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문제 정의
- 따라서 본 연구는 청주의한 아파트에서 가정분진 입자를 포집하고, 그 가정분진 입자를 10주 동안 알러지를 일으키는 항원과 함께 생쥐 기도내에 병행투여하여 가정분진 입자가 기관지 천식과 관련하여기도 염증과 기도과민성에 미치는 영향을 조사하였다
제안 방법
- Ⅱ.-10 의 함량과 interferon (IFN)-gamma ELISA kit는 Biosourcee} (Invitrogen, USA)것을 사용하였고, 혈액으로 유리한 히스타민 함량은 Beckman CoulteM} (Fullerton, USA) 제품과 혈액에서 immuno이obulun-E(IgE)의 함량은 Shibayagi사 (Shibukawa, Japan) 제품의 monoclonal antibody-based mouse interleukin ELISA kit를 이용하여 측정하였다. 즉 각 well에 천식유발 생쥐의 혈청과 폐세정액 lOOeiL씩을 각각 분주하고, 1시간동안 실온에서 방치한 후 2회 washing 완충 용액으로 세척한 다음 antibody biotin-conjugated# 넣고 30분간 방치하였다.
- 즉 Pehn값은 Pause-PTF/ PEF1와 같으며, 여기서 Pause=(Te—TR)/Tr로서 PIF 는 peak inspiratory flow, PEF는 peak expiratory flow, Te는 expiratory time, Tre relaxation time-。_루— Biosystem XA software (Buxco Research System, Wilmington, USA)를 이용하여 분석하였다. 10주간 가정분진 입자의 기도내 투여와 마지막 2.5% OVA inhallation 24시간 후에, 농도별 methacholine (Sigma)수용액을 50, 25, 12, 5 6.25, 3.125 mg/mL의 농도로 aerosol하고, 각각의 농도에 대한 기도의 반응성은 10분 동안 연속적으로 모니터링하면서 체크하였다.
- 5로 조정한 후 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 조제하였다. OVA 처리군과 가정분진 처리군에 각각 OVA/alum용액 0.2 mL(inhallation 14일과 7일 전)를 그리고 1 % OVA용액 0.1 mL (i가iMlation 11 일과 2일전)를 각각 2회씩 복강 내로 투여하였다. 또한 250 X 300 X250 mm의 polycarbonate재질 (DJ-435, Daejong Inc, Korea) 아iamber안에서 10주 동안 일주일에 한번, 일 일에 30분 Buxco Aersol Dilivery System (NE-CT10, Buxco Co.
- 다시 2회 수세 후 완충 용액으로 세척한 다음 antibody Avidin- HRP conjugeted 100 μL를 처리하고, 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 lOOpL씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 100 의 stop 용액을 처리한 후 ELISA reader를 이용하여 450nm에서 홉광도를 측정하고 그 함량을 계산하였다.
- 4)으로 1 mg/mL의 농도가 되도록 suspension을 만든 다음, -4℃로 유지하면서 초음파 세포분쇄기 (Tomy UD-201, Tokyo, Japan)로 50% 최대 출력하에 5분 동안 sonicatioir하였다. 가정분진 투여군 생쥐를 10% chloral hydrate로 마취한 다음, 기도내 투여용 cannula을 이용하여 그 가정분진입자 suspension 1 mg/mL 용액 100 μL를 10주 동안 일주일에 1회 기도내로 투여하였고, 정상군과 OVA 처 리군은 0.05% Tween 80을 함유한 50 mM PBS 용액 (pH 74)만을 기도내로 투여하였다.
- 있다. 그 원인을 구명하기 위하여, 우리는 한국의 중산층이 사는 한 아파트에서 가정분진 입자를 포집하고, 생쥐에 항원과 함께 투여하여 기도 염증과 기도과민성에 미치는 영향을 조사하였다. 웅성 생쥐를 H)주 동안 사육하면서 졍valbumin(OVA) 항원으로 감작화하면서 img/mL 농도로 만든 가정분진입자 현탁액 0.
- 생쥐를 정상군, OVA 처리군 및 가정분진 처리군 세 그룹으로 나누고 한 그룹당 16마리씩 사육하여 기도과민성 측정 등에 8마리씩 사용하였고, 혈액과 기도폐 세정액 채취 및 분석에 8마리씩 사용하였다. 동물사육실의 조건은 conventional system으로 온도는 20±2℃, 습도는 40~60%, 환기는 1시간당 12~ 15회로 하였으며, 1일 중 12시간은 200~300 Lux로 조명하고 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 실험동물의 사료는 (주) 삼양사(Seoul, Korea) 제품의 고형사료(조단백질 22.
- 1 mL (i가iMlation 11 일과 2일전)를 각각 2회씩 복강 내로 투여하였다. 또한 250 X 300 X250 mm의 polycarbonate재질 (DJ-435, Daejong Inc, Korea) 아iamber안에서 10주 동안 일주일에 한번, 일 일에 30분 Buxco Aersol Dilivery System (NE-CT10, Buxco Co. USA)> 이용하여 6주간은 1% OVA 용액, 그리고 마지막 4주간은 2.5% OVA 용액을 aerosol화하여 분무하였다.
- , 2006). 본 실험에서는 asthma P아m값으로 처리군을 비교하여 기도 자극에 대한 과민성을 측정하였다. 주 동안 실험절차에 따라 처리한 정상군, OVA 처리군 및 QVA十 가정분진 처리군에 methacholinee-농도별로 분무하고, Pehn값을 비교한 결과는 그림 1 과 같다.
- (Eumsung, Korea)에서 구입한 Balb/c계 생쥐로 수컷만을 이용하였다. 생쥐를 정상군, OVA 처리군 및 가정분진 처리군 세 그룹으로 나누고 한 그룹당 16마리씩 사육하여 기도과민성 측정 등에 8마리씩 사용하였고, 혈액과 기도폐 세정액 채취 및 분석에 8마리씩 사용하였다. 동물사육실의 조건은 conventional system으로 온도는 20±2℃, 습도는 40~60%, 환기는 1시간당 12~ 15회로 하였으며, 1일 중 12시간은 200~300 Lux로 조명하고 12시간은 모든 빛을 차단하였다.
- 실험 종료 후 생쥐는 10% chloral hydrate를 복강내에 투여한 후 혈액을 심장채혈법으로 포집하고, 원심분리 3, 000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 혈청을 얻었으며, -70℃에 보관하면서 실험에 사용하였다. 혈청성분과 효소들의 활성도는 바이오톡스텍(주) (Cheongju, Korea)에 의뢰하여 측정하였다.
- 그 원인을 구명하기 위하여, 우리는 한국의 중산층이 사는 한 아파트에서 가정분진 입자를 포집하고, 생쥐에 항원과 함께 투여하여 기도 염증과 기도과민성에 미치는 영향을 조사하였다. 웅성 생쥐를 H)주 동안 사육하면서 졍valbumin(OVA) 항원으로 감작화하면서 img/mL 농도로 만든 가정분진입자 현탁액 0.1 mL를 기도내로 일주일에 1회 투여하였다. OVA 감작화와 함께 가정분진의 기도내 투여는 생쥐의 혈액에서 lactate dehydrogenase-^) 활성도 및 IgE와 히스타민의 함량을 증가시켰으며, 기도과민성이 상승하였다.
- 기도폐세정액 (BALF)은 37℃에서 주사기로 10% FBS DMEM 배양액을 기도에 반복하여 주의 깊게 넣고 빨라드려서 얻었으며, 이 과정을 3회 반복하였다. 이 폐세정액의 세포를 Cytospin centrifuge (Cellspin, Hanil, Korea)를 이용하여 슬라이드 글라스 위에 도말하고 Diff-Quik로 염색하여 호산구의 세포수를 조사하였다. 폐 세정액의 상층액은 -7(TC에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 혈청성분과 효소들의 활성도는 바이오톡스텍(주) (Cheongju, Korea)에 의뢰하여 측정하였다. 기도폐세정액 (BALF)은 37℃에서 주사기로 10% FBS DMEM 배양액을 기도에 반복하여 주의 깊게 넣고 빨라드려서 얻었으며, 이 과정을 3회 반복하였다.
대상 데이터
- 아파트는 방 4개, 거실, 주방으로 이루어져 있고크기는 1190?이며, 입주는 1998년으로 지은 지 9년 되었다. 가정 구성원은 40 대의 부부, 고등학교, 중학교, 초등학교 학생 등 5명이며 중학생과 초등학생은 아토피 환자이다 가정분진 입자의 포집은 2006년도 2월 6일부터 20일까지 이주일 동안, 매일 오전 10시에 진공청소기(삼성 VC -N-900, Korea)로 집안을 청소하면서 청소기로 걸러진 미세먼지 입자를 수집하고, 냉동고(-20℃에 저장하면서 실험에 사용하였다. Colt * 瓦.
- 가정분진 입자는 충청북도 청주시 상당구 용암동건영아파트에서 중산층이라고 판단되는 한 가정 아파트를 대상으로 포집하였다. 아파트는 방 4개, 거실, 주방으로 이루어져 있고크기는 1190?이며, 입주는 1998년으로 지은 지 9년 되었다.
- 4% 이상 배합사료)를 사용하였다. 그리고 ca응e는 polycarbonate재질로 만든 것을 사용하였으며 깔집 은 (주) JRS (MK-2000 Corncob. Germany) 제품을 사용하였다. 실험동물의 사육과 모든 과정은 국제 동물이용관리 위원회 지침에 준하여 실시하였다.
- 본 연구에서 사용된 실험동물은 Daehan Biolink Co. (Eumsung, Korea)에서 구입한 Balb/c계 생쥐로 수컷만을 이용하였다. 생쥐를 정상군, OVA 처리군 및 가정분진 처리군 세 그룹으로 나누고 한 그룹당 16마리씩 사육하여 기도과민성 측정 등에 8마리씩 사용하였고, 혈액과 기도폐 세정액 채취 및 분석에 8마리씩 사용하였다.
- 동물사육실의 조건은 conventional system으로 온도는 20±2℃, 습도는 40~60%, 환기는 1시간당 12~ 15회로 하였으며, 1일 중 12시간은 200~300 Lux로 조명하고 12시간은 모든 빛을 차단하였다. 실험동물의 사료는 (주) 삼양사(Seoul, Korea) 제품의 고형사료(조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0% 이하, 조섬유 5.0% 이하, 조회분 8.0% 이하, 칼슘 0.6 % 이상, 인 0.4% 이상 배합사료)를 사용하였다. 그리고 ca응e는 polycarbonate재질로 만든 것을 사용하였으며 깔집 은 (주) JRS (MK-2000 Corncob.
데이터처리
- 모든 데이터는 평균土표준편차로 나타내었으며, 데 이터 분석은 StatView version(4.0 Abacus Concepts, Inc. Berkeley, CA)을 이용하였고, Fisher's protected least significant difference test 혹은 S아leffe's F fest에 의해 두 처리군 사이에 P값이 0.05보다 작은 값을 나타내었을 떄 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
- 가정분진 입자의 기도내 투여는 Lim 등의 방법 (1998)에 준하여 실시하였다. 즉 가정분진 입자를 0.
- 기도과민성의 측정은 whole body plethysmographs인 Biosystem XA (Buxco research system, Wilmington, NC, USA) 장비를 사용하여 Finotto et al. (2001)의 방법에 따라 실시하였다. 즉 Pehn값은 Pause-PTF/ PEF1와 같으며, 여기서 Pause=(Te—TR)/Tr로서 PIF 는 peak inspiratory flow, PEF는 peak expiratory flow, Te는 expiratory time, Tre relaxation time-。_루— Biosystem XA software (Buxco Research System, Wilmington, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 실험 동물에 Ovalbumin (OVA: Sigma St. Louis, MO) 감작화 및 홉입 은 Hammad et al. (2004)의 방법에 따라 실시하였다. 즉 OVA/alum 용액은 먼저 50 mM PBS용액 (pH 7.
- Germany) 제품을 사용하였다. 실험동물의 사육과 모든 과정은 국제 동물이용관리 위원회 지침에 준하여 실시하였다.
성능/효과
- (Von Eyben, 2001). AST와 ALT 활성도의 경우 단독 OVA 처리군과 OVA+가정분진 처리군이 정상군에 비해 약간 증가하는 경향을 나타내었다. 그러나 Llactate dehydrogenase (LDH) 활성도는 단독 OVA 처리군은 정상군과 비교했을 때 통계적 유의성 없이 증가하는 경향을 보였으나 OVA+가정분진 처리 군은 정상군의 약 L7배 증가하였다.
- 1 mL를 기도내로 일주일에 1회 투여하였다. OVA 감작화와 함께 가정분진의 기도내 투여는 생쥐의 혈액에서 lactate dehydrogenase-^) 활성도 및 IgE와 히스타민의 함량을 증가시켰으며, 기도과민성이 상승하였다. 또한 폐세정액에서 알러지와 천식 요인과 밀접 한 관련이 있는 총 세포수가 증가하였고, 그중에서도 특히 호산구의 수도 크게 증가하였으며, T2 type cytokine 인 IL-4, 丄-5 및 IL-13의 함량과 IgE 그리고 eofaxin의 함량도 크게 증가하였다* 그러나 OVA 김작화와 함께 가정분진 입자룔 기도내로 투여하여도 T1 type cytokinee interferon-gamma-el 함량은 폐세정액에서 크게 변하지 않았다.
- 01), OVA 처리군에 비해서는 같은 농도에서 약간 높은 값을 유지하였으나 두 처리군간에 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다. 따라서 10주동안 생쥐에 QVA로 처리하고 난 후 methacholin 분무농도룔 증가시키면 생쥐의 기도과민성은 크게 증가하며, 또한 장기간 가정분진 입자를 OVA 감작화와 함께 병행 처리했을 때는 OVA 단독 처리군보다 기도 자극에 대한 천식성 기도과민성은 더 악화시킬 가능성이 있다는 것을 나타내는 결과라고 판단된다.
- 또한 폐세정액에서 알러지와 천식 요인과 밀접 한 관련이 있는 총 세포수가 증가하였고, 그중에서도 특히 호산구의 수도 크게 증가하였으며, T2 type cytokine 인 IL-4, 丄-5 및 IL-13의 함량과 IgE 그리고 eofaxin의 함량도 크게 증가하였다* 그러나 OVA 김작화와 함께 가정분진 입자룔 기도내로 투여하여도 T1 type cytokinee interferon-gamma-el 함량은 폐세정액에서 크게 변하지 않았다. 따라서 생쥐에 OVA 감작과 함께 장기로 가정분진 입자를 투여했을 때 항원성 기도 염증과 기도과민성을 나타내는 인자의 함량을 증가시키는 것으로 보아 아파트에서 발생하는 가정분진 입자는 알러지와 아토피 환자의 증세를 더 악화시키는 요인으로 작용할 수 있다고 생각된다.
- 3배나 증가하였다. 따라서 생쥐에게 장기간 가정분진 입자를 OVA 감작화와 함께 기도내로 투여했을 때 혈액에서 침윤하는 세포수가 크게 증가하며 그중에서도, 특히 호산구수가 급증하는 것으로 보아 가정분진 입자는 항원으로 인한 기관지 천식성 만성염증의 기여인자가 될 수 있다고 판단된다.
- 2배 증가하였다. 따라서 생쥐에게 장기간 가정분진 입자를 OVA 감작화와 함께 기도내에 투여했을 때 혈액중에서 IgE의 함량과 히스타민의 함량은 크게 증가하며, 이는 가정분진 입자가 알러지성 기관지 천식 발증에 기여할 수 있다는 것을 보여주는 결과라고 생각된다.
- 2배로 더 증가하였으며 이는 혈장에서 측정한 결과와 같은 양상이었다. 또한 eotaxhi의 함량도 OVA 단독 투여군과 OVA+ 가정분진 투여군에서 크게 증가하였다. 따라서 생쥐에게 장기간 가정분진 입자를 OVA 감작화와 함께 기도내에 투여했을 때 혈액에서 뿐만 아니라 폐세정액에서도 IgE 함량을 증가시키고, 또한 eotaxin expres-$ion을 유도할 가능성이 있다고 생각된다.
- 75로 정상군에 비해 methacholine 농도에 따라 크게 증가하였다. 즉, OVA 처리군의 P않m값은 me由아Mine 분무농도 12.5 mg/mL부터 정상군보다 높았으며(p<0.01), O틸A+가정분진 처리군도 정상군에 비해서는 높았으나(p<0.01), OVA 처리군에 비해서는 같은 농도에서 약간 높은 값을 유지하였으나 두 처리군간에 통계적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다. 따라서 10주동안 생쥐에 QVA로 처리하고 난 후 methacholin 분무농도룔 증가시키면 생쥐의 기도과민성은 크게 증가하며, 또한 장기간 가정분진 입자를 OVA 감작화와 함께 병행 처리했을 때는 OVA 단독 처리군보다 기도 자극에 대한 천식성 기도과민성은 더 악화시킬 가능성이 있다는 것을 나타내는 결과라고 판단된다.
- 폐 세정액에서 IL-5의 함량은 IL-4함량과 같이 정상군에 비해 OVA 단독 처리군과 OVA+가정분진처리군에서 각각 약 115.7배와 124.0배로 크게 증가되었다. 또한 Helper T2세포에서 유리된다고 알려진 ILJ3의 함량도 OVA로 10주 동안 감작했을 때 정상군에 비해 폐정액에서 약 21.
- (Na知jima and Taka” tw, 2007). 폐세정액에서 IL-4함량은 정상군의 경우 12.5 pg/mL이었으나 OVA 단독 처리군에서는 118.8 pg/mL로 정상군에 비해 약 9.5배 증가하였으며, OVA+ 가정분진 처리군에서는 20少4 pg/mL로 정산군에 비해 약 16.8배 증가하였다. 그러나 interferon gamma (IFR-丫)는 Helper T1 세 포에서 분비 되며, influenza virus나 이종 핵산과 접했을 때 합성되는 단백질로서 표적세포를 항바이러스 상태로 유도하는 작용과 증식억제 및 항암작용을 갖고 있고특히 면역계 세포에 대한 immunomodulatory 작용이 현저하다고 알려지고 있다(Kumar 就以, 2006).
- 표 2는 생쥐에 10주 동안 OVA 감작화와 함께 기도내에 가정분진 입자를 투여했을 떄 폐의 무게변화와 폐세정액에서 총 세포수와 호산구수 등을 측정한 결과이다폐의 무게의 경우 OVA+가정분진 처리군이 상대적으로 가장 무거웠으며, 다음은 OVA 단독 처리군과 정상군 순이었다. 폐세정액에서 OVA 단독 처리군 총 세포수는 정상군에 비해 약 6.9배 증가하였으며, OVA+가정분진 처리군은 약 9.0배 증가하였다. 폐세정액에서 호산구의 수도 OVA 단독처리군은 정상군에 비해 약 24.
- 0배 증가하였다. 폐세정액에서 호산구의 수도 OVA 단독처리군은 정상군에 비해 약 24.7배 증가하였고, OVA+가정분진 처리군은 약 36.3배나 증가하였다. 따라서 생쥐에게 장기간 가정분진 입자를 OVA 감작화와 함께 기도내로 투여했을 때 혈액에서 침윤하는 세포수가 크게 증가하며 그중에서도, 특히 호산구수가 급증하는 것으로 보아 가정분진 입자는 항원으로 인한 기관지 천식성 만성염증의 기여인자가 될 수 있다고 판단된다.
- 생쥐에 10주 동안 OVA 감작화와 함께 기도내에 가정분진 입자를 투여하면서 혈장에서 알러지 반응의 주체인 히스타민 함량과 IgE의 함량을 측정하고 비교한 결과는 표 3과 같다. 혈장에서 정상군 생쥐의 히스타민의 함량은 2.9|1M 이었으나 OVA 단독 처리군의 히스타민 함량은 2&4 μM로 약 9.8배 증가하였으며, OVA+ 가정분진 처리군은 43.7 |1M로 약 15」배나 증가하였다. 또한 혈장에서 IgE 함량도 정상군에서 170.
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