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문제 정의
- 따라서 본 실험은 소비량은 많지만, 비교적 비타민 C 함량이 낮은 상추에 비타민 C 생합성 유전자인 GalUR 유전자를 도입하여 비타민 C 함량이 높은 상추를 선발하고자 실시하였다.
- 공급받는다. 본 실험의 목적은 비타민 C 생합성 유전자인 GalUR 유전자를 상추 (Lactuca sativa L.) 에 형질 전환하고자 실시하였다. (주)농우바이오의 화홍적축면 상추의 자엽 절편체를 선발배지 (MS + 30g/L Sucrose + 0.
제안 방법
- (주)농우바이오 시판종인 화흥적축면 상추 종자를 70% EtOH에 1분, 25% 락스에 15분간 침지하여 표면 살균하였다. 4회 멸균수로 수세한 다음 1/2MS 배지 (Murashige and Skoog 1962) 에 sucrose 1%가 첨가된 고체배지에 파종 후, 광조건 (25±1℃, 16h day/8h dark) 에서 발아시켰다.
- 4회 멸균수로 수세한 다음 1/2MS 배지 (Murashige and Skoog 1962) 에 sucrose 1%가 첨가된 고체배지에 파종 후, 광조건 (25±1℃, 16h day/8h dark) 에서 발아시켰다. 발아 후 3일 정도 된 자엽 절편체 (엽병을 약간 포함)를 Kim과 Kwon (1999)이 상추 재분화에 효과적이라고 보고한 전처리 배지 (MS, sucrose 3%, 0.
- Kanamycin이 첨가된 선발배지에서 살아남은 식물체에 GalUR 유전자가 도입되었는지를 확인하기 위하여 PCR 분석을 수행하였다. 형질전환 하여 얻어진 발근된 상추 개체를 자연광이 들어오는 순화실에서 (20℃) 순화하였다.
- PCR 반응에서 GalUR 유전자가 확인된 식물체로부터 GalUR 유전자의 도입여부를 보다 더 정확하게 확인하고자 형질전환 개체들 중 8점을 선정하여 Southern 분석을 실시하였다. HindⅢ로 처 리한 결과 대조구에서는 band를 확인할 수 없었으며, 형질전환체의 경우 12 kb~5 kb 사이에서 강한 band가 one copy에서 복수 copy까지 다양하게 확인 되었다.
- PCR 반응에 사용된 forward와 backward 는 S-AIGAOGCX*AiaiACTAT-3 와 SPIGGGAIOCr CATAATTCTTCGTC-3'# 각각 이용하였다. PCR 산물은 0.8% agarose gel에서 전기영동 하였으며, EtBr로 염색하여 UV lamp하에서 밴드를 확인하였다. 또한, 증폭된 밴드가 GalUR 유전자인지, 몇 copy로 삽입되었는지 확인하기 위하여 Southern 분석을 실시하였다 (Southern 1975).
- 2). 균주를 YEP (peptone 10 mg/L, yeat-extract 10 mg/L, NaCl 5 mg/L, Kanamycin 50 |ig/ml. rifampicin 30 |ig/ml, pH 5.6) 액체배지에 O.Dso = 0.8정도까지 배양하여 한 번 원심분리한 후 동일 양의 전처리 액체배지로 Agrobacterium pellet을 희석한 다음 절편체와 공동배양에 사용하였다.
- 그리고 멸균 여과지로 절편체에 붙은 현탁액을 제거한 후 공동배양배지 (MS, sucrose 3%, 0.5 mg/L BAP, 0.1 mg/L NAA, acetosyringon 50 uM, pH 5.2)에 치상하고, 암 상태에서 2일간 배양하였다. 선발배지는 전처리 배지에 Agrobacterium의제거를 위하여 200 mg/L의 Lilacillin (penicillin-sulfate sodium, Takeda Medicine Co.
- , Japan)이 첨가되었다. 또한 본 실험에 사용된 균주의 선발마커는 Kanamycin 저항성을 가졌기 때문에 형질전환체 선발을 위하여 100 mg/L Kanamycin이 첨가되었다. 선발배지에서 살아남은 신초들을 더 확실하게 선발을 하고자 MS배지에 100 mg/L Kanamycin과 200 mg/L Lilacillin만 첨가된 배지에서 신초의 신장과 발근을 유도하였다.
- 8% agarose gel에서 전기영동 하였으며, EtBr로 염색하여 UV lamp하에서 밴드를 확인하였다. 또한, 증폭된 밴드가 GalUR 유전자인지, 몇 copy로 삽입되었는지 확인하기 위하여 Southern 분석을 실시하였다 (Southern 1975). 상추잎에서 분리한 genomic DNA (20 ug)를 HindⅢ로 절단하여 0.
- 4회 멸균수로 수세한 다음 1/2MS 배지 (Murashige and Skoog 1962) 에 sucrose 1%가 첨가된 고체배지에 파종 후, 광조건 (25±1℃, 16h day/8h dark) 에서 발아시켰다. 발아 후 3일 정도 된 자엽 절편체 (엽병을 약간 포함)를 Kim과 Kwon (1999)이 상추 재분화에 효과적이라고 보고한 전처리 배지 (MS, sucrose 3%, 0.5 mg/L BAP, 0.1 mg/L NAA, agar 0.8%, pH 5.7)에서 2일간 전 배양한 후, Agrobacterium과의 공동배양에 하였다.
- 형질전환 하여 얻어진 발근된 상추 개체를 자연광이 들어오는 순화실에서 (20℃) 순화하였다. 본엽이 3~4장 나온 식물체의 어린 잎조직을 채취하여 genomic DNA를 추출하였다. PCR 반응조건은 94℃ 에서 5분간 pre- dematuration한 후, 94℃ 에서 1분간 denaturation, 55℃에서 1 분간 annealing, 72℃ 에서 [분간 extension 하는 과정을 35 번 반복하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 신장반응 시키는 것으로 하였다.
- 비타민 C 함량 (L-Ascorbic acid)을 측정 하고자 한국식품연구소에 대조구와 형질전환체 시료를 의뢰하여 HPLC 분석 방법으로 조사하였다. 대조구의 경우 0.
- 비타민 C 함량 분석을 위하여 Ti 형질전환체 종자를 105구 tray에 파종하였다 8 line 각각의 T1 식물 체내에 GalUR 유전자 삽입 유무를 확인하기 위해 본엽 이 3장 정도 나왔을 때 PCR 분석을 수행하였다. 유전자가 확인된 Ti 개체들 중에서 각각의 Ti 12개체를 선발하여 큰 포트로 이식하였다.
- 대조구도 같은 방법으로 3개의 시료를 준비하였다. 비타민 C는 쉽게 파괴되는 영양소이므로, 채취된 시료들을 바로 얼음을 채운 상자에 넣어서 분석전문 기관인 한국식품연구소로 보내 HPLC 분석 방법으로 비타민 C 함량을 측정하였다. 5% metaphosphoric acid 용액에서 시료를 추출하였고, columne C18 (4.
- 수 있었다. 상추내로 도입된 비타민 C 생합성 유전자가 후대에도 유전되어 제 기능을 하는지 확인하기 위해 비타민 C 함량이 높게 나온 6 line을 선정하여 T2 종자를 수확하였다. 향후 자연 온도 조건이 맞아 재배하기 쉽고, T1과 비슷한조건하에 비타민 C 함량을 측정하고자 다음해 봄에 T2를 파종할 계획이다.
- 또한, 증폭된 밴드가 GalUR 유전자인지, 몇 copy로 삽입되었는지 확인하기 위하여 Southern 분석을 실시하였다 (Southern 1975). 상추잎에서 분리한 genomic DNA (20 ug)를 HindⅢ로 절단하여 0.8% agarose gel 전기영동 한 후, agarose gel 상의 DNA 밴드를 ZetaR- Probe nylone membrane으로 전이시켰고, GalUR 유전자를 probe로서 32P-dCTPS. 표지하여 60℃ 에서 24시간 hybridizatioii시켰다.
- 또한 본 실험에 사용된 균주의 선발마커는 Kanamycin 저항성을 가졌기 때문에 형질전환체 선발을 위하여 100 mg/L Kanamycin이 첨가되었다. 선발배지에서 살아남은 신초들을 더 확실하게 선발을 하고자 MS배지에 100 mg/L Kanamycin과 200 mg/L Lilacillin만 첨가된 배지에서 신초의 신장과 발근을 유도하였다.
- 재분화된 형질전환체에서 Kanamycin 내성을 갖는 식물체가 정상적으로 자라는 것을 확인함으로써 형질전환 여부를 대략 판단할 수 있었고, 더 정확한 유전자 분석을 하기 위하여 PCR 분석을 실시하였다. 순화된 식물체 본엽에서 genomic DNA를 추출하였다.
- 3C). 차후에 유전자의 도입이 확인된 상추 형질전환 개체들을 2회에 걸쳐 큰 포트로 이식하고 하우스에서 자가수분하여 Ti 종자를 채종하였다 (Fig. 3D).
- 형질전환 상추에서 GalUR 유전자가 확인된 개체들을 가수분해 하여 얻어진 Ti 종자를 파종하였다. 대조구 화흥적축면 상추와 GalUR 형질전환체 T1의 형질을 관찰해본 결과 원예적으로 대조구와 별다른 차이가 없었다 (Fig.
- 형질전환체 (To) 8 line들을 각각 자가수분하여 L 종자를 채종하였다. 비타민 C 함량 분석을 위하여 Ti 형질전환체 종자를 105구 tray에 파종하였다 8 line 각각의 T1 식물 체내에 GalUR 유전자 삽입 유무를 확인하기 위해 본엽 이 3장 정도 나왔을 때 PCR 분석을 수행하였다.
- 화홍적축면 상추 형질전환을 위해 비타민 C를 생합성 하는 GalUR 유전자를 사용하였다. 100 mg/L Kanamycin과 200 mg/L Lilacillin이 첨가된 재분화 (MS, sucrose 3%, BA 0.
대상 데이터
- ) 에 형질 전환하고자 실시하였다. (주)농우바이오의 화홍적축면 상추의 자엽 절편체를 선발배지 (MS + 30g/L Sucrose + 0.5 mg/L BAP + 0.1 mg/L NAA + 100 mg/L Kanamycin + 200 mg/L Lilacillin, pH 5.2.)에 치상하여 3주 경과 후 자엽 절편체의 절단면에서 callus와 신초가 형성되었다. 그 결과 GalUR 유전자로 상추 형질전환을 성공하였고 비타민 C 함량을 분석하였다.
- 비타민 C는 쉽게 파괴되는 영양소이므로, 채취된 시료들을 바로 얼음을 채운 상자에 넣어서 분석전문 기관인 한국식품연구소로 보내 HPLC 분석 방법으로 비타민 C 함량을 측정하였다. 5% metaphosphoric acid 용액에서 시료를 추출하였고, columne C18 (4.6 mm x 250 mm), detector는 UV 254 nm를 사용하였다. Standard curve 값은 Ascorbic acid 표준시약을 사용하여 측정하였다.
- 4). GalUR 유전자가 도입된 상추 형질전환체 To 총 18개체를 확보하였으며 그 형질전환 효율은 약 0.36%였다.
- 이같이 준비된 시료에서 비타민 C 함량을 측정하고자 오래된 잎을 제외한 비슷한 크기의 어린잎을 약 200 g씩 채취하였다. 대조구도 같은 방법으로 3개의 시료를 준비하였다. 비타민 C는 쉽게 파괴되는 영양소이므로, 채취된 시료들을 바로 얼음을 채운 상자에 넣어서 분석전문 기관인 한국식품연구소로 보내 HPLC 분석 방법으로 비타민 C 함량을 측정하였다.
- 본 실험에 사용한 균주는 딸기 유래 유전자 D-galacturinic acid reductase (GqIUR)와 선발마커인 nptH 유전자가 재조합되어진 vector (pGALUR2300, (주)농우바이오)를 포함한 A. tumefaciens EHA 105였다 (Fig. 2). 균주를 YEP (peptone 10 mg/L, yeat-extract 10 mg/L, NaCl 5 mg/L, Kanamycin 50 |ig/ml.
- 사람은 채소를 통해 필수영양소인 L-Ascorbic acid (vitamin C)를 공급받는다. 본 실험의 목적은 비타민 C 생합성 유전자인 GalUR 유전자를 상추 (Lactuca sativa L.
- PCR 분석을 실시하였다. 순화된 식물체 본엽에서 genomic DNA를 추출하였다. PCR 검정을 한 결과 형질전환을 하지 않은 상추에서는 GalUR 유전자 단편이 증폭되지 않았으나, 상추 형질전환체에서는 모두 약 1.
- 비타민 C 함량 분석을 위하여 Ti 형질전환체 종자를 105구 tray에 파종하였다 8 line 각각의 T1 식물 체내에 GalUR 유전자 삽입 유무를 확인하기 위해 본엽 이 3장 정도 나왔을 때 PCR 분석을 수행하였다. 유전자가 확인된 Ti 개체들 중에서 각각의 Ti 12개체를 선발하여 큰 포트로 이식하였다. 이때 대조구로서 형질전환하지 않은 화홍적축면상추도 같이 파종하여 다수 준비하였다.
- 하우스에서 약 2달간 재배한 형질전환 상추 8 line당 T, 12개체에서 생육이 불균일한 것을 제외하고 각각 10점을 모아서 bulk로 시료를 준비하였다. 이같이 준비된 시료에서 비타민 C 함량을 측정하고자 오래된 잎을 제외한 비슷한 크기의 어린잎을 약 200 g씩 채취하였다. 대조구도 같은 방법으로 3개의 시료를 준비하였다.
- 이 결과는 GLOase 유전자 형질전환 상추 T( 세대에서 고함량의 비타민 C를 함유한 결과와 일치한다. 이런 결과를 기초로 하여 비타민 C 고함량 T2 line을 선발하였다.
- 이때 대조구로서 형질전환하지 않은 화홍적축면상추도 같이 파종하여 다수 준비하였다. 하우스에서 약 2달간 재배한 형질전환 상추 8 line당 T, 12개체에서 생육이 불균일한 것을 제외하고 각각 10점을 모아서 bulk로 시료를 준비하였다. 이같이 준비된 시료에서 비타민 C 함량을 측정하고자 오래된 잎을 제외한 비슷한 크기의 어린잎을 약 200 g씩 채취하였다.
성능/효과
- 실시하였다. HindⅢ로 처 리한 결과 대조구에서는 band를 확인할 수 없었으며, 형질전환체의 경우 12 kb~5 kb 사이에서 강한 band가 one copy에서 복수 copy까지 다양하게 확인 되었다. 따라서 외래 유전자 GalUR이 상추 nuclear genome 내로 안정적으로 삽입되었음을 확인하였다 (Fig.
- 순화된 식물체 본엽에서 genomic DNA를 추출하였다. PCR 검정을 한 결과 형질전환을 하지 않은 상추에서는 GalUR 유전자 단편이 증폭되지 않았으나, 상추 형질전환체에서는 모두 약 1.2 kb 크기의 GalUR 유전자의 단편이 증폭된 것으로 확인되었다 (Fig. 4). GalUR 유전자가 도입된 상추 형질전환체 To 총 18개체를 확보하였으며 그 형질전환 효율은 약 0.
- )에 치상하여 3주 경과 후 자엽 절편체의 절단면에서 callus와 신초가 형성되었다. 그 결과 GalUR 유전자로 상추 형질전환을 성공하였고 비타민 C 함량을 분석하였다. 대조 구에 비하여 상추 형질전환체 line에서 높은 함량의 비타민 C 특히, GalUR 유전자가 삽입된 T, 중 일부는 비형 질 전환 체에 비해 3~4배 높은 비타민 C 함량을 나타내었다.
- 33 mg/100 g 정도 나타났다. 그 결과 형질전환체 모두 대조구 보다 높은 비타민 C 함량을 보였으며, 특히 대조 구에 비해서 비타민 C 함량이 3~4배 높은, line을 선발할 수 있었다 (Fig. 7). 쥐에서 유래된 비타민 C 생합성에 관여하는 GLOase 유전자 형질전환 담배와 상추에서도 비타민 C 가 대조구에 비해 7배 증가하였다는 보고가 있다.
- 그 결과 GalUR 유전자로 상추 형질전환을 성공하였고 비타민 C 함량을 분석하였다. 대조 구에 비하여 상추 형질전환체 line에서 높은 함량의 비타민 C 특히, GalUR 유전자가 삽입된 T, 중 일부는 비형 질 전환 체에 비해 3~4배 높은 비타민 C 함량을 나타내었다. 이 결과는 GLOase 유전자 형질전환 상추 T( 세대에서 고함량의 비타민 C를 함유한 결과와 일치한다.
- 하여 얻어진 Ti 종자를 파종하였다. 대조구 화흥적축면 상추와 GalUR 형질전환체 T1의 형질을 관찰해본 결과 원예적으로 대조구와 별다른 차이가 없었다 (Fig. 6).
- 계대배양 후 녹색을 띠며 잘 자라는 신초가 있는 반면, 성장을 멈추고 백화되는 신초도 많이 발생되었다 (자료 미제시). 더 확실한 선발을 위하여 발근 배지에 100 mg/L Kanamycin 을 첨가하여 뿌리를 유도 하였는데, 뿌리가 형성되지 못하고 백화 되고 성장을 멈추는 개체들도 있었지만, 대부분 유도된 녹색의 신초들은 발근이 잘되었다. 발근된 식물체들을지피포트에 옮겨 안정적으로 순화를 하고 본엽이 전개되면서 보다 큰 포트로 이식하여 순화실에서 순화하였다 (Fig.
- HindⅢ로 처 리한 결과 대조구에서는 band를 확인할 수 없었으며, 형질전환체의 경우 12 kb~5 kb 사이에서 강한 band가 one copy에서 복수 copy까지 다양하게 확인 되었다. 따라서 외래 유전자 GalUR이 상추 nuclear genome 내로 안정적으로 삽입되었음을 확인하였다 (Fig. 5).
- 본 실험 결과 GalUR 유전자가 형질전환된 상추에서 비타민 C 생합성에 관여하여 비타민 C 함량을 높인다는 사실을 알 수 있었다. 상추내로 도입된 비타민 C 생합성 유전자가 후대에도 유전되어 제 기능을 하는지 확인하기 위해 비타민 C 함량이 높게 나온 6 line을 선정하여 T2 종자를 수확하였다.
- 또한 Kim 등 (2004)의 보고에서도 역시 GLOase 유전자가 도입된 상추 형 질전환체에서 대조구에 비해 비타민 c 함량이 높은 몇몇 개체가 확인되었다. 본 실험 결과에서 주목 할점은 Agius 등 (2003)의 실험에서 언급 하였듯이 딸기에서 유래된 GalUR 유전자를 형질전환 할 경우 비타민 C 생합성이 대조구에 비해 형질전환체의 경우 더 높게 합성됨을 알 수 있었고, 특히 주로 생식으로 섭취하는 상추의 경우 식물에서 유래된 유전자라는 사실 때문에 소비자들의 거부감이 한층 줄어들 것으로 기대된다.
후속연구
- 상추는 비타민과 무기질이 풍부한 채소이긴 하나, 다른 채소에 비하여 상대적으로 비타민 C 함량이 낮다. 항암작용과 노화방지 등에 탁월한 효능을 지닌 필수 영양소 비타민 C의 관심이 높은 시점에서, 우리 식단에서 쉽게 접할 수 있는 상추에 비타민 c 증진 유전자를 도입하여 비타민 C 함량이 월등히 높은 신품종을 개발한다면 큰 효과가 기대된다.
- 상추내로 도입된 비타민 C 생합성 유전자가 후대에도 유전되어 제 기능을 하는지 확인하기 위해 비타민 C 함량이 높게 나온 6 line을 선정하여 T2 종자를 수확하였다. 향후 자연 온도 조건이 맞아 재배하기 쉽고, T1과 비슷한조건하에 비타민 C 함량을 측정하고자 다음해 봄에 T2를 파종할 계획이다.
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