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문제 정의
- 따라서 이 연구는 어린이 및 청소년의 구강내 치태에서 P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola, A. actinomycetemcomitans, F. nucleatum 등 5종의 치주질환 원인균을 realtime PCR을 이용하여 출현율과 양을 측정하고, 측정한 치태지수 및 치은염과의 상관관계를 조사하여 상관성을 평가해보고자 하였다.
- 최근 real-time PCR 기법을 이용하여 구강내 치태에서 특정 세균의 존재여부를 알 수 있을 뿐 아니라 정량적 분석이 가능하게 되었다. 이 연구는 real-time PCR 기법을 이용하여 8-18세의 청소년에서 치주질환 원인균의 조성을 알아보고자 전신질환이 없는 어린이 및 청소년 65(남자 32명, 여자 33명)명을 대상으로 치은연하의 치태를 채취하여 P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola, A. actinomycetemcomitans, F. nucleatum 등 5종의 치주질환 원인균의 출현율과 그 양을 측정하고, 또한 함께 측정한 치태지수 및 치은지수와의 상관관계를 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- PCR 조건의 표준화를 위해 5종류의 혐기성세균을 각각의 배지에 혐기적으로 배양한 후 표준균주의 세균수를 측정한 후 시료와 같은 방법으로 1 ml를 튜브에 취하여 원심한 후 PBS로 2회 세척하고 PBS 0.1 ml로 suspension하여 10배 농축시킨 후 DNA를 추출한 다음 102~108 까지 10배씩 연속적으로 희석하여 real-time PCR 정량에 필요한 표준곡선을 작성하였다. 5종 세균의 sense primer와 antisense primer (400 nM) 각각 1 ㎕, dual labelled probe (5‘-FAM, BHQ-3')가 이용되었다17)(Table 2).
- template DNA 3 ㎕에 2배의 QuantiTect Probe(Qiagen GmbH, Hilden, Germany) 12.5 ㎕, PCR Master Mix(HotStarTaq polymerase, QuantiTec Probe PCR buffer, dNTP mix including dUTP, 발색제 ROX™, 8mM MgCl2), 3차 멸균수를 6.5 ㎕ 첨가하여 최종 용량 25 ㎕가 되게 하였다.
- 구강위생상태를 측정하기 위해서 치태지수 (Plaque index of Silness and Loe¨)15)를 사용하였으며 측정부위는 상악 좌우 제1대구치의 협측, 상악 우측 중절치와 하악 좌측 중절치의 순측, 하악 좌우 제1대구치의 설측이었다.
- 그리고 36 well에 분주하고 Rotor-Gene 3000™ Real-time Thermal Cycler (Corbett research, Sydney, Australia)를 이용하여 중합효소연쇄반응을 시행하였다.
- 본 연구대상으로는 초,중,고교에 재학 중이며 전신질환이 없는 학생 65(남자 32명, 여자 33명)명을 조사대상으로 하였다. 연구대상의 평균 연령은 12.6세였으며 연령 범주는 혼합치열기, 영구치열기 등을 고려하여 4개의 범주로 구분하였다(Table 1).
- 치태시료를 얻기 위해 대상자의 하악 우측 제1대구치 또는 제2유구치의 근심협측부위에서 멸균된 이쑤시개를 사용하여 조심스럽게 치은부위의 치태를 채취하였다. 채취한 치태는 멸균된 0.
- 제 1대구치가 없는 경우는 인접 제 2유구치나 제 2 소구치를 검사하였다. 치태침착 정도는 0-3점 (0점: 치태가 없음, 1점: 치은변연을 따라 탐침시 묻어나는 정도, 2점: 눈에 보이는 상태, 3점: 치태가 많은 경우)으로 구분하였다. 치주조직의 염증 상태를 측정하기 위해 치은지수 (Gingival index of Loë)16)를 사용하였으며, 조사 치아는 치태지수와 같다.
대상 데이터
- 본 연구대상으로는 초,중,고교에 재학 중이며 전신질환이 없는 학생 65(남자 32명, 여자 33명)명을 조사대상으로 하였다. 연구대상의 평균 연령은 12.
- 를 사용하였으며 측정부위는 상악 좌우 제1대구치의 협측, 상악 우측 중절치와 하악 좌측 중절치의 순측, 하악 좌우 제1대구치의 설측이었다. 제 1대구치가 없는 경우는 인접 제 2유구치나 제 2 소구치를 검사하였다. 치태침착 정도는 0-3점 (0점: 치태가 없음, 1점: 치은변연을 따라 탐침시 묻어나는 정도, 2점: 눈에 보이는 상태, 3점: 치태가 많은 경우)으로 구분하였다.
데이터처리
- 치주질환 원인균의 연령에 따른 출현율을 비교하기 위해 카이제곱 검정을 시행하였다. 그리고 치태지수, 치은지수와 치주질환 원인균의 상관성을 조사하기위해 Pearson 상관계수를 계산하였다.
- 이 때 사용한 real-time PCR의 조건은 최초 변성을 위해 95℃에서 15분간, 이후 45번의 중합효소연쇄반응 cycle은 95℃에서 15초, 58℃에서 1분간 시행하였다. 데이터 분석은 Rotor-Gene analysis software version 6.0을 이용하였다. Cycle threshold (CT)는 알려진 숫자의 DNA농도의 대수기에서 시작하며, 세균수에 대한 표준곡선에 의해서 시료당 세균수가 측정이 되었다(Fig.
- 위 데이터는 SPSS 12.0을 이용하여 통계학적 평가를 시행하였다. 치태지수와 치은지수를 나이군에 대해서 비교하기 위해 ANOVA를 시행하였고, 사후검정으로 Tukey’s studentized range test를 시행하였다.
- 치태지수와 치은지수를 나이군에 대해서 비교하기 위해 ANOVA를 시행하였고, 사후검정으로 Tukey’s studentized range test를 시행하였다. 치주질환 원인균의 연령에 따른 출현율을 비교하기 위해 카이제곱 검정을 시행하였다. 그리고 치태지수, 치은지수와 치주질환 원인균의 상관성을 조사하기위해 Pearson 상관계수를 계산하였다.
- 치태지수와 치은지수를 나이군에 대해서 비교하기 위해 ANOVA를 시행하였고, 사후검정으로 Tukey’s studentized range test를 시행하였다.
이론/모형
- 치주조직의 염증 상태를 측정하기 위해 치은지수 (Gingival index of Loë)16)를 사용하였으며, 조사 치아는 치태지수와 같다.
성능/효과
- 1. 치태지수의 평균은 1.33이었으며, 치은지수의 평균은 0.97이었다. 치태지수는 나이가 증가할수록 낮아졌다 (p<0.
- 2. 치주질환 원인균의 출현율은 P. gingivalis 61.5%, T. forsythia 53.8%, T. denticola 29.2%, A. actinomycetemcomitans 15.4%, F. nucleatum은 100%의 출현율을 보였다. P.
- 3. 정량적 분석에서 F. nucleatum은 모든 대상자에서 다른 세균보다 많은 양이 관찰되었다. 연령에 따른 치주질환 원인균의 양에는 유의한 차이가 없었지만 치주질환 원인균이 서로 상관성을 가지고 공존하고 있었다.
- 4. 치태지수와 치은지수는 F. nucleatum의 양과 유의한 상관성이 있었으며, 치태지수는 치은지수와 유의한 상관성이 있었다. T.
- P. gingivalis, T. denticola는 10세 이후 출현율이 증가하는 양상을 보였고 A. actinomycetemcomitans는 어린 연령군에서 더 많이 출현하였다 (p<0.05) (Table 4).
- P. gingivalis, T. denticola는 10세 이후 출현율이 증가하는 양상을 보였고 A. actinomycetemcomitans는 어린 연령군인 8-10세군에서 출현율이 높았다(p<0.05).
- 7). T. forsythia는 A. actinomycetemcomitans, T. denticola양과 강한 상관성을 보였으며(상관계수 0.81, 0.79), T. denticola양과 A. actinomectemcomitans도 강한 상관관계를 가지고 있었다(상관계수 0.92). 연령별로는 11-13세군에서 P.
- nucleatum의 양과 유의한 상관성이 있었으며, 치태지수는 치은지수와 유의한 상관성이 있었다. T. forsythia는 A. actinomycetemcomitans, T. denticola양과 강한 상관성을 보였으며(상관계수 0.81, 0.79), T. denticola양과 A. actinomycetemcomitans도 강한 상관관계를 가지고 있었다(상관계수 0.92).
- gingivalis의 수, 치주낭 깊이, 탐침후 출혈이 감소함을 보고하였다. T. forsythia는 A. actinomycetemcomitans, T. denticola양과 강한 상관성을 보였으며, T. denticola양과 A. actinomectemcomitans도 강한 상관관계를 보이고 있어 이러한 치주질환 원인균의 공존은 추후 치주질환을 가지게 될 가능성을 높일 수 있다고 추정할 수 있다.
- real-time PCR을 이용한 치주질환 원인균의 양적 검사에서 F. nucleatum은 모든 대상자에서 많은 수의 세균이 분포하였으며 다른 세균보다 더 많은 양이 관찰되었다. A.
- real-time PCR을 이용한 치주질환 원인균의 출현율은 P. gingivalis 61.5%, T. forsythia 53.8%, T. denticola 29.2%, A. actinomycetemcomitans 15.4%를 나타내었다. 각 균의 연령별 비교를 보면 F.
- 4%를 나타내었다. 각 균의 연령별 비교를 보면 F. nucleatum은 모든 연령에서 100%의 출현율을 보였다. P.
- 이상의 연구인 real-time PCR을 이용한 치주질환 원인균의 정성 및 정량적 검사를 통해 어린 나이에서부터 치주질환 원인균들이 다양하게 분포하고 있음을 알 수 있었다. 또한 나이가 증가함에 따라 치주질환 원인균의 출현율은 증가하는 양상이었으며, 연령에 따른 치주질환 원인균의 양에는 유의한 차이가 없었지만 치주질환 원인균이 서로 상관성를 가지고 공존하고 있음을 발견하였다. 또한 F.
- 이를 통해 치주치료를 평가하는 데 있어 치주상태와 연관하여 세균의 절대적 양 및 상대적 양을 측정하는 것이 중요하다고 주장하였다. 본 연구에서는 치은지수와 F. nucleatum간에 유의한 상관성을 보였고 치태지수와 치은지수간에 상관성을 보였는데 이는 F. nucleatum의 양이 많을수록, 그리고 치태가 많이 축적되어있을 수록 치은염이 증가함을 의미하였다. Asai 등39)은 T.
- nucleatum의 치주낭내 출현율과 조성을 평가했는데, 두 균 모두 깊은 치주낭에서 잘 자라며, 두 균이 서로 공존관계를 가진다고 보고하였다. 본 연구에서도 P. gingivalis와 T. forsythia가 함께 출현하는 비율은 33%였으며, T. forsythia와 T. denticola가 함께 출현하는 경우는 20%, P. gingivalis와 T. denticola가 함께 출현하는 경우는 18%, red complex로 분류되는 세 종류의 세균이 모두 출현한 경우가 12%로 나타나 치주질환 원인균들이 서로 공존하는 양상을 보였다. Kawada 등10)은 치주상태와 P.
- gingivalis의 수를 검사함으로써 전통적 중합효소연쇄반응과 real-time PCR sensitivity를 비교하였는데, real-time PCR이 더 민감했다고 하였다37). 본 연구의 8-18세 대상자의 real-timePCR을 이용한 연구에서는 P. gingivalis 61.5%, T. forsythia 53.8%, T. denticola 29.2%, A. actinomycetemcomitans 15.4%를 나타내어 정등의 보고보다 낮았으나 다른 연구자들보다는 높은 출현율을 보였는데 대상자들의 연령이 증가된 것과 real-time PCR이 더 민감한 방법이라는 주장도 그 이유의 하나로 설명할 수 있다. Suzuki 등36)은 T.
- 어린 나이군 부터 치주질환 원인균들이 다양하게 분포하고 있었으나, 나이가 증가함에 따라 조사한 5종의 치주질환 원인균의 양은 유의한 차이를 보이지 않았다(p>0.05).
- 연령별로는 11-13세군에서 P. gingivalis가 T. forsythia, T. denticola A. actinomycetemcomitans의 양과 강한 상관관계를 보이고 있었다(상관계수 0.94, 0.99, 0.99)(p<0.05).
- 이상의 연구인 real-time PCR을 이용한 치주질환 원인균의 정성 및 정량적 검사를 통해 어린 나이에서부터 치주질환 원인균들이 다양하게 분포하고 있음을 알 수 있었다. 또한 나이가 증가함에 따라 치주질환 원인균의 출현율은 증가하는 양상이었으며, 연령에 따른 치주질환 원인균의 양에는 유의한 차이가 없었지만 치주질환 원인균이 서로 상관성를 가지고 공존하고 있음을 발견하였다.
- 청소년의 구강 내 치태에는 치주질환을 유발하는 세균들이 다양하게 공존하고 있었으며, 치은염을 나타내는 치은지수는 치태지수와 F. nucleatum의 양과 유의한 상관성이 있었다.
- 치태의 침착정도를 나타내는 치태지수는 F. nucleatum의 양과 유의한 상관성이 있었으며(상관계수 0.46), 치은염을 나타내는 치은지수 또한 F. nucleatum의 양과 유의한 상관성이 있었다(상관계수 0.3). 치태지수는 치은지수와 유의한 상관성이 있었다(상관계수 0.
- 3). 치태지수는 치은지수와 유의한 상관성이 있었다(상관계수 0.7). T.
- 05). 한편 P. gingivalis와 T. forsythia가 함께 출현하는 비율은 33%였으며, T. forsythia와 T. denticola가 함께 출현하는 경우는 20%, P. gingivalis와 T. denticola가 함께 출현하는 경우는 18%, red complex로 분류되는 세 종류의 세균이 모두 출현한 경우가 12%였다(Table 5).
후속연구
- 또한 나이가 증가함에 따라 치주질환 원인균의 출현율은 증가하는 양상이었으며, 연령에 따른 치주질환 원인균의 양에는 유의한 차이가 없었지만 치주질환 원인균이 서로 상관성를 가지고 공존하고 있음을 발견하였다. 또한 F. nucleatum의 양이 많을수록, 그리고 치태가 많이 축적되어있을 수록 치은염이 증가함을 나타내고 있어, 추후 청소년에서도 정확한 치주건강 상태를 평가함에 있어 real-time PCR을 이용한 치주질환 원인균의 주기적인 정성 및 정량적 검사가 도움이 되리라 사료된다.
- 이는 유치열에 존재했던 치주질환 원인균들이 치주조직에 잔존하여 새롭게 영구치열이 형성될 때 재집락을 이루기 때문이라고 추정되고 있다14). 어린이 및 청소년의 치은연하 치태에서 치주질환 원인균의 양을 측정하는 것은 추후 치주질환의 예측 및 진단, 그리고 치료효과의 평가에 기여할 수 있다.
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