Purpose: Specific bacteria are believed to play an important role in chronic periodontitis. Although extensive microbial analyses have been performed from subgingival plaque samples of periodontitis patients, systemic analysis of subingival microbiota has not been carried out in a Korean population ...
Purpose: Specific bacteria are believed to play an important role in chronic periodontitis. Although extensive microbial analyses have been performed from subgingival plaque samples of periodontitis patients, systemic analysis of subingival microbiota has not been carried out in a Korean population so far. The purpose of this study was to investigate the prevalence of 29 putative periodontal pathogens in Korean chronic periodontitis patients and evaluate which pathogens are more associated with Korean chronic periodontitis. Material and Methods: A total of 86 subgingival plaque samples were taken from 15 chronic periodontits(CP) patients and 13 periodontally healthy subjects in Korea. CP samples were obtained from the deepest periodontal pocket (>3 mm probing depth[PD]) and the most shallow periodontal probing site ($\leq$3 mm PD) in anterior tooth and posterior tooth, respectively, of each patient. Samples in healthy subjects were obtained from 1 anterior tooth and 1 posterior tooth. Polymerase chain reaction (PCR) of 16S ribosomal DNA (rDNA) of subgingival plaque bacteria was performed. Detection frequencies(% prevalence) of 29 putative periodontal pathogens were investigated as bacterium-positive sites/total sites. Results: With the exception of Olsenella profuse and Prevotella nigrescens, the sites of diseased patients generally showed higher prevalence than the healthy sites of healthy subjects for all bacteria analyzed. Tanerella forsythensis (B.forsythus), Campylobacter rectus, Filifactor alocis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas endodontalis and Porphyromonas gingivalis were detected in more than 80% of sites with deep probing depths in CP patients. In comparison between the sites (deep or shallow PD) of CP patients and the healthy sites of healthy subjects, there was statistically significant difference(P<0.05) of prevalence in T.forsythensis (B.forsythus), C.rectus, Dialister invisus, F.alocis, P.gingivalis and Treponema denticola. Conclusion: Our results demonstrate that the four putative periodontal pathogens, T.forsythensis (B.forsythus), C.rectus, P.gingivalis and F.alocis are closely related with CP patients in the Korean population.
Purpose: Specific bacteria are believed to play an important role in chronic periodontitis. Although extensive microbial analyses have been performed from subgingival plaque samples of periodontitis patients, systemic analysis of subingival microbiota has not been carried out in a Korean population so far. The purpose of this study was to investigate the prevalence of 29 putative periodontal pathogens in Korean chronic periodontitis patients and evaluate which pathogens are more associated with Korean chronic periodontitis. Material and Methods: A total of 86 subgingival plaque samples were taken from 15 chronic periodontits(CP) patients and 13 periodontally healthy subjects in Korea. CP samples were obtained from the deepest periodontal pocket (>3 mm probing depth[PD]) and the most shallow periodontal probing site ($\leq$3 mm PD) in anterior tooth and posterior tooth, respectively, of each patient. Samples in healthy subjects were obtained from 1 anterior tooth and 1 posterior tooth. Polymerase chain reaction (PCR) of 16S ribosomal DNA (rDNA) of subgingival plaque bacteria was performed. Detection frequencies(% prevalence) of 29 putative periodontal pathogens were investigated as bacterium-positive sites/total sites. Results: With the exception of Olsenella profuse and Prevotella nigrescens, the sites of diseased patients generally showed higher prevalence than the healthy sites of healthy subjects for all bacteria analyzed. Tanerella forsythensis (B.forsythus), Campylobacter rectus, Filifactor alocis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas endodontalis and Porphyromonas gingivalis were detected in more than 80% of sites with deep probing depths in CP patients. In comparison between the sites (deep or shallow PD) of CP patients and the healthy sites of healthy subjects, there was statistically significant difference(P<0.05) of prevalence in T.forsythensis (B.forsythus), C.rectus, Dialister invisus, F.alocis, P.gingivalis and Treponema denticola. Conclusion: Our results demonstrate that the four putative periodontal pathogens, T.forsythensis (B.forsythus), C.rectus, P.gingivalis and F.alocis are closely related with CP patients in the Korean population.
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문제 정의
이에, 본 연구는 치주지환 원인균으로 알려져 있는 29가지 세균의 발생 빈도를 한국 만성 치주염 환자와 정상 환자에서 조사하고자 하였다. 아울러, 만성 치주염 환자에서 탐침 깊이에 따른 균의 분포 특성을 알아보고자 하였다. 이를 통해 원인균에 대해서 파악하고자 하였다.
아울러, 만성 치주염 환자에서 탐침 깊이에 따른 균의 분포 특성을 알아보고자 하였다. 이를 통해 원인균에 대해서 파악하고자 하였다. 실험 대상에서 흡연과 당뇨 환자는 대상에서 제외 되었으며, 15명의 만성치주염 환자와 13명의 치주적으로 건강한 정상인으로부터 치은연하에서 치태를 채취하여, 16S rRNA 유전자를 Polymerase chain reaction(PCR) 방법에 의해 검사함으로써 각 치주균의 분포를 조사하였다.
이에, 본 연구는 치주지환 원인균으로 알려져 있는 29가지 세균의 발생 빈도를 한국 만성 치주염 환자와 정상 환자에서 조사하고자 하였다. 아울러, 만성 치주염 환자에서 탐침 깊이에 따른 균의 분포 특성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
PCR 반응의 반응 용액은 AccPower® PCR PreMix(Bioneer Corp., Korea)를 사용했으며, thermal cycler(Applied biosystems, CA, USA)에서 30회의 PCR cycle이 시행되었다.
이를 통해 원인균에 대해서 파악하고자 하였다. 실험 대상에서 흡연과 당뇨 환자는 대상에서 제외 되었으며, 15명의 만성치주염 환자와 13명의 치주적으로 건강한 정상인으로부터 치은연하에서 치태를 채취하여, 16S rRNA 유전자를 Polymerase chain reaction(PCR) 방법에 의해 검사함으로써 각 치주균의 분포를 조사하였다.
DNA 추출을 위해 보관되었던 각 200 ㎕의 치태 표본 보관액에 400 ㎕의 가 더해졌다. 이렇게 얻어진 600 ㎕ 치태 용액에서 QIAamp DNA Mini kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 buccal swab spin protocol12)에 의해 Genomic DNA 추출과 정제를 시행하였다. 제작되어 사용된 oligonucleotide primer(Bioneer Corp.
0, 100V)하여 UV detector로 증폭된 단편들을 확인하고, 결과들을 분석하였다. 이를 통해 치태 표본에서 각 세균의 존재 유무를 평가하였다.
이후 전체 반응액의 20 μl 중 10 μl를 0.8% agarose gel에서 30분간 전기영동(0.04 M Tris-acetate, 0.01 M EDTA, pH 8.0, 100V)하여 UV detector로 증폭된 단편들을 확인하고, 결과들을 분석하였다.
이렇게 얻어진 600 ㎕ 치태 용액에서 QIAamp DNA Mini kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 buccal swab spin protocol12)에 의해 Genomic DNA 추출과 정제를 시행하였다. 제작되어 사용된 oligonucleotide primer(Bioneer Corp., Korea)는 기존 문헌과 전산분석을 통해13-32) 각 균주들의 16S rRNA 유전자 부위의 염기서열들이 서로 중복되지 않도록 하였고, 또한 PCR 증폭 후 얻어지는 단편들의 크기가 모두 다르게 하여 전기영동으로 확인하였을 때 겹쳐서 보이지 않도록 하였다. 그러나, Treponema socranskii의 경우에는 16S rRNA 부위의 염기서열을 이용하여 PCR을 수행하였을 때 증폭되지 않아, phosphoglucokinase site로부터 primer가 제작되었다.
치태 표본 채취 과정은, 먼저 표본 채취 부위의 치은 연상 치태를 소독된 cotton pellet 으로 조심스럽게 제거하고, cotton roll을 이용하여 격리한 후, 소독된 근관치료용 paper point(#30; Sure-endo®, Sure Dent Co., Korea)를 치주낭에 10초간 삽입함으로써 치태 표본을 획득하였다.
탐침 시 추렬, 치주낭 깊이, 부착 수준은 제3대 대구치를 제외한 치아 당 6부위(근심 협측, 협측, 원심 협측, 원심 설측, 설측, 근심 설측)에서 측정되었다. 치주낭 깊이와 부착수준은 color coded probe(2 mm 단위, 길이 12 mm)에 의해 측정되었다.
대상 데이터
24세에서 35세 사이의 13명의 정상 대조군 참여자가 선택되었으며, 임상 및 방사선 사진 검사 후에 임상적 평가기준10)에 의거하여 만성 치주염(chronic periodontitis)으로 진단된 33세에서 63세 사이의 15명의 환자가 선택되었다. 만성 치주염 환자로 분류된 참여자는 모두 적어도 4 mm 이상의 치주낭을 4부위 이상, 3 mm 이상의 부착 상실을 적어도 4부위 이상 지니고 있었다11).
관동대학교 의과대학 명지병원 치과에 내원한 28명의 성인이 연구를 위해서 선택되었다. 임상 측정과 치태 표본 채취를 포함한 연구 계획은 관동대학교 의과대학 명지병원 임상시험심사위원회(IRB)에 의해 승인되었다(06-022).
참고로 본 실험에 사용된 29종의 각 균주는 모두 phosphoglucokinase의 ORF를 갖고 있지만 서로 다른 염기서열을 갖고 있다. 또한, A.actinomycetemcomitans ATCC29524에 대해서는 16S rRNA를 사용하고, 다른 strain은 polysaccharide antigen gene cluster(serotype a-f)를 사용하였다(Table 2).
실험군인 만성 치주염 환자에서, 초진 시에 가장 깊은 치주 탐침 깊이를 보이는(PD > 3 mm) 전치부 1개 치아와 구치부 1개 치아 부위에서 치은연하 치태 표본이 채취되었다.
아울러, 가장 얕은 치주 탐침 깊이를 보이는(PD > 3 mm) 전치부 1개 치아와 구치부 1개 치아에서도 채취되었다. 치주적으로 건강한 대조군에서는 전치부와 구치부 각각 1개 치아 부위에서 치태 표본이 채취 되었다(Table 1).
데이터처리
만성 치주여 환자의 깊은 치주 탐침 부위 및 얕은 치주 탐침 부위와 치주염이 없는 성인의 정상 부위 사이의 치주질환 원인균 발생 빈도의 차이에 대한 통계적 분석은 Chi-square test나 Fisher's exact test에 의해서 시행되었다.
이론/모형
만성 치주염 환자 내에서 가장 깊은 치주 탐침을 보이는 부위(PD>3 mm)와 가장 얕은 치주 탐침을 보이는 부위(PD>3 mm)의 비교는 McNemar's test에 의해서 분석되었다.
성능/효과
alocis가 새로운 주요한 치주 질환 원인균으로 고려되어야 할 필요성이 있을 것이다. 결론적으로 서구에서 치주 질환 원인균으로 추정되는 것과 유사한 세균이 한국 성인 만성 치주염 환자에서도 높은 빈도로 발견되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 만성 치주염 환자 내에서 가장 깊은 치주 탐침을 보이는 부위와 가장 얕은 치주 탐침을 보이는 부위를 비교했을 때, 기존에 보고된 바와 같이 깊은 치주낭을 지닌 부위에서 더 높은 비율로 치주 질환 원인균이 나타났으며, 치주적으로 건강한 사람과 치주염 환자의 얕은 치주 탐침 부위를 비교했을 때보다 더욱 많은 원인균에서 통계적으로 유의성(P<0.05) 있는 차이를 보였다.
만성 치주염 환자의 가장 얕은 치주 탐침을 보이는 부위와 치주적으로 건강한 사람의 표본 채취 부위에서 치주질환 원인균의 발생 빈도를 통계적으로 비교했을 때, T. forsythensis(B.forsythus), C.rectus, D.invisus, F.alocis, P.gingivalis, T.denticola에서 통계적 유의성(P<0.05)이 발견되었다.
이 중 PCR 방법이 배양법보다 특이적이며 민감도가 높게 세곤을 진단할 수 있는 것으로 보고되어지고 있다33). 본 연구에서도 16S rRNA에 기초한 PCR 방법에 의해 치주질환 원인균으로 알려져 있는 29 종류의 세균을 분석함으로써, 기존에 배양법에서 존재했던 여러 가지 제한점을 극복할 수 있었으며, 이를 통해 보다 객관적인 결과가 얻어질 수 있었다.
intermedia 또한 높은 빈도로 나타난다고 보고 된 바 있다8). 본 연구에서도 치주 질환 환자의 깊은 치주낭에서 이와 유사하게 T.forsythensis, F.nucleatum, P.gingivalis가 80% 이상의 발생 빈도로 나타났으며, M.micros(P.micros)(53.3%), P.intermedia (50.0/63.3%)도 높은 발생 빈도를 보이나 기존의 연구와 상반되게 A.actinomycetemcomitans는 매우 낮은 발생 빈도(≦13.3%)를 보였다. 이는 실험 방법의 차이, 실험군의 설정, 표본 채취 방법 등의 차이에 기인할 수도 있다고 보여지나, A.
endodontalis 또한 80% 이상의 발생 빈도를 보였다. 아울러, Q.profuse, P.nigrescenes를 제외하면 치주질환 원인균으로 추정되는 나머지 27종류의 세균들은 모두 치주염이 없는 사람의 건강한 부위보다 만성 치주염 환자의 깊은 치주 탐침 부위와 얕은 탐침 부위 모두에서 발생 빈도가 높았다. 그러나, 주된 치주질환 원인균으로 알려져 있는 A.
아울러, 만성 치주염 환자의 가장 깊은 치주 탐침을 보이는 부위와 치주적으로 건강한 사람의 표본 채취 부위의 통계적 비교에서 또한 만성 치주염 환자의 가장 깊은 치주 탐침을 보이는 부위와 가장 얕은 치주 탐침을 보이는 부위를 비교했을 때 통계적 유의성을 보이는 모든 균에서 통계적 유의성(P<0.05)이 나타났으며, 부가적으로 Actinobaculum에서도 통계적 유의성이 발견되었다.
05) 있는 차이를 보였다. 이러한 통계적 유의성은 A.parvulum, T.forsythensis(B.forsythus), C.gracilis, C.rectus, D.invisus, F.alocis, F.nucleatum, O.profuse, M.micros (P.micros), P.endodontalis, P.gingivalis, P.intermedia, T.denticola, C.gingivalis, T.socranski의 세균종에서 나타났다. 아울러, 만성 치주염 환자의 가장 깊은 치주 탐침을 보이는 부위와 치주적으로 건강한 사람의 표본 채취 부위의 통계적 비교에서 또한 만성 치주염 환자의 가장 깊은 치주 탐침을 보이는 부위와 가장 얕은 치주 탐침을 보이는 부위를 비교했을 때 통계적 유의성을 보이는 모든 균에서 통계적 유의성(P<0.
05)를 보였다. 이상의 결과를 종합하면, 치주염이 진행된 부위에서 발생빈도가 높으면서, 정상인에 비해 치주 환자에서 유의성 있는 차이를 가지는 균은 T. forsythensis(B.forsythus), C.rectus, P.gingivalis, F.alocis로서, 이들 치주질환 원인균들이 한국 성인 만성 치주염과 깊은 관련성이 있다는 것을 나타낸다. 이 중, T.
이전의 연구에서 주된 치주질환 원인균으로 알려져 있는 T.forsythensis(B.forsythus), C.retus, F.nucleatum, P.gingivalis가 만성 치주염 환자의 치주염에 이환된 깊은 탐침 부위에서 80% 이상의 발생 빈도로 나타났으며, F.alocis, P.endodontalis 또한 80% 이상의 발생 빈도를 보였다. 아울러, Q.
현재의 연구 결과에서 T.forsythensis(B.forsythus), C.rectus, F.alocis, F.nucleatum, P.endodontalis, P.gingivalis가 만성 치주염 환자의 치주염에 이환된 깊은 탐침 부위에서 80% 이상의 발생 빈도로 나타났으며, 만성 치주염 환자의 깊은 탐침 부위와 얕은 탐침 부위를 정상인의 건강한 부위와 통계적으로 비교했을 때, forsythensis(B.forsythus), C.rectus, D.invisus, F.alocis, P.gingivalis, T.denticola균에서 공통적으로 유의성 있는 차이(P<0.05)를 보였다.
후속연구
결론적으로, 현재의 연구 결과를 통해서 T.forsythensis(B.forsythus), C.rectus, P.gingivalis, F.alocis가 한국인 만성 치주염에서 주요한 치주질환 원인균이라고 추정할 수 있으며, 한국인 만성 치주염 환자에서 얻어진 현재의 결과는 한국인의 특성에 맞는 치주염의 치료법 개발에 응용되어 기여할 수 있을 것이라 사료된다.
이를 파악하기 위한 한 가지 방법으로, 세균의 수가 어느 한도 이상으로 증가하면 비가역적인 치주조직 파괴가 일어날 수 있는데, 이런 경우 특정 세균의 상대적 중요성은 그 양을 측정함으로써 간접적으로 알 수 있을 것이다. 그러나, 현재 연구는 치은연하 세균의 유무만을 파악하는 정성적 분석으로 정량적 분석에 의한 특정 세균의 상대적 가중치를 결정하는 데는 한계가 있다. 최근에 real-time PCR과 같은 방법에 의해 치주질환 원인균의 수를 파악함으로써 복잡한 치주질환의 원인을 이해하려는 노력이 행해지고 있으며37,38).
여기서 한가지 생각 해 볼 점은, 전체에서 차지하는 균의 양이 중요한지 적은 양이라도 균 자체의 존재가 더 큰 효과를 가져오는 지는 아직까지 불명확하게 남아 있다는 것이다. 그러므로, 각 치주질환 원인균의 중요도 및 기여도에 대한 정확한 분석을 위해서는 현재 연구를 토대로 한 정량적 분석이 부가적으로 이루어져야 할 것이다.
이를 통해, 치주질환 원인균은 치주질환의 유무뿐만 아니라 질환의 정도와도 관련된다고 제시되었다7). 그러므로, 만성 치주염 환자의 치주낭 깊이에 따른 균의 분포를 치주적으로 건강한 사람에서의 치주균 분포와 비교함으로써 현재 알려진 치주질환 원인균 중 어떤 균이 더욱 치주염과 관련되는지 평가할 수 있을 것이다.
이전의 연구8,42,43)에서 보고된 바와 유사하게 정상인의 측정 부위보다 치주염 환자의 정상 부위에서 상당히 높은 비율로 치주 질환 원인균의 발생 빈도가 나타나기 때문이다. 그러므로, 임상적으로 건강하게 보일지라도 치주적으로 건강한 사람과는 달리 치주염 환자에서는 이미 치은연하 균의 조성이 이미 바뀌어 있을 수 있기 때문에, 치주염 환자에서 건강하게 나타나는 얕은 치주 탐침 부위는 잠재적인 치주염 부위로 간주하는 것이 보다 바람직하다고 보여지며, 정상인의 건강한 부위와는 다르게 다루어져야 할 것으로 사료된다. 이와 관련하여, 치주질환에 이환된 환자의 건강한 부위가 치주적으로 건강한 사람의 유사한 부위보다 치주질환의 발생과 진행에 더 취약할 수 있다고 언급된 바가 있다42).
아울러, 이러한 같은 치주원인균에 대한 다양한 환자 반응은 유전적으로 결정되는 것으로 보여지다고 보고되었다8). 그러므로, 한국인 환자에서는 A.actinomycetemcomitans 균의 민족적 차이가 존재할 수 있다고 생각할 수 있으며, 이에 대한 진행된 연구가 필요한 것이다.
그러므로, 현재의 결과가 한국인의 치주균 분포를 대표한다고 말할 수는 없을 것이다. 보다 정확한 표본을 얻고 더욱 신빙성 있는 결과를 얻기 위해서는 보다 세밀한 역학 연구가 필요한 것으로 사료된다.
alocis는 치주질환 관련이 있는 주된 원인균으로 진단되어야 한다고 제안되었다36). 부가적인 연구가 필요하겠지만, 한국 만성 치주염 환자에서도 F.alocis가 새로운 주요한 치주 질환 원인균으로 고려되어야 할 필요성이 있을 것이다. 결론적으로 서구에서 치주 질환 원인균으로 추정되는 것과 유사한 세균이 한국 성인 만성 치주염 환자에서도 높은 빈도로 발견되는 것을 확인할 수 있었다.
그러므로, 치은연상, 치은연하 세균의 조성을 바꾸는 것은 치주치료나 질환의 정도에 영향을 미치며, 역으로 숙주나 국소적인 서식환경의 변화 또한 세균의 조성과 활성에 영향을 미치게 된다. 이러한 관계를 파악하는 것이 치주질환의 원인 요소와 기여 인자를 진단하는데 도움이 되며 결과적으로 치료를 최적화 할 수 있게 한다. 이렇듯 세균과 국소적 서식환경은 서로 밀접하게 연관성을 지니며 변하기 때문에 각각을 파악하는 것이 치주질환을 파악하고 치료를 결정하는 데 중요하다.
아울러, 치주낭 내의 국소적 환경은 매우 역동적이어서, 한 가지 특정 세균의 거주에 의한 환경적 변화가 다른 세균에 미치는 영향이 다양하여 특정 균에 의한 효과가 나타나기는 쉽지 않다. 이를 파악하기 위한 한 가지 방법으로, 세균의 수가 어느 한도 이상으로 증가하면 비가역적인 치주조직 파괴가 일어날 수 있는데, 이런 경우 특정 세균의 상대적 중요성은 그 양을 측정함으로써 간접적으로 알 수 있을 것이다. 그러나, 현재 연구는 치은연하 세균의 유무만을 파악하는 정성적 분석으로 정량적 분석에 의한 특정 세균의 상대적 가중치를 결정하는 데는 한계가 있다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
F.alocis란 무엇인가?
F.alocis는 그람 양성 혐기성 균으로써, 근관 감염과 관련된 균으로 알려져 왔으나, 최근에 만성 치주염 환자에서 상당히 증가하는 것으로 밝혀진 새로운 치주질환 원인균이다23,35). 아울러, 기존의 배양법이 아닌 새로운 방법에 의한 치은연하 세균의 동정법이 발달하면서 치주질환 원인균으로 여겨지지 않았던 새로운 세균 종들이 발견되어지고 있는데, 최근에 F.
치주질환 원인균으로 인식되는 균은 무엇이 있는가?
치주염은 복합세균감염으로 치주조직의 파괴와 골흡수를 야기해 치아가 상실되는 주된 요인이다. 지금까지 확인된 500여 종 이상의 구강 세균 중에 Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tanerella forsythensis(이전 Bacteroides forsythus), Prevotella intermedia, Treponema denticola, Fusobacterium nucleatum, Micromonas micros(이전 Peptostreptococcus micros), Eikenella corrodens, Campylobacter rectus 등이 치주질환 원인균으로 인식되어지고 있다1).
치주질환 원인균의 동정 및 진단 시 배양법의 한계점은 무엇인가?
배양법만이 새로운 균을 확인할 수 있으며, 치주균의 향균제 민감도를 조사할 수 있고, 살아있는 균의 양적 측정을 가능하게 할 수 있다. 그러나, 여러 가지 한계점이 존재하는데, 세균의 수가 매우 적은 경우 배양이 안 되거나, 배양 조건이 확립되지 않은 균을 배양할 수 없는 점 등이다. 이러한 점을 극복하기 위한 방법으로 암시야 현미경 사용, 효소 면역학적 방법, 핵산 probe, polymerase chain reaction(PCR) 등에 의한 방법이 개발되었다1).
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