[논문]양배추와 무의 동형 원형질체 융합을 이용한 식물체의 재분화

인동수; 송민정; 장인창; 민병환; 남석현; 신종섭; 이시우; 한지학

doi:10.5010/jpb.2008.35.2.121

양배추와 무의 동형 원형질체 융합을 이용한 식물체의 재분화
Regeneration of symmetric protoplast fusion between cabbage (Brassica oleracea L.) and radish (Raphanus sativus L.) 원문보기

Journal of plant biotechnology = 식물생명공학회지, v.35 no.2, 2008년, pp.121 - 126

인동수 ((주) 농우바이오 생명공학연구소) , 송민정 ((주) 농우바이오 생명공학연구소) , 장인창 ((주) 농우바이오 생명공학연구소) , 민병환 (경북대학교 생명자원과학대학 식물자원학과) , 남석현 ((주) 농우바이오 생명공학연구소) , 신종섭 ((주) 농우바이오 생명공학연구소) , 이시우 ((주) 농우바이오 생명공학연구소) , 한지학 ((주) 농우바이오 생명공학연구소)

초록
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양배추와 무로부터 원형질체를 분리하였고 PEG 처리를 통하여 융합을 하였다. 고농도의 원형질체 혼합물로부터 많은 미소괴를 관찰할 수 있었다. 미소괴는 정상적인 캘러스로 자랐고 이들 캘러스로부터 총 218개의 신초가 재분화 되었다. 재분화된 개체는 순화 과정을 거처 온실에서 재배하였다. 순화된 208개체를 대상으로 마커 검정을 통하여 융합 여부를 확인한 결과, 모두 무의 NWB-CMS에 특이적인 PCR 산물을 확인할 수 없었다. 그러나 ISSR분석을 통하여 208개체 중 3개체에서 양배추와 무의 세포가 융합됨을 확인하였다. 이를 통하여 원형질체의 융합이 성공적으로 일어났음을 증명할 수 있었다. 세포융합이 일어난 3개체는 모두 양배추와 무의 형질을 보이는 중간적인 형태를 가지고 있었다. 이들은 춘화처리를 거쳐 모두 개화 되었으나 꽃의 색깔이 무의 형질과 같은 흰색이었고 이중 한 개체에서만 역교배를 통하여 3개의 종자를 얻었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Protoplasts from cabbage and radish were isolated and fused symmetrically by PEG treatment. The PEG treated mixture of high concentrated protoplasts produced lots of micro-calli after $2{\sim}3$ weeks. The microcalli developed to normal calli and shoots were regenerated from the calli. A total of 218 shoots were regenerated, but none of them contained the NWB-CMS specific DNA marker, indicating that the transfer of the radish NWB-CMS character into cabbage did not occur. However, ISSR analysis revealed that the cell fusion between protoplasts from radish and cabbage was occurred (3 out of 208 plantlet). The fused regenerants possessed the characteristics of source plants used for protoplast fusion. After vernalization, three regenerants were flowered with white petal color as seen in radish. Only three seeds were able to obtain from one regenerant by backcrossing with the cabbage pollen.

AI 본문요약
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문제 정의

일반적으로 원형질체를 분리하기 위해 Cellulase와 Macerozyme의 조합을 사용하고 일부 효율을 높이기 위해 Pectolyase를 이용하기도 한다. 본 실험에서는 각각의 식물재료에 따른 최적화된 효소 조합을 조사하였다. 먼저 양배추의 하배축을 이용한 실험에서 Cellulase 1%, Macerozyme 0.
그러나 마커 분석 결과 무의 세포질 웅성불임인자가 양배추로 전이가 되지 않았고 결실을 맺은 융합체 역시 자가수분이 불안정한 이질배수체로 추정되며 따라서 양배추 육종의 목적에 사용이 적절치 않았다. 본 연구는 현재 진행중인 무의 웅성 불임 형질을 나타내는 미토콘드리아를 선택적으로 양배추에 도입할 수 있는 이종간의 비대칭 융합 시스템의 구축과 비대칭 원형질 융합체의 재분화가 필요함을 제안하는 기초 자료로 사려된다.
현재 (주) 농우바이오는 개발한 NWB-CMS 인자를 십자화과 작물에 전이 시켜 십자화과 전체작물의 육종에 이용하기 위한 육성 소재를 개발하고자 한다. 이를 위하여 먼저 양배추와 무의 원형질체를 대칭융합을 통하여 식물체를 확보하고 세포 융합시스템이 정상적으로 진행되는지를 확인하고자 하였다.
2005) 이를 무의 육성프로그램에 적용하고 있다. 현재 (주) 농우바이오는 개발한 NWB-CMS 인자를 십자화과 작물에 전이 시켜 십자화과 전체작물의 육종에 이용하기 위한 육성 소재를 개발하고자 한다. 이를 위하여 먼저 양배추와 무의 원형질체를 대칭융합을 통하여 식물체를 확보하고 세포 융합시스템이 정상적으로 진행되는지를 확인하고자 하였다.

제안 방법

218개의 신초 중에 순화하여 온실에 옮긴 원형질융합 유래 재분화체 중, 정상적으로 발달한 208개의 독립적인 개체로부터 융합여부를 확인하기 위하여 본엽이 2~3매 출현한 시기에 각각 본엽을 채취하여 DNA를 추출하였다. NWB-CMS 특이 Primer를 이용하여 PCR 반응을 한 결과 NWB-CMS에 특이적인 PCR 산물을 확인할 수 없었다 (Fig.
PEG로 융합된 원형질체는 2% glucose, 7% mannitol, BAP 1 mg/L, NAA 1 mg/L, 2, 4-D 0.25 mg/L가 첨가된 MS 액체배지에서 25℃의 암상태에서 배양을 실시하였다. 약 3~4주의 배양을 지속하면 육안으로 미소괴를 관찰하고 이를 kinetin 5 mg/L, 2, 4-D 0.
Genomic DNA를 추출하였다. Primei는 NWB 웅성불임 특이적 인 조합과 (Nahm et al. 2005), 핵의 융합 여부를 확인을 위한 양배추와 무에서 서로 다른 특이적인 밴드를 보이는 ISSR primer 834: 5' -AGAGAGAGAGAGAGAG(CT)T-3', 853: 5'-TCTCTCTCTCTCTCTC(AG)T-3'을 사용하였고 Ex-Taq polymerase (Takara Co.)로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 조건은 pre-denaturetione 94℃에서 5분간, 이후 denaturatione 94℃ 에서 30초, annealinge 50℃ 1분, extensione 72℃에서 1분간 45 cycle을 하였으며 last extensione 72 ℃에서 5분간 수행하였다.
4 M mannitol 용액에 첨가하고, 28 ℃의 암상태에서 12시간가량 30~40 RPM으로 진탕하였다. 각 처리구별로 효소 처리가 끝난 조직을 125 ㎛와 80 ㎛의 pore size 스텐레스망을 통과시킨 후, 15 mL conical tube에 원형질체만 모아 100xg에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 침강한 원형질체를 CPW + 0.
원형 질 분리 효소를 처리하기 전에 CPW13M, TVL 용액 등의 고장액으로 삼투작용이 일어나도록 처리하면 원형질 분리 효율이 높아지는데 (Lian and Lim 2001), 본 실험에서도 효소처리 전에 각각의 재료들을 TVL 용액에 1 ~2시간 동안 침지한 뒤에 원형질을 분리해본 결과 역시 원형질 분리 효율이 높은 것을 확인할 수 있었다 (데이타 미제시). 또한 원형질 분리 효율을 높이기 위하여 원형질 분리 효소의 종류와 농도가 중요하여 처리구 모두를 고장액 인 TVL 용액으로 침지한 후 여러 효소 조합별 원형 질 유리 정도를 확인하였다 (Table 1). 일반적으로 원형질체를 분리하기 위해 Cellulase와 Macerozyme의 조합을 사용하고 일부 효율을 높이기 위해 Pectolyase를 이용하기도 한다.
무균발아 후 5~21일이 지난 양배추의 하배축과 무의 잎을 메스로 잘게 썬 후 원형질 분리를 위한 효소 Cellulase Onozuka RS (SERVA Electrophoresis, Germany) 1 ~ 2%, Macerozyme (SERVA Electrophoresis, Germany) 0.1 ~0.5%, Pectolyase (YAKULT, Japan) 0.1 %를 여러 농도로 조합하여 0.4 M mannitol 용액에 첨가하고, 28 ℃의 암상태에서 12시간가량 30~40 RPM으로 진탕하였다. 각 처리구별로 효소 처리가 끝난 조직을 125 ㎛와 80 ㎛의 pore size 스텐레스망을 통과시킨 후, 15 mL conical tube에 원형질체만 모아 100xg에서 5분간 원심분리하였다.
본 실험에서는 양배추와 무의 원형질 분리 조건을 확립하였고, 분리된 원형질체를 화학적 융합 방법을 통하여 동형융합에 의한 핵이 융합된 형태의 융합체를 획득하였다. 그러나 마커 분석 결과 무의 세포질 웅성불임인자가 양배추로 전이가 되지 않았고 결실을 맺은 융합체 역시 자가수분이 불안정한 이질배수체로 추정되며 따라서 양배추 육종의 목적에 사용이 적절치 않았다.
25 mg/L가 첨가된 MS 액체배지에서 25℃의 암상태에서 배양을 실시하였다. 약 3~4주의 배양을 지속하면 육안으로 미소괴를 관찰하고 이를 kinetin 5 mg/L, 2, 4-D 0.5 mg/L가 첨가된 MS 반고체 배지로 옮겨서 16:8 (광:암)의 배양실에서 캘러스의 발달을 유도하였다. 유도된 캘러스는 Zeatin 2 mg/L, GA3 0.
양배추와 무로부터 원형질체를 분리하였고 PEG 처리를 통하여 융합을 하였다. 고농도의 원형질체 혼합물로부터 많은 미소괴를 관찰할 수 있었다.
양배추와 무의 원형질체 융합을 통해 재분화된 개체 중 PCR 반응에서 NWB-CMS 계통의 미토콘드리아가 전이된 것으로 확인된 개체를 대상으로 2달간의 저온 춘화처리를 통하여 원형질융합체를 개화시켜 화기구조 및 형태적 특성을 조사하고 결실 및 종자발달 여부를 확인하였다.
양배추의 하배축과 NWB-CMS 무의 잎으로부터 분리된 원형질체 (Fig. 1A, B)를 PEG 8000을 이용하여 화학적 융합 방법으로 원형질 융합을 수행하였다. 분리된 각각의 원형질을 부피비 1:1 비율로 섞은 후 약 10분 정도의 원형질 침지 과정을 거친 후 PEG 융합 용액을 첨가하면 각각의 원형질체의 간극이 서서히 줄어들면서 융합이 되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig.
웅성불임 인자를 전이를 확인하기 위해 양배추와 무와 융합체의 잎으로부터 Dellaporta 등 (1983)의 방법을 약간 변형하여 Genomic DNA를 추출하였다. Primei는 NWB 웅성불임 특이적 인 조합과 (Nahm et al.
각 처리구별로 효소 처리가 끝난 조직을 125 ㎛와 80 ㎛의 pore size 스텐레스망을 통과시킨 후, 15 mL conical tube에 원형질체만 모아 100xg에서 5분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상등액을 제거하고 침강한 원형질체를 CPW + 0.4 M mannitol 용액에 희석한 뒤 (Frearson et al. 1973), CPW + 21% Sucrose 용액을 이용하여 100xg에서 5분간 밀도구배 원심분리하여 상층부에 형성된 밴드에서 순수한 원형질체만을 분리하고 W5 용액으로 3회 수세하여 CPW + 0.4 M mannitol 용액에 원형질체를 현탁 한 뒤 혈구측정기를 이용하여 농도를 측정하였다
원형질 융합은 PEG (M.W. 8000, 25%) 방법을 약간 변형하여 이용하였다 (Yamanaka et al. 1992). 먼저 분리된 원형질체의 밀도는 양배추는 2 × 106/mL로, 무는 4 × 106/mL의 농도로 원형질체를 현탁희석용액 (CPW + 0.
5 mg/L가 첨가된 MS 반고체 배지로 옮겨서 16:8 (광:암)의 배양실에서 캘러스의 발달을 유도하였다. 유도된 캘러스는 Zeatin 2 mg/L, GA3 0.035 mg/L + agar 1.6%가 첨가된 MS 배지에서 신초를 유도하고 유도된 신초는 호르몬이 첨가되지 않은 1/2 MS 배지에서 뿌리를 유도 후 순화하여 온실에서 외부형태를 관찰하였다.
PCR 조건은 pre-denaturetione 94℃에서 5분간, 이후 denaturatione 94℃ 에서 30초, annealinge 50℃ 1분, extensione 72℃에서 1분간 45 cycle을 하였으며 last extensione 72 ℃에서 5분간 수행하였다. 합성된 DNA는 1% agarose gel에서 전기영동 후, 밴드의 양상을 관찰하였다.

대상 데이터

실험재료로 사용한 종자는 (주)농우바이오에서 육성한 양배추 순계 인 HNA과 NWB-CMS 형질을 가진 F1 계열의 무를 무균발아하여 사용하였다.
미소괴는 정상적인 캘러스로 자랐고 이들 캘러스로부터 총 218개의 신초가 재분화 되었다. 재분화된 개체는 순화 과정을 거처 온실에서 재배하였다. 순화된 208개체를 대상으로 마커 검정을 통하여 융합 여부를 확인한 결과, 모두 무의 NWB-CMS에 특이적인 PCR 산물을 확인할 수 없었다.

성능/효과

PCR분석 결과 NWB-CMS 무와 양배추간의 핵의 융합이 일어난 것으로 확인된 3개의 독립개체는 발근과 개체의 발달 과정에서는 특이할 만한 사항은 없었다. 그러나 형태적으로 정도의 차이는 있었으나 무와 양배추의 중간형태의 잎을 가지고 있는 것으로 나타났다 (Fig.
순화된 208개체를 대상으로 마커 검정을 통하여 융합 여부를 확인한 결과, 모두 무의 NWB-CMS에 특이적인 PCR 산물을 확인할 수 없었다. 그러나 ISSR 분석을 통하여 208 개체 중 3개체에서 양배추와 무의 세포가 융합됨을 확인하였다. 이를 통하여 원형질체의 융합이 성공적으로 일어났음을 증명할 수 있었다.
2B, C). 따라서 PEG 융합을 통하여 재분화된 개체 중 1.4%에서 원형질체 간의 융합이 일어났음을 확인할 수 있었다.
일반적으로 양배추의 하배축에서 유래된 원형질체는 30 -120 ㎛ 정도의 크기를 보였으며, 무의 잎으로부터 유리한 원형질체는 약 20-40 ㎛의 크기로 상대적으로 작았으나 원형질체 수가 매우 많았다. 따라서 특별히 Pectolyase 첨가 없이 Cellulase 2%, Macerozyme 0.2%의 효소조합을 선택하여 사용하였다 위의 결과를 통해 원형질체 유리를 위한 중요 요인은 배양에 사용하는 식물조직의 세포벽을 효율적으로 녹일 수 있는 적절한 효소의 조합과 농도이며 또한 고장액을 이용한 전처리 역시 중요함을 확인하였다. 이 밖에도 원형질 분리에 사용되는 식물의 종류, 조직의 종류, 식물의 생육 조건, 원형질 분리 온도 및 시간, 진탕 속도와 시간도 원형질 분리에 영향을 미치는 것으로 실험을 통해 알 수 있었다 (데이타 미제시).
2A). 따라서, 원형질융합을 통하여 무의 세포질의 유전물질의 전이가 일어나지 않은 것으로 추정할 수 있었다. 이에 원형질체 융합이 통해 정상적으로 세포융합이 일어났는지를 확인하기 위해 각각 무와 양배추에서 게놈에 특이적인 밴드를 보이는 ISSR Primer (834, 853)를 이용하여 PCR 반응 결과 208 개의 독립 개체 중 3 개체에서 무와 양배추에 특이적인 밴드를 모두 가지고 있는 개체를 확인할 수 있었다 (Fig.
본 실험에서는 각각의 식물재료에 따른 최적화된 효소 조합을 조사하였다. 먼저 양배추의 하배축을 이용한 실험에서 Cellulase 1%, Macerozyme 0.1%를 기준으로 Macerozymle의 농도를 2배로 하여 원형질 분리를 수행해본 결과 원형질체 유리율이 약 20배 정도 높아졌으며 이 조건에서 다시 Cellulase의 농도를 2배로 올렸을 때 원형질체의 유리가 다시 약 4.5배가 높아지는 것을 확인하였다. 이와는 독립적으로 Cellulase 1%, Macerozyme 0.
1A, B)를 PEG 8000을 이용하여 화학적 융합 방법으로 원형질 융합을 수행하였다. 분리된 각각의 원형질을 부피비 1:1 비율로 섞은 후 약 10분 정도의 원형질 침지 과정을 거친 후 PEG 융합 용액을 첨가하면 각각의 원형질체의 간극이 서서히 줄어들면서 융합이 되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 1C). PEG를 이용한 원형질체 융합은 해부현미경하에서 수행하였으며 약 5~10분 정도의 시간이 소요되었다.
재분화된 개체는 순화 과정을 거처 온실에서 재배하였다. 순화된 208개체를 대상으로 마커 검정을 통하여 융합 여부를 확인한 결과, 모두 무의 NWB-CMS에 특이적인 PCR 산물을 확인할 수 없었다. 그러나 ISSR 분석을 통하여 208 개체 중 3개체에서 양배추와 무의 세포가 융합됨을 확인하였다.
따라서, 원형질융합을 통하여 무의 세포질의 유전물질의 전이가 일어나지 않은 것으로 추정할 수 있었다. 이에 원형질체 융합이 통해 정상적으로 세포융합이 일어났는지를 확인하기 위해 각각 무와 양배추에서 게놈에 특이적인 밴드를 보이는 ISSR Primer (834, 853)를 이용하여 PCR 반응 결과 208 개의 독립 개체 중 3 개체에서 무와 양배추에 특이적인 밴드를 모두 가지고 있는 개체를 확인할 수 있었다 (Fig. 2B, C). 따라서 PEG 융합을 통하여 재분화된 개체 중 1.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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