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문제 정의
- 본 연구에서는 STZ유도 당뇨모델에서 가시오가피 (Acanthopanax senticosus) 부위별 추출물의 혈당강하 효과 및 GLUT2및 GLUT4 유전자 발현에 미치는 영향을 규명하고자 하였다. 이를 위하여 가시오가피 뿌리 1 kg, 줄기 1 kg, 과실 500 g을 각각 음건/세절하여 50% 아세톤 수용액으로 추출하여 물층과 부탄올 층으로 구분하여 분말화하여 STZ 유도 당뇨모델 평가 및 GLUT 유전자 발현 분석에 이용하였다 (Fig.
- 본 연구에서는 국내산 가시오가피의 뿌리, 줄기, 과실 추출물의 Streptozotosin유도 당뇨모델에서의 혈당강하 효과를 확인하였으며, 각 부위별 추출물의 포도당 수송에 관여하는 단백질인 GLUT2와 GLUT4의 유전자 발현 평가를 통하여 GLUT4의 발현증가를 통한 말초조직으로의 포도당 수송에 도움이 되는 가시오가피의 부위별 추출물을 탐색하고자 하였다.
가설 설정
- 억제된 제2형 당뇨병으로 나뉠 수 있다.11) 혈중 포도당의 항상성은 생체기관의 다양한 작용의 결과로 유지된다.고혈당의 결과로 혈중 포도당은 glucose transpoter 2 (GLUT2)를 통하여 수송되어 췌장의 베타세포에서 인슐린 분비가 개시되도록 한다.
제안 방법
- 고혈당의 결과로 혈중 포도당은 GLUT2를 통하여 수송되어 췌장의 베타세포에서 인슐린 분비가 개시되도록 하며, 분비된 인슐린은 GLUT4를 통하여 혈중 포도당이 근육세포로 유입되도록 한다.12, (3) 따라서, 가시오가피 추출물이 STZ유도 모델에서 나타난 바와 같이 혈중 포도당을 조절하므로 혈중포도당과 glucose transporter (GLUT) 유전자 발현과의 관계를 규명하기 위하여 근육세포로 분화된 C2C12세포주에 가시오가피 부위별 추출물을 처리하여 GLUT유전자의 발현을 Real time PCR로 측정하였.다.
- C2C12세포를 dextran-charcoaled FBS를 첨가한 GM 배지에 37, 5% CO2 조건하에서 MlOeells/ml 개 분주하고, 72시간 배양한 후 세포의 수가 약 80% T75 flasH 채워졌을 때, 2% horse serum이 첨가된 DMEM배지로 교환하여 근육세포로 분화하였다. ⑺ 근육세포로 분화시 가시오가피 추출물을 각각 50μg/ml을 처리하여 24시간 배양한 후 PBS로 세척하여 1ml TRIzol™ (Invitrogen)을 이용하여 RNA를 분리하였, 다.
- 다. GLUT2 및 GLUT4의 primer는 Forward: 5'-TTAGCAACTGGGTCTGCAAT-3'; Reverse: 5'-GGTGTAGTCCTACACTCATG-3'과 Forward: 5'- ATGTGTGGCTGTGCCATCTT-3';Reverse: 5'GGTTTCACCTCCTGCTCTAA-3' 이용하였으며, 95℃에서 60초간 pre-running 후, 95℃에서 10초, 56℃에서 15초, 72℃에서 20초, 82에서 6초의 간격으로 40회 반복하여 증폭하였다.18)
- ⑺ 근육세포로 분화시 가시오가피 추출물을 각각 50μg/ml을 처리하여 24시간 배양한 후 PBS로 세척하여 1ml TRIzol™ (Invitrogen)을 이용하여 RNA를 분리하였, 다. Real time PCRe DNA Master Cyber Green (Roche, CA, USA)를 이용하여 MylQ iCycler (Bio-Rad, CA, USA)에서 실시하였.다.
- 1). STZ로 유도한 당뇨모델에서 STZ로 유도된 웅성 흰쥐를 음성대조군 (V, vehicle)으로 하고, 가시오가피 부위별 추출물 (뿌리, 줄기, 과실 물층 : RW, SW, FW 및 뿌리 , 줄기 , 과실 부탄올층 : RB, SB, FB)을 100㎎/㎏ b.w 를 경구투여 한 실험군을 정상대조군 (Con)과 비교하였다. STZ로 유도하지 않은 정상군 (Con)의 혈당은 105.
- w 용량으로 1일 1회 6일간 경구투여하였다. STZ유도군 (Vehicle), 정상군, 가시오가피 추출물 투여군을 최종 투여 후 24시간 후에 ether 마취하에 개복하여 복부 대동맥으로부터 채혈한 후 원심분리하여 혈청을 취하여 생화학분석에 이용하였다. 복부대동맥에서 채취된 혈액을 혈청 분리 관 (RM603PS, latron Co.
- Streptozotocin (STZ) 유도 당뇨 모델 - 체중 200 g 내외의 Spargue-Dawley계 웅성 흰쥐를 1주일간 순화시킨 후 STZ을 60 ㎎/㎏, b.w 용량으로 0.01 M citric acid 에 녹여 2 mL/kg, b.w 용량으로 복강주사 하였다. 정상군, 당뇨 유발대조군 (VehicleM 비교하기 위하여 가시오가피 추출물을 뿌리 , 줄기 , 과실의 물추출물 (RW, SW, FW)과 뿌리 , 줄기 , 과실의 부탄올 추출물 (RB, SB, FB)을 평균체중에 맞추어 100㎎/㎏, b.
- 가시오가피 과실의 부탄올 추출물 (FB)의 GLUT4 유전자 발현을 정확하게 측정하기 위하여 FB추출물 0, 2, 4, 8, 16, 32 및 64 μg/ml을 처리하여 GLUT4 유전자의 발현을 재평가 하였다. 그 결과, 8 pig/ml 이상의 FB 추출물 처리시 약 2~5.
- 가시오가피 추출물의 혈중 포도당의 조절 기능을 규명하기 위하여 C2C12 myoblast 세포주로부터 2%의 horse serum이 첨가된 DMEM 배지로 근육세포로 분화유도 후, GLUT2와 GLUT4 유전자의 발현을 측정하였다. 고혈당의 결과로 혈중 포도당은 GLUT2를 통하여 수송되어 췌장의 베타세포에서 인슐린 분비가 개시되도록 하며, 분비된 인슐린은 GLUT4를 통하여 혈중 포도당이 근육세포로 유입되도록 한다.
- , 미국)를 사용하여 5,000 rpm에 10분간 원심분리하였다. 분리된 혈청은 deep freezer (-70℃)에 보관하였으며 , 생화학 자동분석기 (Advia 1650, Jeol Co., 일본)를사용하여 혈중 GLU 함량을 측정하였다.
- 세포배양 및 GLUT 유전자 발현 측정 - GLUT2 및 GLUT4유전자의 발현을 평가하기 위하여 C2C12 myoblast 세포를 horse serum 자극에 의하여 근육세포로 분화하여 인슐린 자극에 의한 포도당의 유입을 조절하는 GLUT2 및 GLUT4 유전자를 Real time PCR로 평가하였다. C2C12세포를 dextran-charcoaled FBS를 첨가한 GM 배지에 37, 5% CO2 조건하에서 MlOeells/ml 개 분주하고, 72시간 배양한 후 세포의 수가 약 80% T75 flasH 채워졌을 때, 2% horse serum이 첨가된 DMEM배지로 교환하여 근육세포로 분화하였다.
- 사료는 삼양유지(주)의 소동물용 고형사료를 사용하였으며, 물은 상수를 사용하여 충분히 공급하면서 실험실 환경에서 1주간 순화시킨 후 사용하였다. 실험 기간 중 사육실 환경조건은 실내온도 23±1℃, 상대습도 55±5%, 환기회수 10-18 회/hr 으로 하였으며, timer를 이용하여 12 시간씩 명암을 주기적으로 교환하였고, 조도는 300-500 Lux 로 하였다.
- 하였다. 이를 위하여 가시오가피 뿌리 1 kg, 줄기 1 kg, 과실 500 g을 각각 음건/세절하여 50% 아세톤 수용액으로 추출하여 물층과 부탄올 층으로 구분하여 분말화하여 STZ 유도 당뇨모델 평가 및 GLUT 유전자 발현 분석에 이용하였다 (Fig. 1). STZ로 유도한 당뇨모델에서 STZ로 유도된 웅성 흰쥐를 음성대조군 (V, vehicle)으로 하고, 가시오가피 부위별 추출물 (뿌리, 줄기, 과실 물층 : RW, SW, FW 및 뿌리 , 줄기 , 과실 부탄올층 : RB, SB, FB)을 100㎎/㎏ b.
- w 용량으로 복강주사 하였다. 정상군, 당뇨 유발대조군 (VehicleM 비교하기 위하여 가시오가피 추출물을 뿌리 , 줄기 , 과실의 물추출물 (RW, SW, FW)과 뿌리 , 줄기 , 과실의 부탄올 추출물 (RB, SB, FB)을 평균체중에 맞추어 100㎎/㎏, b.w 용량으로 1일 1회 6일간 경구투여하였다. STZ유도군 (Vehicle), 정상군, 가시오가피 추출물 투여군을 최종 투여 후 24시간 후에 ether 마취하에 개복하여 복부 대동맥으로부터 채혈한 후 원심분리하여 혈청을 취하여 생화학분석에 이용하였다.
대상 데이터
- 사용하였다. 사료는 삼양유지(주)의 소동물용 고형사료를 사용하였으며, 물은 상수를 사용하여 충분히 공급하면서 실험실 환경에서 1주간 순화시킨 후 사용하였다. 실험 기간 중 사육실 환경조건은 실내온도 23±1℃, 상대습도 55±5%, 환기회수 10-18 회/hr 으로 하였으며, timer를 이용하여 12 시간씩 명암을 주기적으로 교환하였고, 조도는 300-500 Lux 로 하였다.
- 실험동물 - 본 실험에서 사용된 실험 동물은 주 중앙동물실험에서 구입한 200 g 전후의 Spargue-Dawley계 웅성 흰쥐를 사용하였다. 사료는 삼양유지(주)의 소동물용 고형사료를 사용하였으며, 물은 상수를 사용하여 충분히 공급하면서 실험실 환경에서 1주간 순화시킨 후 사용하였다.
- 실험재료 - 본 실험에서는 (주)일송정(수원)으로부터 구입한 가시오가피 (Acanthopanax senticosuse: 정확히 감별하여 사용하였으며, 가시오가피 뿌리, 줄기, 과실을 건조시킨후 분쇄하여 50% 아세톤 수용액으로 60℃에서 2시간 환류 추출하였다. 여과후40에서 감압농축하여 아세톤 성분을 제거하고 수상만 남도록 하였다.
데이터처리
- 통계학적 분석 - 모든 시험결과는 평균권±표준오차로 나타내었으며, 대조군과 투여군 사이의 통계학적 유의성eDunnetfs test를 이용하여 P<0.05, P<0.01 수준에서 검증하였다.
성능/효과
- 고혈당 조건에서 인슐린에 의해 활성화된 GLUT4는 말초조직으로의 포도당 유입을 증가시켜 체내의 포도당 항상성을 유지하는 주요한 역할을 하고 있다. 19) 본연구의 결과 가시오가피 과실의 부탄올 추출물에 의하여 GLUT4의발현이 증가하므로 가시오가피 과실 부탄올 추출물은 인슐린에 의한 GLUT4 발현 및 활성조절에 관여하는 PI3-kinase, Akt 등 다양한 세포신호전달자와 함께 GLUT4의 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.14, 19)
- w 를 경구투여 한 실험군을 정상대조군 (Con)과 비교하였다. STZ로 유도하지 않은 정상군 (Con)의 혈당은 105.4 ± 22.51 이었으며 , 60 ㎎/㎏ STZ 복강투여로 인한 당뇨유발 웅성 흰쥐 (V, vehicle)는 185±36.21 인데 반하여, 줄기 물층 (SW) 은통계적으로 유의성 있게 (P<0.05) 혈당저하 효과를 나타내었으며, 뿌리 물층(RW) 또한 통계적으로 유의성은 없었으나 혈당저하 효과를 나타내었다. 반면, 가시오가피 뿌리, 줄기 , 과실의 부탄올 층 (SB, RB, FB)은 모두 통계적으로 유의성 있게 혈당저하 효과를 나타내었다.
- 가시오가피 부위별 각각의 추출물을 50 pig/ml 처리시, GLUT2 유전자는 가시오가피 과실 물추출물 (FW)외에 다른 부위의 물 및 부탄올 추출물에서는 발현에 변화가 없었으며, FW 처리시 가시오가피 추출물을 처리하지 않은 정상의 세포 (Con)에 비해 GLUT2 유전자 발현이 약 4배 이상 증가하였다. 이와 같은 결과는 가시오가피 과실 물 추출물에 함유되어 있는 포도당 및 포도당과 유사한 다양한 당에 의하여 GLUT2 발현이 유도된 것으로 생각되었다.
- 하였다. 그 결과, 8 pig/ml 이상의 FB 추출물 처리시 약 2~5.5배의 GLUT4유전자 발현 증가가 나타났다 (Fig. 4).
- 이와 같은 결과는 가시오가피 과실 물 추출물에 함유되어 있는 포도당 및 포도당과 유사한 다양한 당에 의하여 GLUT2 발현이 유도된 것으로 생각되었다. 근육세포로의 포도당 수송에 관여하는 GLUT4 유전자 발현에서는 가시오가피의 모든 부위의 물추출물 (FW SW RW)에서 유전자 발현에 미치는 영향이 관찰되지 않았으나, 부탄올 추출물 (FB, SB, RB)에서 GLUT4 유전자가 가시오가피를 처리하지 않은 정상의 세포 (Con:에 비하여 약 2.5~6배까지 발현이 증가되었다. 특히, 가시오가피 과실 부탄올 추출물 (FB)에서 GLUT4 유전자가 6배 이상 증가됨을 확인하였다.
- 특히, 가시오가피 과실 부탄올 추출물 (FB)에서 GLUT4 유전자가 6배 이상 증가됨을 확인하였다. 따라서, 가시오가피 과실 부탄올 추출물 (FB)은 GLUT4유전자 발현을 증가시킴으로써 혈중 포도당의 근육세포로의 유입을 증가시켜 혈당저하 효과를 나타낼 것으로 생각된다. (Fig.
- 5~6배까지 발현이 증가되었다. 특히, 가시오가피 과실 부탄올 추출물 (FB)에서 GLUT4 유전자가 6배 이상 증가됨을 확인하였다. 따라서, 가시오가피 과실 부탄올 추출물 (FB)은 GLUT4유전자 발현을 증가시킴으로써 혈중 포도당의 근육세포로의 유입을 증가시켜 혈당저하 효과를 나타낼 것으로 생각된다.
후속연구
- 본 연구의 결과, 가시오가피 추출물은 STZ유도 당뇨 모델에서 특히, 부탄올 추출물이 혈당강하 효과가 있는 것으로 생각되며, 가시오가피의 다양한 부위 중 과실의 부탄올 추출물은 STZ유도 당뇨모델에서의 혈당강하 효과와 더불어 GLUT4 발현을 조절함으로써 체내의 포도당 항상성 유지에 도움을 줌으로써 당뇨병의 예방과 치료제 역할을 할 것으로 기대된다. 본 연구의 결과는 STZ유도 당뇨모델과 C2C12 로부터 근세포로 분화된 in 조건에서 시험된 결과이나, 향후 가시오가피 과실의 부탄올 추출물로부터 유효성분을 규명하고, GLUT4 활성조절에 미치는 영향을 다양한 세포 및 동물시험 에서 규명 한다면, 생 약자원으로부터 의 당뇨병 치료제 개발에 기초자료를 제공할 것으로 사료된다.
- 기대된다. 본 연구의 결과는 STZ유도 당뇨모델과 C2C12 로부터 근세포로 분화된 in 조건에서 시험된 결과이나, 향후 가시오가피 과실의 부탄올 추출물로부터 유효성분을 규명하고, GLUT4 활성조절에 미치는 영향을 다양한 세포 및 동물시험 에서 규명 한다면, 생 약자원으로부터 의 당뇨병 치료제 개발에 기초자료를 제공할 것으로 사료된다.
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