[논문]해충저항성 GM 배추에서 T-DNA와 식물체 게놈의 인접 부위 분석

임선형; 박승혜; 김정환; 김나영; 원소윤; 이시명; 신공식; 우희종; 김동헌; 조현석

doi:10.5010/jpb.2008.35.2.101

해충저항성 GM 배추에서 T-DNA와 식물체 게놈의 인접 부위 분석
Analysis of junction between T-DNA and plant genome in insect resistance GM Chinese cabbage 원문보기

Journal of plant biotechnology = 식물생명공학회지, v.35 no.2, 2008년, pp.101 - 108

임선형 (농업생명공학연구원 생물안전성과) , 박승혜 (농업생명공학연구원 생물안전성과) , 김정환 (농업생명공학연구원 생물안전성과) , 김나영 (농업생명공학연구원 생물안전성과) , 원소윤 (농업생명공학연구원 생물안전성과) , 이시명 (농업생명공학연구원 생물안전성과) , 신공식 (농업생명공학연구원 생물안전성과) , 우희종 (농업생명공학연구원 생물안전성과) , 김동헌 (농업생명공학연구원 생물안전성과) , 조현석 (농업생명공학연구원 생물안전성과)

초록
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아그로박테리움을 이용한 형질전환은 대다수의 쌍자엽과 몇몇 단자엽 식물의 게놈내로 외래유전자를 도입하는 성공적인 방법이다. 해충저항성 CryIAc 유전자가 도입된 배추형 질전환체를 아그로박테리움 형질전환법을 통해 얻은 후, 도입유전자의 수를 Southern 분석을 통하여 확인하였다. 배추형질전환체 46개 중에서 29개는 1 copy의 CryIAc 유전자가 도입된 것으로 확인되었다. 식물체의 게놈내로 T-DNA 결합에 관한 정보를 얻기 위해서 LB 인접서열을 genome walking PCR 방법을 통하여 분석하였다. 46개의 배추형질전환체중에서 37개는 운반체의 backbone 염기서열을 지니는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 도입 운반체의 LB 지점에서 제대로 종결이 이루어지지 않아서 운반체의 backbone 염기서열이 운반된 것으로 보여진다. 운반체의 backbone 염기서열이 도입되지 않은 9개체의 배추형질전환체를 LB 인접서열을 분석한 결과, 모든 LB 부위는 절단부위가 보존되지 않았고, 절단부위에서 36bp까지도 결실이 확인되었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The Agrobacterium-mediated transformation has been successfully used method to introduce foreign genes into some monocotyledonous as well as a large number of dicotyledonous plants genome, We developed transgenic Chinese cabbage plants with insect-resistance gene, modified CryIAc, by Agrobacterium-transformation and confirmed transgene copy number by Southern blot analysis. We confirmed that twenty-nine out of 46 transgenic Chinese cabbage plants have single copy of CryIAc. To obtain the sequences information on the transferred DNA (T-DNA) integration into plant genome, we analyzed left border (LB) flanking sequences by genome walking (GW) PCR method. Out of 46 transgenic Chinese cabbage plants examined, 37 carried the vector backbone sequences. This result indicates that the transfer of the vector backbone from the binary vectors resulted mainly from inefficient termination of LB site. Analysis of T-DNA LB flanking region of 9 transgenic Chinese cabbage plants without vector backbone revealed that all LB ends were not conserved and nucleotides up to 36bp from the LB cleavage site were deleted.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 형질전환 배추에서의 T-DNA의 식물체 게놈 내의 도입양상을 밝히고자, AGRODACTERIUM을 이용하여 배추 형질전환체를 얻었고, 이들 배추 형질전환체의 도입 유전자의 copy 수를 Southern 분석을 통해 확인하였다. Genome walking PCR을 이용하여 형질전환 배추의 T-DNA의 인접서열을 증폭하고, 염기서열을 분석하여, 형질전환 배추의 경우에도 형질전환시 운반체의 backbone 염기서열이 다수 들어감을 확인하였다.

가설 설정

(B) Genomic DNA isolated from transgenic plants harboring 410, was digested with and then hybridized with CrylAc gene. C: wild type plant, number means different Chinese cabbage plants. M: Ikb plus lOObp DNA ladder.

제안 방법

1983) 에도입하였다. 5일간 암배양한 배추 하배축에 agrbacterium 현탁액을 접종한 후, 2일간 공동배양을 실시하고, PPT가 첨가된 배지에서 형질전환체를 선발하였다. 살아남은 개체를 PPT가 첨가된 배지에서 2-3주마다 계대배양하였고, 뿌리 유도 후 화분에 심어서 온실에서 순화시켜 운반체의 종류에 번호를 붙여 명명하였다.
tumefaciens LBA4404를 YEP (KmR) 액체배지에 접종하여 48시간 동안 진탕배양하였다. Agrobacterium 배양액에 배추 하배축을 20분간 감염시킨 다음, 1 mg/L NAA, 1 mg/L BA, 10 g/L sucrose, 8 g/L agar가 첨가된 MS 배지에서 2일간 공동배양하였다 형질전환된 재분화 식물체를 얻기 위하여 1 mg/L NAA, 1 mg/L BA, 300 mg/L carbenicillin, 3 mg/L phosphinotricine (PPT), 10 g/L sucrose, 8 g/L agar가 첨가된 MS 배지에서 배양한 다음, 3주마다 계대배양 하였다. 재분화된 신초는 300 mg/L carbenicillin, 3 mg/L PPT, 10 g/L sucrose, 8 g/L agar가 첨가된 MS배지로 옮겨 발근을 유도하였다.
제조사가 제공한 방법들을 이용하여 T-DNA가 삽입된 인접부위를 증폭하였다. Genome walker의 방법에 따라 분리된 genomic DNA를 Dral, EcoRV, PvwⅡ, SM의 blunt-end 제한효소를 이용하여 37℃에서 2시간 처리한 후, 전기 영동을 통하여 genomic DNA의 절단을 확인하였다. 절단된 genomic DNA에 25 |1M genome walker adaptor (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGAC GGCCCGGGCTGGT-3', 3'-H₂N-CCCGACCA-PO₄-5')< 첨가하여 16℃ 에서 8시간이상 ligation을 수행하였다.
1 mg/ml denatured salmon sperm DNA가 첨가된 용액에서 3시간 (65℃)동안lybridizati® 한다음 [a-32P]dCTP 로 표지된 CrylAc DNA를 첨가하여 12시간 hybridizatione]- 였다. Membrane은 2 X SSC, 0.1% SDS 용액 (65℃)에서 20 분 1 X SSC, 0.1% SDS용액 (65C)에서 20분 세척한 후 Bio-imaging analyzer (BAS-2000; Fuji Photo Film, Japan)로 분석하였다.
배추 형질전환체에서 운반체 backbone 염기서열의 존재 여부를 확인하기 위해서 T-DNA의 안쪽의 bar 프라이머 (5LCTTCAGCCTGCCGGTACCGCC-3)와 T-DNA의 LB 바깥쪽의 backbone 특이적인 프라이머인 LB out 프라이머 (5'-CCGCCGTGATCACAGGCAGC-3')< 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃ 에서 3분간 변성시킨 후 94℃ 에서 30초, 60℃ 에서 30초 72℃ 에서 30초의 단계로 30회 반복하여 실시하고, 72℃ 에서 5분간 최종 증폭하였다.
이들의 인접부위의 염기서열을 분석한 결과 모두 운반체의 LB부위의 backbone 염기서열이 확인되었다. 배추형질전환체에서 운반체의 backbone 염기서열의 존재여부를 확인하기 위해서 T-DNA의 바깥쪽과 안쪽의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다 (Fig. 4). 그 결과 운반체를 이용한 PCR에서는 DNA의 증폭이 이루어졌으나 대조구에서는 DNA의 증폭이 이루어지지 않았다 (Fig.
5일간 암배양한 배추 하배축에 agrbacterium 현탁액을 접종한 후, 2일간 공동배양을 실시하고, PPT가 첨가된 배지에서 형질전환체를 선발하였다. 살아남은 개체를 PPT가 첨가된 배지에서 2-3주마다 계대배양하였고, 뿌리 유도 후 화분에 심어서 온실에서 순화시켜 운반체의 종류에 번호를 붙여 명명하였다.
유전자도입이 확인된 배추식물체로부터 genomic DNA를 분리하여 genome walker (Invitrogen co.)를 이용하여 인접서열을 확인하였다. 제조사가 제공한 방법들을 이용하여 T-DNA가 삽입된 인접부위를 증폭하였다.
재분화된 배추식물체의 해충저항성 유전자 도입여부 및 도입 유전자의 수를 확인하기 위해서, PPT 배지에서 살아남은 배추 잎과 형질전환시키지 않은 대조구 배추 잎으로부터 genomic DNA를 추출하여 CrylAce] DNA 단편을 probe로 이용하여 Southern 분석을 수행하였다.
Genome walker의 방법에 따라 분리된 genomic DNA를 Dral, EcoRV, PvwⅡ, SM의 blunt-end 제한효소를 이용하여 37℃에서 2시간 처리한 후, 전기 영동을 통하여 genomic DNA의 절단을 확인하였다. 절단된 genomic DNA에 25 |1M genome walker adaptor (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGAC GGCCCGGGCTGGT-3', 3'-H₂N-CCCGACCA-PO₄-5')< 첨가하여 16℃ 에서 8시간이상 ligation을 수행하였다. 효소 반응을 억제하기 위해서 70℃에서 5분간 처리한 뒤에 이를 주형 DNA로 bar Fl 프라이머 (5'-CITCAGCCTGCCGGTACCGCCCC GTCCGGTCCTGCCCG-3, )와 API 프라이머 (S'-GTAATACGACTCA CTATAGGGC-3')< 이용하여 1st PCR을 수행하였고, 이를 희석하여 bar F2 프라이머 (5LGGGTCCTATAGGGTTTCGCT CATGTGTTGAGC-3')와 AP2 프라이머 (5'-ACTATAGGGCACG CGTGGT-3)를 이용하여 2nd PCR을 수행하였다.
)를 이용하여 인접서열을 확인하였다. 제조사가 제공한 방법들을 이용하여 T-DNA가 삽입된 인접부위를 증폭하였다. Genome walker의 방법에 따라 분리된 genomic DNA를 Dral, EcoRV, PvwⅡ, SM의 blunt-end 제한효소를 이용하여 37℃에서 2시간 처리한 후, 전기 영동을 통하여 genomic DNA의 절단을 확인하였다.
PCR 조건은 94℃ 에서 3분간 변성시킨 후 94℃ 에서 30초, 60℃ 에서 30초 72℃ 에서 30초의 단계로 30회 반복하여 실시하고, 72℃ 에서 5분간 최종 증폭하였다. 증폭된 PCR/산물은 1% agarose gel에 전기영동하여 분석하였다.
1st PCR과 2nd PCR 조건은 94℃에서 3분간 변성시킨 후, 94℃에서 25 초, 72℃에서 3분의 단계로 7회 실시하고, 94℃에서 25초, 67℃에서 3분의 단계로 32회 반복하여 실시하고, 67℃에서 5분간 최종 증폭하였다. 증폭된 PCR산물은 1% agarose gel 에 전기 영동한 후, gel extraction kit (Qiagen co.)를 사용하여 정제한 후, pGEM-T easy 벡터 (Promega)에 삽입하여 양방향의 염기서열을 확인하였다. 확인된 염기서열을 NCBI BLAST 분석을 이용하여 유사성 분석을 수행하였다.
해충저항성 배추형질전환체를 육성하기 위해 사용된 운반체인 416은 pCAMBIA3301 을 backbone으로 하여 dual 35S 프로모터와 식물에서 발현이 잘 되도록 염기서열을 변형한 해충 저항성 유전자인 CrylAc 유전자와 35S 프로모터와 사과로부터 분리된 개화유전자인 MdMADS를 역방향으로 삽입하여 제조하였다. 운반체 410은 pCAMBIA3301 을 backbone 으로 하여 dual 35S 프로모터와 식물에서 발현이 잘 되도록 염기서열을 변형한 해충저항성 유전자인 CrylAc 유전자와 35S 프로모터와 또 다른 해충저항성 유전자인 CrylC 유전자를 도입하여 구축된 것을 사용하였다 2개의 운반체 모두 선발 마커로는 bar 유전자를 사용하였으며 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 형질전환된 것을 동부한농(주)으로부터 분양 받아 사용하였다 (Fig.
형 질전환된 A. tumefaciens LBA4404를 YEP (KmR) 액체배지에 접종하여 48시간 동안 진탕배양하였다. Agrobacterium 배양액에 배추 하배축을 20분간 감염시킨 다음, 1 mg/L NAA, 1 mg/L BA, 10 g/L sucrose, 8 g/L agar가 첨가된 MS 배지에서 2일간 공동배양하였다 형질전환된 재분화 식물체를 얻기 위하여 1 mg/L NAA, 1 mg/L BA, 300 mg/L carbenicillin, 3 mg/L phosphinotricine (PPT), 10 g/L sucrose, 8 g/L agar가 첨가된 MS 배지에서 배양한 다음, 3주마다 계대배양 하였다.
절단된 genomic DNA에 25 |1M genome walker adaptor (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGAC GGCCCGGGCTGGT-3', 3'-H₂N-CCCGACCA-PO₄-5')< 첨가하여 16℃ 에서 8시간이상 ligation을 수행하였다. 효소 반응을 억제하기 위해서 70℃에서 5분간 처리한 뒤에 이를 주형 DNA로 bar Fl 프라이머 (5'-CITCAGCCTGCCGGTACCGCCCC GTCCGGTCCTGCCCG-3, )와 API 프라이머 (S'-GTAATACGACTCA CTATAGGGC-3')< 이용하여 1st PCR을 수행하였고, 이를 희석하여 bar F2 프라이머 (5LGGGTCCTATAGGGTTTCGCT CATGTGTTGAGC-3')와 AP2 프라이머 (5'-ACTATAGGGCACG CGTGGT-3)를 이용하여 2nd PCR을 수행하였다. 1st PCR과 2nd PCR 조건은 94℃에서 3분간 변성시킨 후, 94℃에서 25 초, 72℃에서 3분의 단계로 7회 실시하고, 94℃에서 25초, 67℃에서 3분의 단계로 32회 반복하여 실시하고, 67℃에서 5분간 최종 증폭하였다.

대상 데이터

배추 (Brassica rapa) 종자는 동부한농(주)의 순계계통인 노원을 사용하였다. 배추종자를 70% (v/v) 에탄올에서 2분간 표면 살균한 다음' 2.
본 실험에서 사용된 배추 형질전환체는 운반체별로 3 반복의 형질전환을 수행하여 획득하였다. 410 운반체의 경우 형질전환 효율이 1.
5% (v/v) sodium hypochlorite 용액에서 10분간 살균하고 멸균수로 3회 세척하였다. 살균된 종자는 MS 기본배지 (Murashige and Skoog 1962)에 치상한 후, 2 6℃ 에서 암배양하고, 발아 후 5일된 배추식물체의 하 배축을 실험재료로 사용하였다.
제조하였다. 운반체 410은 pCAMBIA3301 을 backbone 으로 하여 dual 35S 프로모터와 식물에서 발현이 잘 되도록 염기서열을 변형한 해충저항성 유전자인 CrylAc 유전자와 35S 프로모터와 또 다른 해충저항성 유전자인 CrylC 유전자를 도입하여 구축된 것을 사용하였다 2개의 운반체 모두 선발 마커로는 bar 유전자를 사용하였으며 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 형질전환된 것을 동부한농(주)으로부터 분양 받아 사용하였다 (Fig. 1A and Fig. 2A)
해충저항성 배추를 개발하기 위해서 제작된 2종류의 식물발현용 운반체(410, 416)를 octopine 형의 vir 유전자를 지닌 agrobacterium strain LBA4404 (Hoekema et al. 1983) 에도입하였다. 5일간 암배양한 배추 하배축에 agrbacterium 현탁액을 접종한 후, 2일간 공동배양을 실시하고, PPT가 첨가된 배지에서 형질전환체를 선발하였다.

데이터처리

)를 사용하여 정제한 후, pGEM-T easy 벡터 (Promega)에 삽입하여 양방향의 염기서열을 확인하였다. 확인된 염기서열을 NCBI BLAST 분석을 이용하여 유사성 분석을 수행하였다.

이론/모형

Genomic DNA는 Kim (2002)의 방법을 이용하여 추출하였고, 20 ng DNA를 제한효소 HindlH로 처리하여 0.8% agarose gel에 전기영동한 다음 capillary transfer 방법 (Southern 1975)으로 nylon membrane에 전이시켰다. Membranee 0.
배추 genome내의 T-DNA 삽입부위의 인접서열을 분석하고자 genome walker의 방법에 따라 PCR을 수행하였다. 그 결과, 410 운반체로 형질전환된 32개체와 416 운반체로 형질 전환된 14개체에서 LB 인접부위에서 총 98개의 PCR 산물이 증폭되었고, 이들의 염기서열을 분석하였다.

성능/효과

410 운반체의 경우 T-DNA copy 수가 하나인 경우 13% (3/23개체)가 운반체 backbone DNA가 없이 T-DNA가 도입되었으나, 416 운반체의 경우 T-DNA copy 수가 하나인 경우에 67% (4/6개체)가 운반체 backbone DNA없이 T-DNA가 도입된 것으로 나타나서 운반체별로 범위의 폭이 매우 크게 나타났다. 그러나, 2개 이상의 T-DNA copy가 도입된 경우 운반체 backbone DNA가 삽입된 것은 410 운반체의 경우 77.
Genome walking PCR을 이용하여 형질전환 배추의 T-DNA의 인접서열을 증폭하고, 염기서열을 분석하여, 형질전환 배추의 경우에도 형질전환시 운반체의 backbone 염기서열이 다수 들어감을 확인하였다.
그 결과, 410 운반체로 형질전환된 32개체와 416 운반체로 형질 전환된 14개체에서 LB 인접부위에서 총 98개의 PCR 산물이 증폭되었고, 이들의 염기서열을 분석하였다. 그 결과 410 운반체로 형질전환된 배추식물체에서 15% (5/32개체), 416 운반체로 형질전환된 배추에서 28.5% (4/14개체)가 운반체 backbone DNA가 없이 배추 genome내로 삽입되었다. Agrobacterhm을 이용한 식물체 형질전환 결과, 애기장대는 20% (De Buck et al.
4). 그 결과 운반체를 이용한 PCR에서는 DNA의 증폭이 이루어졌으나 대조구에서는 DNA의 증폭이 이루어지지 않았다 (Fig. 4 P와 C). 배추형질전환체 46개체 중에서 인접서열분석 결과운반체의 backbone염기서열이 삽입되지 않았던 9개체 중에서 8개체는 모두 DNA의 증폭이 이루어지지 않아서 운반체의 backbone염기서열이 존재하지 않음을 확인하였다.
그 결과, 410 운반체로 형질전환된 32개체와 416 운반체로 형질 전환된 14개체에서 LB 인접부위에서 총 98개의 PCR 산물이 증폭되었고, 이들의 염기서열을 분석하였다. 그 결과 410 운반체로 형질전환된 배추식물체에서 15% (5/32개체), 416 운반체로 형질전환된 배추에서 28.
4 P와 C). 배추형질전환체 46개체 중에서 인접서열분석 결과운반체의 backbone염기서열이 삽입되지 않았던 9개체 중에서 8개체는 모두 DNA의 증폭이 이루어지지 않아서 운반체의 backbone염기서열이 존재하지 않음을 확인하였다. 그러나, Southern 분석결과 다수의 copy가 도입된 것으로 확인된 4KW9개체의 경우 DNA의 증폭이 이루어져 운반체의 backbone 염기서열이 존재함이 확인되었다.
본 실험에서 총 46개의 배추형질전환체에서 인접 부위의 염기서열을 분석한 결과, 운반체 backbone 염기서열이 삽입된 개체는 35개체로 나타났다. 이들의 인접부위의 염기서열을 분석한 결과 모두 운반체의 LB부위의 backbone 염기서열이 확인되었다.
식물발현용 운반체 410과 416을 이용하여 형질전환된 해충 저항성 배추를 분석한 결과, 대조구에서는 band가 검출되지 않았으나 (Fig. 1과 2의 lane C), 형질전환 배추 식물체에서는 band가 검출되어 배추식물체의 genome내로 CrylAc 유전자가 도입되 었음을 확인하였다. 식물발현용 운반체 410을 이용하여 선발된 형질전환 배추식물체의 Southern 분석결과 1 copy의 유전자가 도입된 것은 72% (23/32개체), 2 copy의 유전자가 도입된 것은 12.
1과 2의 lane C), 형질전환 배추 식물체에서는 band가 검출되어 배추식물체의 genome내로 CrylAc 유전자가 도입되 었음을 확인하였다. 식물발현용 운반체 410을 이용하여 선발된 형질전환 배추식물체의 Southern 분석결과 1 copy의 유전자가 도입된 것은 72% (23/32개체), 2 copy의 유전자가 도입된 것은 12.5% (4/32개체), 3 copy의 유전자가 도입된 것은 3% (1/32개체), 4 copy 이상의 유전자를 도입된 경우는 12.5% (4/32개체)로 나타났다 (Fig. 1). 식물발현용 운반체 416을 이용하여 선발된 형질전환 배추식물체를 분석한 결과, 형질전환된 배추식물체 14개체 중에서 1 copy의 유전자가 도입된 것은 43% (6/14개체), 2 copy의 유전자가 도입된 것은 29% (4/14개체), 3 copy의 유전자가 도입된 것은 7% (1/14개체), 4 copy 이상의 유전자가 도입된 경우는 21% (3/14개체)로 나타났다 (Fig.
1). 식물발현용 운반체 416을 이용하여 선발된 형질전환 배추식물체를 분석한 결과, 형질전환된 배추식물체 14개체 중에서 1 copy의 유전자가 도입된 것은 43% (6/14개체), 2 copy의 유전자가 도입된 것은 29% (4/14개체), 3 copy의 유전자가 도입된 것은 7% (1/14개체), 4 copy 이상의 유전자가 도입된 경우는 21% (3/14개체)로 나타났다 (Fig. 2). 형질전환된 배추에서 도입 유전자의 copy 수는 운반체에 따라 차이가 나지만 1 copy 의 유전자가 도입된 것이 43% (416운반체) - 72% (410 운반체)로나타났고, 이는 형질전환 벼의 비율 (36% - 49%) 보다 다소 높은 빈도의 결과이다.
운반체 별로 T-DNA copy 수와 배추 genomic DNA의 인접 부위를 살펴본 결과 410 운반체로 형질전환된 배추 개체 중에서 410-13과 410-14는 동일한 인접서열을 지닌 것으로 확인되어서 이들은 동일한 캘러스 유래의 형질전환체로 판단되며, T-DNA copy가 2개 이상 도입된 배추식물체의 경우에서도 운반체의 backbone DNA가 삽입없이 형질전환이 이루어짐을 확인하였고 개체마다 다른 염색체내로 삽입된 것을 염기서열 분석으로 확인할 수 있었다. 416 운반체로 형질 전환된 경우에도 410 운반체와 마찬가지로 동일한 캘러스 유래의 형질전환체를 확인할 수 있었고 (416-2과 416-3), 416 운반체의 경우에는 T-DNA copy가 1개인 경우에만 운반체의 backbone DNA 없이 형질전환이 이루어짐을 확인하였고 (Table 2), 이들의 염색체내의 위치는 배추 게놈연구가 완료되면 보다 정확한 정보를 제공할 수 있으리라 판단된다.
운반체의 backbone DNA가 삽입되지 않은 배추 형질전환체의 LB 인접서열 분석 결과, 25개의 LB 염기서열에서 절단 부위로 알려진 3번째와 4번째 염기서열에서의 결합 (junction)은 관찰되지 않았다 (Fig. 3). 다른 작물에서 LB 인접서열 분석 결과를 살펴보면, 포플러는 20개의 LB 인접서열 분석결과 4개만 절단부위에서의 결합이 확인되었고 (Kumar and Fladung 2002), 벼에서는 61개 중에서 하나도 절단 부위의 결합이 관찰되지 않았고 (Kim et al.
이상의 결과로, 4grobacterium을 이용한 배추 형 질 전환을 수행하고, 형 질전환된 배추식물체의 도입유전자의 게놈 내의 위치 및 주변서열들을 확인한 결과 운반체의 backbone 염기서열이 높은 비율로 삽입됨이 확인되었다. 따라서 형질전환 작물의 상업화를 위한 포장검정 등을 수행하기 전에 형질전환체들의 도입유전자의 인접서 열에 관한 분자생물학적 분석이 요구된다.
야기할 수 있다. 첫째, 운반체의 backbone에 있는 염기서열은 도입유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 둘째, 상업적 인 유전자변형농산물을 규제하는 관리당국이나 구매하는 소비자들은 도입유전자 이외의 불필요한 유전자의 도입을 원하고 있지 않다 (Gamble and Gunson 2002; Lusk and Sullivan 2002; Small 2(X)4; http://www.
2002)되지 않아서 본 연구의 결과는 기존의 보고와도 비슷한 경향을 나타내었다. 형질전환 배추의 8개의 T-DNA 삽입부위의 LB 인접서열 분석 결과 6개는 LB의 부위가 남아있었으나, 2개의 경우 LB 안쪽의 염기서열의 최대 36bp의 절단이 확인되었다. 이러한 결과는 기존의 보고된 단자엽 작물인 옥수수에서도 총 23개의 T-DNA 삽입부위의 LB 인접서열 분석 결과에서도 12개는 LB의 부위가 남아있었으나, 11개의 경우 최대 78bp 절단이 확인되었고 (Kuraya et al.
2). 형질전환된 배추에서 도입 유전자의 copy 수는 운반체에 따라 차이가 나지만 1 copy 의 유전자가 도입된 것이 43% (416운반체) - 72% (410 운반체)로나타났고, 이는 형질전환 벼의 비율 (36% - 49%) 보다 다소 높은 빈도의 결과이다. 형질전환 배추의 T-DNA 평균 copy 수는 410 운반체의 경우 1.

후속연구

염기서열 분석으로 확인할 수 있었다. 416 운반체로 형질 전환된 경우에도 410 운반체와 마찬가지로 동일한 캘러스 유래의 형질전환체를 확인할 수 있었고 (416-2과 416-3), 416 운반체의 경우에는 T-DNA copy가 1개인 경우에만 운반체의 backbone DNA 없이 형질전환이 이루어짐을 확인하였고 (Table 2), 이들의 염색체내의 위치는 배추 게놈연구가 완료되면 보다 정확한 정보를 제공할 수 있으리라 판단된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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