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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 아토피 피부염 질환 증상에 대한 외톨개 모자반 에탄올 추출물(MMEE)의 치료 효과를 확인하기 위하여 아토피 피부염 모델로 사용되고 있는 BALB/c mouse를 사용하여 2,4-dinitrochlorobenzene(DNCB)으로 아토피 피부염을 유발하였다. MMEE를 mouse의 등 부위에 도포하여 skin severity score 및 육안평가와 함께 비장세포 및 혈청으로부터 염증성 cytokine, Th1 및 Th2 cy-tokine, 혈청 IgE의 분비량을 측정하여 MMEE의 아토피 피부염 억제 효과에 대해 알아보았다.
제안 방법
- Ahn 등(13)의 방법을 약간 변형하여 아토피 피부염을 유발하였다. BALB/c(n=5/group)는 normal 군, DNCB 처리군, DNCB+MMEE 처리군으로 총 3군으로 나누어 다음과 같이 실험을 진행하였다. 마우스의 등 부위를 깨끗하게 제모한 후 미세상처가 치유되도록 24시간 방치하였다.
- MMEE가 비장세포의 생존에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT로 측정하였다(Fig. 1). DNCB 단독 처리군은 nor-mal 군보다 세포 생존율이 유의적으로 증가하였고, MMEE 처리군은 normal 군과 유의적으로 차이가 나지 않았다.
- MMEE는 0.3% DNCB 용액과 12시간 간격으로 하루에 한 번, 200 μL씩 2주 동안 마우스의 귀 뒤쪽과 등 부위에 고르게 도포하였다.
- 따라서 본 연구에서는 아토피 피부염 질환 증상에 대한 외톨개 모자반 에탄올 추출물(MMEE)의 치료 효과를 확인하기 위하여 아토피 피부염 모델로 사용되고 있는 BALB/c mouse를 사용하여 2,4-dinitrochlorobenzene(DNCB)으로 아토피 피부염을 유발하였다. MMEE를 mouse의 등 부위에 도포하여 skin severity score 및 육안평가와 함께 비장세포 및 혈청으로부터 염증성 cytokine, Th1 및 Th2 cy-tokine, 혈청 IgE의 분비량을 측정하여 MMEE의 아토피 피부염 억제 효과에 대해 알아보았다.
- 시험 물질 도포 후 0, 7, 14일이 되는 시점에 실시하였다. 본 평가 방법은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 육안 평가 방법으로 아토피성 피부염의 심각성 정도를 다음의 5가지 항목을 각각 평가한 점수의 총합으로 나타내었다. 평가 항목은 홍반(erythema), 가려움과 건조피부(pruritus & dry skin), 부종과 혈종(edema & excoria-tion), 짓무름(erosion) 및 태선화(lichenification)로 나누었고 각각의 항목을 없음(0), 약함(1), 보통(2), 심함(3)으로 채점한 후 합산함으로써 최소 0점에서 최고 15점 사이의 점수를 부여하였다(14).
- 외톨개 모자반은 2011년 부산 송정에서 채취하여 수세한 후 자연건조 시켜 동결건조 하고 분말화하였다. 분말에 10배량의 95% 에탄올을 가하고, 교반기(H-0820, Dongwon Science Co., Busan, Korea)를 이용하여 24시간 추출하였다. 추출물은 3,000 rpm에서 10분간 원심분리(UNION 32 R, Hanil Co.
- 비장세포로부터 생성되는 interferon-γ(IFN-γ), inter-leukin(IL)-4, IL-5 및 마우스 혈청 내 total immun-oglobulin E(IgE), tumor necrosis factor-α(TNF-α), IL- 4, IL-10 cytokine은 BD Bioscience(San Diego, CA, USA)에서 구매한 ELISA kit을 이용하고, IL-13 cytokine의 분비량은 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 구매한 ELISA kit을 이용하였다.
- 실험 종료일에 마우스를 diethyl ether로 마취시키고 대동맥으로부터 disposable syringe(Sungshim Medical Co., Ltd., Bucheon, Korea)를 이용해서 혈액을 대략 1.0 mL 채취하였다. 혈액은 10,000 rpm, 4°C에서 5분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다.
- 아토피 피부염 유발이 종료된 후 마우스를 diethyl ether로 마취하여 희생시킨 다음 비장을 무균적으로 적출하였다. 적출한 비장은 RPMI 배지(RPMI Medium 1640, GIBCO, Grand Island, NY, USA)로 세척한 후 tissue grinder로 균질화하여 세포를 유리시켰다.
- 하지만 MMEE 처리군은 2주간 지속적인 도포에 의해 DNCB 단독 처리구와 비교 시 아토피 피부염 증상이 억제됨을 확인하였으며, normal 군과 유사한 결과를 보였다. 육안평가와 함께 skin severity score 법을 사용하여 피부 상태를 일주일에 한 번씩 평가하였다. Fig.
- , Busan, Korea)를 이용하여 24시간 추출하였다. 추출물은 3,000 rpm에서 10분간 원심분리(UNION 32 R, Hanil Co., Incheon, Korea) 한 후 상층액을 취하였고, 남은 잔사는 이와 동일한 방법으로 2회 반복하여 추출하였다. 상층액은 여과한 후 37°C에서 감압농축기(RE200, Yamoto Co.
- 평가 항목은 홍반(erythema), 가려움과 건조피부(pruritus & dry skin), 부종과 혈종(edema & excoria-tion), 짓무름(erosion) 및 태선화(lichenification)로 나누었고 각각의 항목을 없음(0), 약함(1), 보통(2), 심함(3)으로 채점한 후 합산함으로써 최소 0점에서 최고 15점 사이의 점수를 부여하였다(14).
대상 데이터
- 생후 4주령의 수컷 BALB/c 마우스를 오리엔트바이오(Seongnam, Korea)로부터 구입하여 온도 20±2°C, 습도 50±10%, 12시간 명암주기가 유지되는 동물실에서 1주간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
- 실험 종료일에 마우스로부터 비장을 채취하여 비장세포 현탁액을 2×106 cells/mL 농도로 96 well-plate에 분주한 후 37°C, CO2 incubator에서 70시간 배양하였다.
- 아세톤과 올리브오일(3:1, v/v)을 혼합한 용액으로 1% DNCB(Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 제조하여 일주일에 3번 마우스의 귀 뒤쪽과 등 부위에 200 μL를 도포하고, 일주일 후부터는 0.3% DNCB 200 μL를 하루에 한 번 동일한부위에 고르게 도포하였다.
데이터처리
- 실험 결과의 통계처리는 SAS program(statistical ana- lytical system, ver 8.2, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)을 이용하여 one way ANOVA법으로 분산 분석을 실시하였으며, 실험군 간 통계적인 유의성 검정은 Duncan의 다중검정법으로 P<0.05 수준에서 실시하였다.
이론/모형
- 각각 BD Bioscience와 R&D Systems 사가 제공하는 방법에 준하여 측정하고 정량하였다.
성능/효과
- 1). DNCB 단독 처리군은 nor-mal 군보다 세포 생존율이 유의적으로 증가하였고, MMEE 처리군은 normal 군과 유의적으로 차이가 나지 않았다. 따라서 MMEE 도포는 비장세포의 생존에 영향이 없는 것으로 확인되었다.
- IL-5의 분비량은 normal 군이 6.23 pg/ mL였으며, DNCB 단독 처리군은 24.95 pg/mL로 증가하였고, MMEE 처리구는 13.62 pg/mL로 DNCB 단독 처리군에 비해 약 45% 감소 효과를 나타내었다(Fig. 3).
- 혈청에서의 IgE 함량은 아토피 피부염의 중증도와 관련이 높으며(17), 비만세포 표면의 FCεRI 수용체와 IgE가 교차 결합하여 다양한 염증성 매개물질을 방출함으로써 아토피 피부염, 홍반 증상 등이 나타난다(18). MMEE 처리에 의한 혈청에서의 total IgE 함량을 측정한 결과(Fig. 2), total IgE 함량은 DNCB 단독 처리군은 325.24 pg/mL로 normal 군에 비해 상당히 증가하였지만 MMEE 처리에 의해 129.35 pg/mL로 60% 감소하였다. 따라서 MMEE는 total IgE 분비량을 억제시켜 아토피 피부염 증상을 완화시키는 것으로 사료된다.
- 따라 서 MMEE는 건조 개선으로 인한 피부 장벽을 보호하는 데 효과적임을 확인하였고, Th1과 Th2 세포 반응 조절을 통해 아토피 피부염의 염증 반응을 조절하여 아토피 피부염 증상을 완화시키는 것으로 사료된다.
- DNCB 단독 처리군은 nor-mal 군보다 세포 생존율이 유의적으로 증가하였고, MMEE 처리군은 normal 군과 유의적으로 차이가 나지 않았다. 따라서 MMEE 도포는 비장세포의 생존에 영향이 없는 것으로 확인되었다. 본 연구 결과에서와 같이 Jeong 등(8) 및 Zhang과 Zhu(15)의 결과에서도 DNCB 도포에 의해 비장세포 생존율 및 세포수가 증가하였다고 보고하였다.
- 따라서 MMEE 처리에 의한 아토피 피부염 증상의 호전은 혈청에서의 IL-4, TNF-α 및 total IgE 분비량 억제와 IL-10 분비량 증가에 기인한 것으로 사료된다.
- 심한 아토피 피부염 증상을 보인 환자의 혈장에서 IL-10의 분비는 약한 아토피 피부염 증상을 보인 환자 및 건강한 환자와 비교 시 낮게 나타났다고 보고되고 있다(22). 본 결과에서도 IL-10의 분비량은 normal 군에서 317.4 pg/mL였으나 DNCB 단독 처리군은 유의적인 감소를 보였으며, MMEE 처리군은 196.5 pg/mL로 DNCB 단독 처리군에 비해 유의적으로 증가하는 경향을 보였다(Fig. 2). 따라서 MMEE 처리에 의한 아토피 피부염 증상의 호전은 혈청에서의 IL-4, TNF-α 및 total IgE 분비량 억제와 IL-10 분비량 증가에 기인한 것으로 사료된다.
- IL-4와 IL-13은 basophil과 Th2 cell에서 분비가 되는 것으로 알려져 있으며, B cell을 자극하여 IgE의 생산을 증가시키며(23), IL-5는 eosinophils의 생존 및 활성을 조절하고 호산구 과다증 및 피부로의 침윤을 증가시킨다(24). 본 연구 결과에서 IL-4 및 IL-13 cytokine의 분비량은 DNCB 단독 처리군에서 각각 88.58 pg/mL 및 32.34 pg/mL로 normal 군에 비해 유의적으로 상당히 증가하였으나, MMEE 처리구는 DNCB 단독 처리군에 비해 각각 24.90 pg/mL 및 4.93 pg/mL로 약 67% 및 85% 감소하였다(Fig. 3). 따라서 MMEE 처리구는 Th2 반응에서 IL-4 및 IL-13의 분비가 억제됨으로써 혈청 IgE의 분비가 감소된 것으로 사료된다.
- 본 연구에서도 IFN-γ의 분비량은 DNCB 단독 처리군이 48.26 pg/mL로 normal 군에 비해 감소하였으나 MMEE 처리군은 193.13 pg/mL로 증가하였으며, normal 군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다(Fig. 3).
- 염증성 cytokine인 TNF-α 분비량은 DNCB 단독 처리군은 118.13 pg/mL로 normal 군보다 증가하였으며, MMEE 처리구는 32.26 pg/mL로 약 73% 정도 감소하였다(Fig. 2).
- 5의 결과에서 DNCB 단독 처리구는 DNCB 도포가 반복될수록 점수가 급격하게 증가하였다. 하지만 MMEE 처리구는 DNCB 단독 처리구와 비교 시 MMEE를 1주간 도포 후(2주차)에는 severity score가 유의적으로 감소하여 2주간 도포 후(3주차)에는 2주차보다 더 증상이 완화되어 severity score가 상당히 낮아짐을 확인하였다. 아토피 피부염에서의 피부 장벽의 파괴는 경피 수분 손실 및 건조 증상을 나타내며, 건조 증상은 ‘가려움- 긁기’ 악순환을 가져와 심화된 피부 염증 반응을 일으키므로 피부 장벽 보호는 아토피 피부염 치료에 중요하다(27).
- 4) 다른 연구 결과에서와 같은 증상을 보였으며(26), DNCB를 1주간 도포 시 홍반, 출혈이 나타났고 지속적인 DNCB 도포로 부종, 짓무름, 건조 등 아토피 피부염 증상이 심화되었다. 하지만 MMEE 처리군은 2주간 지속적인 도포에 의해 DNCB 단독 처리구와 비교 시 아토피 피부염 증상이 억제됨을 확인하였으며, normal 군과 유사한 결과를 보였다. 육안평가와 함께 skin severity score 법을 사용하여 피부 상태를 일주일에 한 번씩 평가하였다.
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