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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 아토피 크림과 자운고(이하 A-J) 도포 후 아토피 피부염 치유에 미치는 효과를 평가하기 위해 12주령의 발진된 NC/Nga mouse의 등부위에 A-J를 도포하였고 아토피 발진 억제에 미치는 영향을 실험적으로 규명하고자 in vivo에서 NC/Nga mouse의 혈청 중 IgE 수준과 clinical score 및 total IgG 수준을 분석하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 7주령의 NC/Nga mouse를 1주일 동안 적응시킨 후 미리 atopy dermatitis가 발진된 18주령의 NC/Nga mouse와 2주간 같은 공간에서 동시 사육하여 항원감작을 하였다. 2주 후 눈에서 capillary 관을 이용하여 100 ㎕의 혈액을 채혈한 후마취제인 chloral hydrate (10%)로 마취한 후 귀와 등 쪽 목 부위를 깨끗하게 제모한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 그리고 중앙실험동물에서 제공하는 Biostir mite antigen cream (BMAC)은 Dermatophagoides f arinae crude extract (mite antigen, lyophilize d)를 진드기 항원으로 제조된 것으로 진드기 항원을 0.
- BMAC는 1주에 2회 3주간 등 부위 및 목 부분에 고르게 도포하였고 도포 2～3시간 전에 4% SDS 용액을 분무하여 피부층을 파괴하였다 (scheme 1). 2주후 등부분에 피부염이 충분히 유발되면서 긁는 행동이 심화되면 육안 평가를 실시하였다.
- 7주령의 NC/Nga mouse를 1주일 동안 적응시킨 후 미리 atopy dermatitis가 발진된 18주령의 NC/Nga mouse와 2주간 같은 공간에서 동시 사육하여 항원감작을 하였다. 2주 후 눈에서 capillary 관을 이용하여 100 ㎕의 혈액을 채혈한 후마취제인 chloral hydrate (10%)로 마취한 후 귀와 등 쪽 목 부위를 깨끗하게 제모한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다.
- BMAC 도포 후 1-2주 후 동시에 매일 각각 A-J를 12주부터 15주까지 4주간 오전 11시에 1 회 등부분에 골고루 도포 하였다. 또한 양성 대조 약물로 FK506 (tacrolimus) 0.
- 5% TWeen 20이 포함된 ointment base 로 제작되었다. BMAC는 1주에 2회 3주간 등 부위 및 목 부분에 고르게 도포하였고 도포 2～3시간 전에 4% SDS 용액을 분무하여 피부층을 파괴하였다 (scheme 1). 2주후 등부분에 피부염이 충분히 유발되면서 긁는 행동이 심화되면 육안 평가를 실시하였다.
- 5% Tween 20이 포함된 PBS에 10 농도로 용해 후 ointment base에 혼합하여 처리하였고, 12주령 이상된 NC/Nga mouse의 눈에서 capillary tube 를 사용하여 채혈하여 혈장 내 IgE 수준을 측정후 제모제를 이용하여 등 부위의 털을 모두 제거한 후 24시간 지난 다음 4% SDS로 피부층을 NC/Nga mouse의 등 부위 및 귀 부위에 2회 100 ㎎/mouse 농도로 도포하였다. BMAC는 유발기간의 기준은 약 3 주간 (총 6회)으로 최종적으로 전체 600㎎ 정도 도포하였고, 아토피성 피부발진이 유발된 NC/Nga mouse의 발진의 임상평가는 육안평가로 항목은 erythema/hemorrhage (소양행동을 동반한 홍반), dryness/scarring(인설 및 가피), edema(부종), excoriation/erosion(표피박탈/미란), lichenification(태선화)로 하여 각 단계의 점수의 총합으로 나타내었다.
- . BMAC를 바르고 약물 투여 종료 후 15 주령에서 육안평가를 실시하였다. 육안평가 항목은 erythema/hemorrhage(소양행동을 동반한 홍반), dryness/scarring(인설 및 가피), edema (부종), excoriation/erosion(표피박탈/미란), lichenification(태선화) 5가지 항목으로 하고, 육안평가 결과는 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타냈다.
- NC/Nga mouse의 눈에서 10주, 12주, 15주에 capillery 관을 이용하여 약 100 ㎕의 혈액을 채혈한 후 원심분리기 6, 500 rpm에서 20분간 원심분리한 후 30 ㎕의 혈청을 분리하였고 혈청은 취하여 -70℃에 냉동 보관하였다. NC/Nga mouse의 혈청 내 IgE와 IgG1농도 측정은 enzyme-linked immuno-sorbent assay로 IgE 수준을 측정하였다.
- Shown are back of BMAC-ointment NC/Nga mice (control 1-2), BMAC plus FK506 (0.3%)-ointment NC/Nga mice and BMAC plus A-J (200 ul/mouse)-ointment NC/Nga mice for 3 weeks.
- 다시 2회 수세 후 완충용 액으로 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugated 100 ㎕를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다. TMB 기질을 100 ㎕씩 분주하고 암소에서 30분간 방치한 후 100 ㎕의 stop 용액을 처리한 후 ELISA leader 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- NC/Nga mouse의 혈청 내 IgE와 IgG1농도 측정은 enzyme-linked immuno-sorbent assay로 IgE 수준을 측정하였다. 각 well에 NC/Nga mouse에서 8주, 12주, 그리고 16주에 채혈한 혈청 5 ㎕ (1/10 dilution)와 dilution buffer 45 ㎕를 혼합 하여 각 well에 분주하고, 2시간 동안 25℃ 실온에서 방치한 후 2회 washing 완충용액으로 세척한 다음 antibody biotin-IgE conjugated를 넣고 2시간 방치하였다. 다시 2회 수세 후 완충용 액으로 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugated 100 ㎕를 처리하고 1시간 실온에서 방치한 후 다시 세척하였다.
- 육안평가 항목은 erythema/hemorrhage(소양행동을 동반한 홍반), dryness/scarring(인설 및 가피), edema (부종), excoriation/erosion(표피박탈/미란), lichenification(태선화) 5가지 항목으로 하고, 육안평가 결과는 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타냈다. 각각의 항목은 없음 (0), 약함 (1), 중증도 (2), 심함 (3)으로 채점하였으며 최소 0 점에 서, 최고 15 점사이의 점수를 측정하였다.
- 3%를 매주 5회 발진된 등부위에 도포하였다. 그리고 최종 15주 째에 관능평가를 실시한 다음 혈액을 채혈하고등 부위의 피부를 절제하여 10% 포르말린 용액에 담아 보관하였다.
- 동물은 실험당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12시간 (light-dark cycle)의 환경에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- BMAC 도포 후 1-2주 후 동시에 매일 각각 A-J를 12주부터 15주까지 4주간 오전 11시에 1 회 등부분에 골고루 도포 하였다. 또한 양성 대조 약물로 FK506 (tacrolimus) 0.3%를 매주 5회 발진된 등부위에 도포하였다. 그리고 최종 15주 째에 관능평가를 실시한 다음 혈액을 채혈하고등 부위의 피부를 절제하여 10% 포르말린 용액에 담아 보관하였다.
대상 데이터
- Corp.; Cosnuvo #564-11, Gajwa-Dong, Seo-Gu, Inchon, Korea에서 구입하여 사용하였으며 그 배합은 Table 2와 같다.
- NC/Nga mouse는 태어난 후 어렸을 때부터 일반사육환경(conventional system)에서 노출되어 자라게 되면 10주부터 14주령까지 사람에서의 아토피성 피부염과 유사한 병변이 딱지가 앉은 상처 및 작은 결정의 병변이 관찰되는 동물로서 아토피 피부염 모델동물로 사용되고 있다. 본 시험에서 양성대조군으로는 FK506(Tacrolimus) 연고를 사용하였다. NC/Nga mouse에서 0.
- 본 실험에 사용된 기기는 열탕추출기(대웅, Ko rea), rotary vaccum evaporator(Büchi B-480, Switzerland), freeze dryer(EYELA FDU-540, Japan), CO2 incubator(Forma scientific Co., U.S.A.), clean bench(Vision scientific Co., Ko rea), autoclave(Sanyo, Japan), micro-pipet(Gilson, France), water bath(Vision scientific Co., Korea), vortex mixer(Vision scientific Co., Korea), spectrophotometer (Shimazue, Japan), centrifuge(Sigma, U.S.A.), deep-freezer (Sanyo, Japan), thermocycler system(MWG Biotech., Germany), ice-maker (Vision scientific Co., Korea), homogenizer(OMNI, U.S.A.), plate shaker(Lab-Line, U.S.A.) 및 ELISA reader(Molecular Devices, U.S.A.) 등을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 시약은 diethyl pyrocarbona te(DEPC), 3-4, 5-dimethyl-thiazol-2, 5-carb oxymethoxyphenyl-2, 4-sulfophenyl- 2H-tet razolim(MTS), 2, 7, -dichl- orodihydrofluore scin diacettate (DCFH-DA), complete adjuvent, chloroform, collagenase, RPMI-1640 배양액, isopropanol, 적혈구 용혈액(RBC lysis solution), ethidium bromide(EtBr), dulbecco's phosphate buffered saline(D-PBS), formaldehyde, lamide, magnesium chloride(MgCl2)는 Sigma사 (U.S.A.) 제품을 사용하였으며 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)은 Hyclone사(Logan, U.S.A.) 제품을, anti-CD3-PE(phycoerythrin), anti-CD4-FITC(fluorescein isothiocyanate), anti-Gr1-PE, anti-CD8-FITC, anti-CD25 -PE, anti-CD28-PE, anti-CD11b-FITC, antiIgE-FITC anti-B220-PE, anti-CD69-FITC, propidium iodide(PI)와 RNase는 Pharmingen사 (Torreyana, U.S.A.) 제품을, rhIL-1β, rhTNFα는 R & D system사(Minneapolis, U.S.A.) 제품을 사용하였으며 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 아토피 크림의 아로마 오일은 Fine Korea. Corp.
- 본 실험에 사용한 자운고의 구성은 『春林軒膏 方便覽』10) 에 준하였으며, 사용한 약재들은 대전 대학교 부속 한방병원에서 구입하여 정선하여 사용하였고 그 내용과 1 g 당 조성은 Table 1과 같다.
- 암컷 8주령의 SPF NC/Nga mouse (15-20g) 는 Charles River Japan (Yokohama, Japan)사 에서 공급받았다. 동물은 실험당일까지 고형사료(항생제 무첨가, 삼양사료 Co.
데이터처리
- 다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean± standard error로 기록하였고, 유효성 검증은 Student's T-test 분석방법을 이용하여 결정하 였다.
이론/모형
- NC/Nga mouse의 눈에서 10주, 12주, 15주에 capillery 관을 이용하여 약 100 ㎕의 혈액을 채혈한 후 원심분리기 6, 500 rpm에서 20분간 원심분리한 후 30 ㎕의 혈청을 분리하였고 혈청은 취하여 -70℃에 냉동 보관하였다. NC/Nga mouse의 혈청 내 IgE와 IgG1농도 측정은 enzyme-linked immuno-sorbent assay로 IgE 수준을 측정하였다. 각 well에 NC/Nga mouse에서 8주, 12주, 그리고 16주에 채혈한 혈청 5 ㎕ (1/10 dilution)와 dilution buffer 45 ㎕를 혼합 하여 각 well에 분주하고, 2시간 동안 25℃ 실온에서 방치한 후 2회 washing 완충용액으로 세척한 다음 antibody biotin-IgE conjugated를 넣고 2시간 방치하였다.
성능/효과
- 1. BMAC의 NC/Nga mouse에 3주간 도포로 피부발진이 유도 되었다.
- 12주령의 NC/Nga mouse의 등부위를 4% SDS용액을 분무하고 아토피성 피부염 유발제제 (BMAC)를 1주에 2회 2주간 도포하기 전과 후의 사진으로 아토피성 피부염 유발제제를 2주간 도포한 사진에서는 소양행동을 동반한 홍반, 부종, 인설, 가피, 태선화 등의 증상이 뚜렷하게 확인되 었다. 피부발진이 일어난 18주된 AD-NC/Nga와 2주간 같은 cage에서 동시 사육한 실험동물에서도 약 80% 정도가 mite 크림 도포 후 피부발진이 의미 있게 유도되었다.
- 2. FK506과 A-J 도포로 대조군에 비하여 clinical skin severity score를 유의성 있게 감소시켰다.
- 3. FK506과 A-J 도포로 대조군에 비하여 혈청 중 IgE, 그리고 IgG1 수준을 유의성 있게 감소시켰다.
- 3%)-ointment NC/Nga mice and BMAC plus A-J (200 ul/mouse)-ointment NC/Nga mice for 2 weeks. A total clinical severity score for AD-like lesions was defined as the sum of the individual scores graded as 0 (none), 1 (mild), 2 (moderate) and 3 (severe) for each of five signs and symptoms (erythema/hemorrhage, scarring/dryness, edema, excoriation/erosion and lichenification) on the three parts of the body: ear, face and head and back.
- clinical skin severity를 측정한 결과, 양성대 조군인 FK506과 A-J 도포군에서는 대조군에 비하여 유의성 있게 clinical skin severity score 감소를 관찰할 수 있었다. B 세포의 분화되는 과정에서 분비되어 결합하여 염증 반응을 유도하는 IgE와 Th2 세포에서 분비되어 B 세포의 분화를 촉진하는 IL-4에 의하여 유도되는 IgG1의 수치를 측정한 실험에서 total IgE와 IgG1의 수치 결과는 대조군이 IgE와 IgG1의 수치가 급격한 증가를 나타내었는데 FK506과 A-J 도포군에서는 대조군에 비하여 감소를 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 FK506과 A-J 도포군이 NC/Nga mouse의 B 세포 알레르기 면역반응을 억제하여 B 세포 분화에 수반되는 IgE와 IgG1의 수치를 억제하는 것으로 생각된다.
- Fig.2에서 같이 Dermatophagoides farinae crude extract (진드기 항원, mite extract, lyophilized, BMAC)를 NC/Nga mouse에 3주간 도포하고 약물 도포 2주 후 등 피부를 사진으로 촬영한 것으로 소양행동을 동반한 홍반, 부종, 인설, 가피, 태선화 등의 증상이 대조군(control 1-2)에서 확인되었다. 0.
- Fig.4에서 보는 바와 같이 BMAC를 NC/Nga mouse에 3주간 도포하고 최종 5주후 등 피부에 나타난 소양행동을 동반한 홍반, 부종, 인설, 가피, 태선화 등의 단계를 0 (none), 1 (mild), 2 (moderate), 3 (severe)으로 개체마다 평가 기록하여 피부발진 점수로 평가한 결과 대조군의 skin clinical score는 mite extract를 도포하지 않은 정상군에 비하여 10배 이상 skin clinical score 값이 증가를 나타내었고 FK506 0.3% 도포군은 대조군에 비해 5배 이상 감소를 나타내었고 (p<0.001) A-J 도포군은 대조군에 비해 skin clinical score가 유의성 있는 감소를 나타내었다 (p<0.05).
- clinical skin severity를 측정한 결과, 양성대 조군인 FK506과 A-J 도포군에서는 대조군에 비하여 유의성 있게 clinical skin severity score 감소를 관찰할 수 있었다. B 세포의 분화되는 과정에서 분비되어 결합하여 염증 반응을 유도하는 IgE와 Th2 세포에서 분비되어 B 세포의 분화를 촉진하는 IL-4에 의하여 유도되는 IgG1의 수치를 측정한 실험에서 total IgE와 IgG1의 수치 결과는 대조군이 IgE와 IgG1의 수치가 급격한 증가를 나타내었는데 FK506과 A-J 도포군에서는 대조군에 비하여 감소를 관찰할 수 있었다.
- 그리고 4주간 양성대조군인 FK506과 A-J 도포군은 12주 이후 감소하여 15주에서는 대조군에 혈장내 IgE 수준이 유의성 있게 감소를 나타내었다(p<0.01).
- 3%의 FK506을 도포한 것으로 대조군에 비하여 현저하게 피부 발진이 줄어 정상군에 가깝게 억제되었다. 또한 D는 A-J를 3주간 매일 도포한 실험군으로 대조군에 소양행동을 동반한 홍반, 부종, 인설, 가피, 태선화 등이 감소한 것을 알 수 있다. 피부색이 약간 홍조를 띠는 것은 한방연고의 색이 적색을 띠기 때문이다.
- 본 실험의 결과를 살펴보면 아토피성 피부염 유발제제인 BMAC는 Dermatophagoides farinae crude extract (진드기 항원, mite extract, lyophilized)를 항원으로 0.5% Tween 20이 포함된 PBS에 10 농도로 용해 후 ointment base에 혼합하여 처리하였고, 12주령 이상된 NC/Nga mouse의 눈에서 capillary tube 를 사용하여 채혈하여 혈장 내 IgE 수준을 측정후 제모제를 이용하여 등 부위의 털을 모두 제거한 후 24시간 지난 다음 4% SDS로 피부층을 NC/Nga mouse의 등 부위 및 귀 부위에 2회 100 ㎎/mouse 농도로 도포하였다. BMAC는 유발기간의 기준은 약 3 주간 (총 6회)으로 최종적으로 전체 600㎎ 정도 도포하였고, 아토피성 피부발진이 유발된 NC/Nga mouse의 발진의 임상평가는 육안평가로 항목은 erythema/hemorrhage (소양행동을 동반한 홍반), dryness/scarring(인설 및 가피), edema(부종), excoriation/erosion(표피박탈/미란), lichenification(태선화)로 하여 각 단계의 점수의 총합으로 나타내었다.
- 연구에서 혈장내 IgG1의 수준은 양성대조군인 FK506도포군이 대조군에 3배 이상 유의성 있게 IgG1 수준이 감소를 나타내었고(p<0.001) A-J 도포군은 대조군에 비해 IgG1 수준이 유의성 있게 감소된 모습을 보였다(p<0.05).
- 이 두 유형은 사이토카인 발현 면에서도 뚜렷한 차이점이 있는데 IL-5와 IFN-γ는 모두 비슷한 양으로 검출되나 extrinsic type은 intrinsic type에 비해 IL-4, IL-13 발현이 증가 하였고 IgE에 대한 B cell의 Fc receptor (CD23)가 증가하였다 52-60).
- 즉 면역반응의 결과 생성하는 사이토카인에 따라 helper T 세포는 크게 두 종류의 서로 다른 Th 1 세포와 Th 2세포로 구분 되며, 분화 초기에 IL-4가 많이 존재하면 Th 2로 분화가 이루어지고, IFN-γ나 IL-12가 많이 존재하면 Th 1으로 분화하게 된다39-45).
후속연구
- 이상의 결과로 미루어 보아 A-J는 아토피 피부 염의 치료에 유효하게 활용할 수 있을 것으로 판단되며 향후 아토피 피부염에 대한 정확한 기전에 대한 연구가 요구되어지며 실험적 보완과 임상연구가 지속적으로 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 미루어 보아 A-J는 알레르기 치료에 유효하게 활용할 수 있을 것으로 판단되며 향후 지속적인 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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