유발 능을 양성으로 판정하였다.
- Preincubation 후 4?C 에서 용해한 histidine/biotine이 첨가된 top agar 2mL을 변이원성 검색용 배지 (minimal glucose agar) 위에 중층으로 배양하여 콜로니 수를 계측하였다. 각 시험구당 3개의 plate를 이용하여, 콜로니 수의 평균치를 수집하였고, 시험물질을 처리한 모든 군에 있어 복귀 변이 체수가 음성대조군의 2배 이상이면 복귀돌연변이 유발 능을 양성으로 판정하였다.
- 0mL/min 유속으로 methanol: ammonium fbrmate가 20:80에서 시작하여 30min 후 40:60이 되도록 하였다. 각 화합물의 검출은 290 nm 파장에서 측정하였 으며, HHT의 정량은 Sigma사에서 구입한 표준 물질의 피크 면적으로 표준 정량선을 작성한 후 계산하였다[Kim 등, 2000].
- 5시간 동안 추출하였다. 개비자나무 추출물을 50 mL 튜브에 25mL씩 넣고 speed vaccum evaporator (Ecospin 3180C, Hanil Co. Ltd, Korea)를 이용하여 동결 건조한 개비자나무 추출물 (Korean Plum-yem extract, KPE)을 조제하였다.
- 본 연구에 사용한 개비자나무 (Cephalotaxus koreana)는 2006년 2월 광양 백운산에서 채집하였다. 개비자나무의 뿌리를 제외한 경엽부분을 양건하고 분쇄하여 분말로 만들었다. 분말상태의 개비자나무 1 kg을 70% 주정(에탄올) 8 kg과 혼합하여 미리 예열된 80℃의 수욕조(Jeio Tech, Korea)에서 4.
- HHT 함량 분석. 개비자나무의 유효성분인 homoharringtonine (HHT)의 분석은 Wickremesinhe와 Arteca의 방법 [1996]을 변형하여 분석하였다. C18 column(4.
- 분석. 실험에 사용한 시료는 5, 10, 20, 40, 80 mg/mL의 농도가 되도록 PBS로 희석하여 사용하였고, 양성 대조군으로는 HHT를 3 mg/mL의 농도가 되도록 PBS에 욍-해하여 비교 실험을 하였다. 정상 성인의 혈액을 원심분리하여 혈청을 제거한 후 차가운 PBS로 세 번 세척하여 준비한 5% 적혈구 용액 100 μL를 PBS 100 μL와 혼합한 후 시험물질 20 μL 를 가하였다.
- 이물질과 균을 제거하고 고형분 함량을 측정하여 80mg/mL임을 확인하였다. 여 과된 KPE를 10, 20, 40, 60, 80 ㎍/mL의 농도가 되 도록 PBS로 희석하여 사용하였고, 양^대조군으로는 HHT를 각각 5, 10㎍/mL의 농도로 PBS에 용해하여 비교 실험을 하였다. 전 배양된 K562 세포주(blood leukemia, chronic myelogenous, 6.
- 1g/mL로 조제 하였다. 용해 된 추출물을 0.22 ㎛ membrane filter(Whatman, England)로 이물질과 균을 제거하고 DMSCX 이용하여 12.5, 25, 50mg/mL으] 농도로 희석하였다. 양^대조군으로 homoharrmgtonine(HHT, Sigma, MO, USA, 1 mg/mL)을 이용하여 비교실험을 하였다.
- 일반성분 분석. 일반성분 시험법은 시료 중에 일반적으로 함유되어 있는 성분에 관한 시험법으로서 KPE의 규격, 순도 및 영양가를 평가하기 위하여 수분, 회분, 탄수화물, 단백질, 지방, 섬유질을 조사하였다. 분석은 식품공전의 시험방법 [AOAC, 2005]에 의하여 수분 함량은 상압가열건조법, 조단백 함량은 micro-Kjeldahl법으로 측정하였으며, 질소계수 6.
- 5 mL)를 접종하여 Table 1에 표시된 최적온도와 120rpm에서 18 시간동안 진탕 배양하였다. 전배양한 배양액을 흡광도가 0.5가 되도록 멸균증류수로 희석한 후, microdilution assay를 이용하여 분석하였다. 96 well plate에 180rL의 TSB, KPE(0.
- 실험에 사용한 시료는 5, 10, 20, 40, 80 mg/mL의 농도가 되도록 PBS로 희석하여 사용하였고, 양성 대조군으로는 HHT를 3 mg/mL의 농도가 되도록 PBS에 욍-해하여 비교 실험을 하였다. 정상 성인의 혈액을 원심분리하여 혈청을 제거한 후 차가운 PBS로 세 번 세척하여 준비한 5% 적혈구 용액 100 μL를 PBS 100 μL와 혼합한 후 시험물질 20 μL 를 가하였다. 37℃에서 30 min 동안 진탕 배양시킨 후에 600 HL으] PBS를 각 시험관에 넣고 3분간 원심분리한 후 상등액의 흡광도를 540nm에서 즉정하였다[Bemheimer와 Rudy, 1986; Rainey 등, 1991].
- Ame's test는 가장 흔히 사용하는 단기간의 돌연변이성 시험이다. 정상적인 박테리아는 외인성 히스티딘을 필요로 하지 않는데 외인성 히스티딘(exogenous histidine)을 필요로 하는 Salmonella typhimurium 의 돌연변이 종을 만들어 히스티딘이 없는 배지에 시험할 화학물질과 함께 배양하여 돌연변이종이 정상종으로 변화되는 능력을 검사하였다. 정상종으로 돌아가려는 능력이 클수록 그 화학물질은 유전물질을 변화시킬 가능성이 큰 것이므로 그만큼 발암성이 크다고 할 수 있다.
대상 데이터
- 변이원성 분석. 변이원성 시험에 사용한 Salmonella typhimurium LT2 유래의 TA98, TA 100 균주는 한국생명공학연구원에서 분양받아 계대 유지한 것을 사용하였다. AmeE의 원법을 변형하여 유전독성의 검색과 감도가 높은 preincubation 법을 수행하였다[Quiladet 등, 1982; Pang 등, 1990], 24시간 동안 배양된 균주 TA98(3.
- 개비자나무 추출물 조제. 본 연구에 사용한 개비자나무 (Cephalotaxus koreana)는 2006년 2월 광양 백운산에서 채집하였다. 개비자나무의 뿌리를 제외한 경엽부분을 양건하고 분쇄하여 분말로 만들었다.
- 세포독성 분석. 시험한 혈액암 세포주(K562, blood leukemia, chronic myelogenous)는 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받아 사용하였으며, 세포주 배양 배지로는 RPMI-1640 배지 (Hylone Laboratories Inc., UT, USA)에 10% fetal bovaine serum(FBS, Hylone Laboratories Inc., UT, USA) 와 1% penicillin-streptomycin(10, 000 units/mL pencillin G sodium, 10, 000 gg/mL streptomycin, Hylone Laboratories Inc., UT, USA)를 혼합하여 사용하였다. KPE를 phosphate buffered saline(PBS, GIBCO, UT, USA) 2.
- 분석. 실험에 사용한 균주로는 호묘(Saccharomyces cerevisaes KCTC 7243), 사상균(Aspergillus oryzae KCCM 12530), 그램음성군 3종(Sahnolella typhimurim ACTC 12023, Pseudomonas aeruginosa, ACTC 9027, Escherichia coli ACTC 9633), 그램양성군 3종(Staphylococcus aureus ACTC 65389, Bacillus subtillis ACTC 51189, Streptococcus mutans ACTC 25175)을 균주분양기관으로부터 입수하여 사용하였다(Table 1). 동결건조된 KPE를 dimethyl sulfoxide(DMSO, 99.
데이터처리
- 탄수화물 함량은 Bertrand 법을 사용하였고, 조섬유 함량은 100에서 수분, 조단백, 조지방, 회분, 탄수화물 함량을 뺀 값을 사용하였다. 각 실험은 3회 반복하여 얻은 평균값을 사용하였다.
- 본 연구에서 시행한 KPE(6.25, 25, 50, 100mg/mL)에 대한 Ame, s test는 각 시험구 당 2개의 plate를 이용하여, 집락 수의 평균치를 얻었다. 그 결과, Table 3에서 보는 바와 같이 base substitution형인 TA100의 집락수는 음성대조군과 비교하여 농도 의존성을 나타내지 않으므로 음성으로 판정되었으며, frame shifi형인 TA98에서도 역시 집락수에 있어서 음성대조군과 비교하여 농도 의존성을 나타내지 않았으며 또한 음성대조군에 비교하여 복귀돌연변이 집락수가 2배 이상으로 증가되지 않았으므로 음성으로 판정되었다.
이론/모형
- 일반성분 시험법은 시료 중에 일반적으로 함유되어 있는 성분에 관한 시험법으로서 KPE의 규격, 순도 및 영양가를 평가하기 위하여 수분, 회분, 탄수화물, 단백질, 지방, 섬유질을 조사하였다. 분석은 식품공전의 시험방법 [AOAC, 2005]에 의하여 수분 함량은 상압가열건조법, 조단백 함량은 micro-Kjeldahl법으로 측정하였으며, 질소계수 6.25를 사용하여 환산하였다. 조지방 함량은 Soxhlet 추출법을 사용하였고, 회분은 직접회화법으로 측정하였다.
- 25를 사용하여 환산하였다. 조지방 함량은 Soxhlet 추출법을 사용하였고, 회분은 직접회화법으로 측정하였다. 탄수화물 함량은 Bertrand 법을 사용하였고, 조섬유 함량은 100에서 수분, 조단백, 조지방, 회분, 탄수화물 함량을 뺀 값을 사용하였다.
- 조지방 함량은 Soxhlet 추출법을 사용하였고, 회분은 직접회화법으로 측정하였다. 탄수화물 함량은 Bertrand 법을 사용하였고, 조섬유 함량은 100에서 수분, 조단백, 조지방, 회분, 탄수화물 함량을 뺀 값을 사용하였다. 각 실험은 3회 반복하여 얻은 평균값을 사용하였다.
성능/효과
- 5, 25, 50mg/mL)에서 성장 저해현상을 나타내었다. 8종의 시험균주 중 그램 음성균인 Pseudomonas aeruginosaeA KPE에 가장 민감하게 생육 저해현상을 보였고, 마찬가지로 그램 음성균이며 식중독 유발균인 Salmonella thyphimurim, Escherichia coli 순이었다. 그램 양성균이 그램 음성균에 비해 생육저해효과가 작은 것으로 나타났다.
- 0 mg/g의 HHT를 함유하고 있는 것으로 나타났다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 혈액암 세포주(K562)를 이용하여 KPE의 세포독성을 분석한 결과 고형분 기준 80 gg/mLSj 농도에서 현저한 암세포 저해 활성을 보였고, IC50값이 40㎍/mL로 산출되 어 K562 세포주가 KPE에 의해 민감하게 반응함을 확인하였다. 대조군으로 사용한 HHT 역시 5, 10 pig/mLL의 농도에서 각각 78, 85%의 높은 암세포 저해활성을 보였다.
- 이를 통하여 in vitro 독성분석의 기초 자료로 사용하고자 하였다. KPE의 hemolysis 분석 결과(Fig. 3), 양성대조군인 HHT(3mg/mL)의 경우 1.32%로 낮은 hemolysis 현상을 보였으며, KPE는 50 mg/mL의 농도에서 10.8%의 비교적 높은 hemolysis 현상을 보였다. 따라서 KPE 중 hemolysis 를 일으키는 물질은 HHT 외에 다른 물질이 있는 것으로 판단된다.
- Streptococcus mutant 이용한 동백나무 추출물의 항균효과에 관한 보고에서는 그램 양성인 Streptococcus epidermidis^} 동백나무 주줄 물에 가장 민감하게 생육 저해현상을 보였고, Streptococcus mutans, Escherichia coli, Staphylococcus 순이었다[Hahn, 2005]. 개비자나무 추출물을 이용한 본 연구의 실험결과는 동백나무추출물이 주로 그램 양성균에 대하여 항균활성을 갖는 것과 대비되는 결과로서, KPE가 그램 음성균이며 식중독 유발균에 대한 항균제로 활용 가능함을 시사하였다.
- 25, 25, 50, 100mg/mL)에 대한 Ame, s test는 각 시험구 당 2개의 plate를 이용하여, 집락 수의 평균치를 얻었다. 그 결과, Table 3에서 보는 바와 같이 base substitution형인 TA100의 집락수는 음성대조군과 비교하여 농도 의존성을 나타내지 않으므로 음성으로 판정되었으며, frame shifi형인 TA98에서도 역시 집락수에 있어서 음성대조군과 비교하여 농도 의존성을 나타내지 않았으며 또한 음성대조군에 비교하여 복귀돌연변이 집락수가 2배 이상으로 증가되지 않았으므로 음성으로 판정되었다. 따라서 KPE는 돌연변이원성을 갖지 않는 것으로 판단되었다.
- 2에서 보는 바와 같이 혈액암 세포주(K562)를 이용하여 KPE의 세포독성을 분석한 결과 고형분 기준 80 gg/mLSj 농도에서 현저한 암세포 저해 활성을 보였고, IC50값이 40㎍/mL로 산출되 어 K562 세포주가 KPE에 의해 민감하게 반응함을 확인하였다. 대조군으로 사용한 HHT 역시 5, 10 pig/mLL의 농도에서 각각 78, 85%의 높은 암세포 저해활성을 보였다. 이는 분리정제되지 않은 KPE가 항암 소재로서의 가능성을 보여주는 결과이다.
- 따라서 본 실험에서는 고순도의 HHT 대신 HHT를 함유하고 있는 crude 상태의 추출물인 KPE의 세포증식 저해활성을 검토하였다. 본 연구에서 조제한 KPE는 HPLC로 분석한 결과 HHT의 체류 시간이 22.85분이었고 KPE는 54.6±9.0 mg/g의 HHT를 함유하고 있는 것으로 나타났다. Fig.
- 일반성분 시험법은 시료 중에 일반적으로 함유되어 있는 성분에 관한 시험법으로서 시료의 규격과 순도 및 영양가를 평가하기 위한 방법이다. 분석결과, KPE 는 건물(dry matter) 기준으로 회분 13.7%, 탄수화물 71.9%, 조 지방 8.9%, 조섬유 4.1%, 조단백 1.4%를 함유하고 있는 것으로 나타났다. 건조전의 추출액의 수분함량이 98.
- 22 jim membrane filter(Whatman, England)로. 이물질과 균을 제거하고 고형분 함량을 측정하여 80mg/mL임을 확인하였다. 여 과된 KPE를 10, 20, 40, 60, 80 ㎍/mL의 농도가 되 도록 PBS로 희석하여 사용하였고, 양^대조군으로는 HHT를 각각 5, 10㎍/mL의 농도로 PBS에 용해하여 비교 실험을 하였다.
- 본 연구팀은 전보[Yoo 등, 2008]에서 개비자나무의 유효성분으로 일려진 homoharringtonine(HHT)의 혈액암 세포주 K562에 대한 세포증식 저해 활성을 보고한 바 있다. 즉, 총 약물처리 시간에 따른 최적 투여조건 결정 실험에서 HHT 를 각각 9일, 6일, 3일 동안 매일 처리할 경우 0.27, 0.37, 1.10mM의 농도에서 K562세포의 성장을 50% 정도 감소시킴을 확인하였고, 기존 백혈병 치료제로 사용되고 있는 adriamycin 과의 비교실험 결과에서는 HHT가 K562 세포주에 대하여 adriamycin과 유사한 항암효과가 있는 것을 확인하였다. 이는 HHT의 항암제로서의 응용 가능성을 시사하는 결과였다.
후속연구
- 최근 국내산 식물체로부터 세포독성효과를 검정한 연구에 의하면 짚신나물, 삼백초, 층꽃나무 등이 강한 세포독성을 갖는다고 보고된 바 있다[Seo 등, 2008; Kim, 2008], 이와 같이 현재까지 여러 종류의 식물들이 유용한 항암활성 물질들을 함유하고 있는 것으로 보고되고 있다. 따라서 여러 식물을 이용하여 이들 유용물질들의 기능에 대해 보다 더 심도있는 연구를 하고 이를 기반으로 한 새로운 생물제제의 개발이 필요하다.
- 보고한 바 있다. 이것은 의약품으로서 활용이 기대되는 결과로서 식품이나 기능성식품에서는 의약품과 다르게 생리활성 물질을 분리하지 않고 추출물인 상태에서도 기능성 소재로서의 활용성이 기대된다. 따라서 본 연구에서는 개비자나무의 잎과 줄기를 70% 에탄올을 이용하여 추출한 개비자나무 주줄 물(Korean Plum-yem extract, KPE)의 항균활성 및 세포독성을 탐색하고 개비자나무의 이용가치를 규명함으로써 기초적인 연구정보를 확보하고, 기능성 소재로서의 이용 가능성을 검토하였다.
- 이상의 결과는 in vitro 독성분석의 기초 결과로서 KPE의 생물 소재로서의 응용 가능성을 시사하는 것으로 추후 in vivo 독성시험 등 면밀한 독성 분석이 필요한 것으로 판단된다.
- 이상의 결과를 통해 개비자나무 추출물이 식품소재로서 응용 가능성이 있음을 확인하였고 향후 추출공정 회수율을 높이기 위한 최적화 실험 및 수목 추출물 특유의 이미와 이취를 제거 또는 완화하기 위한 추가적인 연구를 통하여 기능성소재로 개발할 수 있을 것으로 판단된다.
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