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문제 정의
- 麻杏甘石湯加減方은 麻杏甘石湯5)에서 石膏를 빼고 魚腥草, 蘿葍子, 葶藶子, 瓜蔞仁, 杏仁, 地 龍, 黃芩, 款冬花, 紫菀, 蘇子, 山楂肉, 山楂, 砂 仁을 가하여 기관지천식을 비롯한 호흡기질환을 대상으로 임상에서 사용하고 있는 처방으로 기관 지천식 모델을 대상 으로하여 CD3+ 세포, CD4+ 세포 및 CD8+ 세포에 대한 영향을 평가해 보고자 하였다.
- 이에 저자는 麻杏甘石湯加減方이 면역세포에 미치는 영향을 규명하고자 기관지천식 생쥐모델을 대상으로 폐조직의 CD3+세포, CD4+세포와 CD8+세포의 수의 변화를 측정하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- t)하였다. 3주째부터 분무기를 이용하여 1 ㎎/㎖을 4주간, 2.5 ㎎/㎖을 4주간 난알부민 용액을 하루에 30분씩 일주일에 3 회씩 8주 동안 비강및 기도내로 흡입시켰다. 이 때 대조군으로써 PBS 또는 Alum 만을 주사, 흡입시켰다 (Scheme 1).
- MGTG 2첩 분량에 증류수 1,500 ㎖를 가하여 열탕 추출기에서 3시간 추출하였다. 추출액을 흡입 여과한 후 감압 증류장치 (Rotary evaporator, Büchi, Switzerland)로 농축하고, 다시 동결 건조기 (Freeze dryer, EYELA, Japan)를 이용하여 27.
- OVA/Alum로 전신 감작 시킨 후 4주째부터 MGTG (400, 200 ㎎/㎏)을 일주일에 5회 경구 투여 하였다. 대조군에는 증류수를 동량 경구 투여하였고, 양성대조군에는 cyclosporine (20 ㎎/㎏)을 복강주사 하였다.
- 측정한 비장과 폐의 세포를 5 × 105 세포로 조정한 후 4℃에서 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)을 실시하였다. 각각에 anti-CD3-PE (phycoerythrin), anti-CD4-FITC, anti-CD8-FITC를 넣고 30 분간 얼음에서 반응시켰다. 반응 후 3회 이상 인산 완충 생리식염수로 수세한 후 flow cytometer의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 CD3+, CD4+, CD8+ 세포수를 백분율 (%)로 분석한 후 총세포 수를 적용하여 각 조직에서의 절대 세포 수 (absolute number)를 산출하였다.
- 기기는 열탕추출기 (대웅, Korea), rotary vaccum evaporator (Büchi, Switzerland), freeze dryer (EYELA, Japan), CO2 incubator (Forma scientific, USA), clean bench (Vision Scientific, Korea), autoclave (Sanyo, Japan), micro-pipet (Gilson, France), water bath (Vision Scientific, Korea), vortex mixer (Vision Scientific, Korea), spectrophotometer (Shimazue, Japan), centrifuge (Sigma, USA), deep-freezer (Sanyo, Japan), thermocycler system (MWG Biotech, Germany), ice-maker (Vision Scientific, Korea), homogenizer (OMNI, USA), plate shaker (Lab-Line, USA) 등을 사용하였다.
- OVA/Alum로 전신 감작 시킨 후 4주째부터 MGTG (400, 200 ㎎/㎏)을 일주일에 5회 경구 투여 하였다. 대조군에는 증류수를 동량 경구 투여하였고, 양성대조군에는 cyclosporine (20 ㎎/㎏)을 복강주사 하였다.
- 각각에 anti-CD3-PE (phycoerythrin), anti-CD4-FITC, anti-CD8-FITC를 넣고 30 분간 얼음에서 반응시켰다. 반응 후 3회 이상 인산 완충 생리식염수로 수세한 후 flow cytometer의 Cell Quest 프로그램을 이용하여 CD3+, CD4+, CD8+ 세포수를 백분율 (%)로 분석한 후 총세포 수를 적용하여 각 조직에서의 절대 세포 수 (absolute number)를 산출하였다.
- 실온 22±2℃, 상대 습도 50 ± 10%, 조명 시간 12시간 (07:00-19:00), 조도 150-300 Lux로 설정하여 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 체중 변화가 일정하고 건강한 동물만을 선별하여 실험에 사용하였다.
- 실험 종료 후 폐를 적출하여 100 mesh로 세포를 분리하여 D-PBS로 5분간 원심분리 (1,700 rpm)하여 2회 세척한 후 cell strainer에 통과시켜 세포 이외의 분해되지 않은 조직이나 불순물을 제거하였다. 그리고 이를 잘게 chopping한후, collagenase 1 ㎎/㎖ (in 2% FBS + RPMI1640)을 넣고 37℃ shaker (180 rpm, 20min.
- 5로 조정하여 상온에서 1시간 동안 방치하고 750 × g 에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심 분리한 OVA/ Alum 침전물을 증류수를 가하여 원래의 양으로 용해한 후, 100 ㎍ OVA를 0.2 ㎖로 조정하여 복강 내로 주사하여 전신 감작시켰다. 이 후 2주째에 생쥐를 마취한후, 난알부민 (500 ㎍/㎖) 100 ㎕를 기도 투여 (i.
- 5 ㎎/㎖을 4주간 난알부민 용액을 하루에 30분씩 일주일에 3 회씩 8주 동안 비강및 기도내로 흡입시켰다. 이 때 대조군으로써 PBS 또는 Alum 만을 주사, 흡입시켰다 (Scheme 1).
- 2 ㎖로 조정하여 복강 내로 주사하여 전신 감작시켰다. 이 후 2주째에 생쥐를 마취한후, 난알부민 (500 ㎍/㎖) 100 ㎕를 기도 투여 (i.t)하였다. 3주째부터 분무기를 이용하여 1 ㎎/㎖을 4주간, 2.
- ) 배양기에서 배양한 후 상층 액을 회수하는 방법으로 4회 반복하였다. 이들 세포들을 ACK 용액 (8.3 g NH4Cl, 1 g KHCO3, in 1ℓ of demineralized water + 0.1 mM EDTA)을 실온에서 5분 동안 처리하여 적혈구를 용해시키고 다시 D-PBS로 2회 세척한 후 0.04% trypan blue로 염색한 후 총 세포수를 측정하였다. 측정한 비장과 폐의 세포를 5 × 105 세포로 조정한 후 4℃에서 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)을 실시하였다.
- 측정한 비장과 폐의 세포를 5 × 105 세포로 조정한 후 4℃에서 면역 형광염색 (immunofluorescence staining)을 실시하였다.
대상 데이터
- (Mahaenggamseok-tang-gagambang, 이하 MGTG)의 구성 약물은 대전대학교 부속한방병원에서 구입하여 정선한 후 사용하였고 처방 1첩의 내용과 분량은 다음과 같다.
- in mouse OVA-induced asthma lung cells. C57BL/6 mice were injected, inhaled and sprayed (3 times a week) with OVA for 12 weeks for asthma sensitization and challenge. Two experimental groups were treated with MGTG200 and MGTG400 for the 8 weeks (6 times a week).
- C57BL/6 mice were injected, inhaled and sprayed (3 times a week) with OVA for 12 weeks for asthma sensitization and challenge. Two experimental groups were treated with MGTG200 and MGTG400 for the 8 weeks (6 times a week). Normal : Normal C57BL/6 mice.
- 본 실험에 사용된 시약은 diethylpyrocarbonate(DEPC), 3-4, 5- dimethyl-thiazol-2, 5 - carboxymethoxyphenyl - 2 , 4-sulfophenyl-2H-tetrazolim (MTS), collagenase, RPMI 1640 배양액, 적혈구 용혈액 (RBC lysis solution), Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), formaldehyde 등은 Sigma사 (USA) 제품을사용하였으며, 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)은 Hyclone사 (USA) 제품을, anti - CD3 - PE (phycoerythrin) , anti - CD4 - FITC ( fluoresce in isothiocyanate ), anti-CD8-F ITC 는 Pharmingen사 (USA) 제품을 사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과를 ANOVA and Bonferroni type multiple t-test (JAVA, Bonferroni Ver 1.1)로 분석하여 p값을 구하였 다. 각 대조군을 정상 군과, 실험 군을 대조군과 비교하여 P<0.
성능/효과
- CsA투여군은 1.7 ± 0.1 (×104 cells)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (P<0.01) 감소하였고, MGTG200군과 MGTG400군은 각각 2.4 ± 0.2와 2.2 ± 0.2 (×104 cells)로 나타나 대조군에 비하여 모두 유의성 있게 (P<0.01) 감소하였다 (Fig. 3).
- CsA투여군은 10.1 ± 0.2 (×104 cells)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (P<0.001) 감소하였고, MGTG200 군과 MGTG400군은 각각 20.1 ± 3.7과 19.0 ± 3.8 (×104 cells)로 나타나 대조군에 비하여 모두 유의성 있게 (P<0.05) 감소하였다 (Fig. 1).
- CsA투여군은 5.4 ± 1.6 (×104 cells)로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있게 (P<0.001) 감소하였고, MGTG200 군과 MGTG400군은 각각 13.5 ± 2.8과 13.3 ± 2.5 (×104 cells)로 나타나 대조군에 비하여 모두 유의성 있게 (P<0.05) 감소하였다 (Fig. 2).
- 천식을 유발시킨 생쥐에 麻杏甘石湯加減方 (200, 400 ㎎/㎏)을 투여하여 폐의 CD3+ 세포의 수를 측정한 결과 두 농도 모두에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, 폐의 CD4+ 세포의 수를 측정한 결과 두 농도 모두에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, 폐의 CD8+ 세포의 수를 측정한 결과 두 농도 모두에서 대조 군에 비하여 유의성 있게 감소함을 알 수 있었다. 따라서 麻杏甘石湯加減方이 기관지천식으로 인한 과민반응에 영향을 나타내는 것으로 생각된다.
- 실험 결과 천식을 유발한 대조군의 폐에서 정상군보다 CD3+ 세포와 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포의 수가 증가하였으며, 마행감석탕가감방을 투여하였을 때 폐에서 대조군보다 CD3+ 세포와 CD4+ 세포 및 CD8+ 세포가 유의하게 감소 하였다(Fig. 1-3).
- 천식을 유발시킨 생쥐에 麻杏甘石湯加減方 (200, 400 ㎎/㎏)을 투여하여 폐의 CD3+ 세포의 수를 측정한 결과 두 농도 모두에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, 폐의 CD4+ 세포의 수를 측정한 결과 두 농도 모두에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, 폐의 CD8+ 세포의 수를 측정한 결과 두 농도 모두에서 대조 군에 비하여 유의성 있게 감소함을 알 수 있었다. 따라서 麻杏甘石湯加減方이 기관지천식으로 인한 과민반응에 영향을 나타내는 것으로 생각된다.
- 폐 세포 내 CD3+ 세포수를 count 한 결과, 대조군은 33.9 ± 2.6 (×104 cells)로 나타나 정상 군의 6.9 ± 2.1 (×104 cells)에 비하여 유의성 있게 (P<0.001) 증가하였다.
- 폐 세포 내 CD4+ 세포수를 count 한 결과, 대조군은 25.3 ± 0.7 (×104 cells)로 나타나 정상 군의 6.1 ± 1.4 (×104 cells)에 비하여 유의성 있게 (P<0.001) 증가하였다.
- 폐 세포 내 CD8+ 세포수를 count 한 결과, 대조군은 5.3 ± 0.4 (×104 cells)로 나타나 정상 군의 1.4 ± 0.4 (×104 cells)에 비하여 유의성 있게 (P<0.01) 증가하였다.
후속연구
- 따라서 麻杏甘石湯加減方이 CD4+ 세포와 CD8+ 세포의 증가를 모두 억제하는 것은 이러한 기관지천식의 다양한 알레르기 염증의 기전에 좀 더 폭넓게 작용할 가능성을 보여주는 것으로 생각된다. 기존의 연구에서 神秘湯과 神秘 湯加味, 定喘湯, 加味淸金降火湯이 주로 CD4+ 세포의 증가를 억제하고 CD8+ 세포에는 유의한 효과를 나타내지 않았고9-11), 麥門冬湯이 CD4+ 세포와 CD8+ 세포의 증가를 모두 유의하게 억제한 것으로 나타난 결과8)와의 비교 연구도 필요 하리라 생각된다.
- 특히 호흡기 바이 러스 감염으로 기관지천식이 악화되는 것은 바이 러스 감염이 기관지천식 환자의 CD8+ 세포를 활성화시키고 이에 따라 type2 사이토카인의 과잉 분비를 유발하며 이로 인해 알레르기 염증 반응이 증가함으로써 악화에 기여한다고 설명하고 있다 28,29) . 따라서 麻杏甘石湯加減方이 CD4+ 세포와 CD8+ 세포의 증가를 모두 억제하는 것은 이러한 기관지천식의 다양한 알레르기 염증의 기전에 좀 더 폭넓게 작용할 가능성을 보여주는 것으로 생각된다. 기존의 연구에서 神秘湯과 神秘 湯加味, 定喘湯, 加味淸金降火湯이 주로 CD4+ 세포의 증가를 억제하고 CD8+ 세포에는 유의한 효과를 나타내지 않았고9-11), 麥門冬湯이 CD4+ 세포와 CD8+ 세포의 증가를 모두 유의하게 억제한 것으로 나타난 결과8)와의 비교 연구도 필요 하리라 생각된다.
- 이상의 결과는 麻杏甘石湯加減方이 기관지천 식의 병리에서 T 세포와 관련된 과민반응에 일정하게 작용한다고 볼 수 있는 근거를 제시하는 것으로 생각되며, 향후 麻杏甘石湯加減方을 대상으로 기관지천식에 관련되는 다양한 세포들과 사이토카인 및 케모카인에 미치는 영향에 대한 추가 연구가 필요할 것으로 사료된다.
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