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문제 정의
- 그러나 뇌질환에 대한 개선 효과는 최근 zin蟾erone의 도파민신경세포 보호효과27) 와 생강분획물의 beta-amyloid에 의해 유발되는 알츠하이머병의 염증반응을 억제할 수 있음28)이 보고되었으나, microglia의 활성화에 의한 뇌 염증반응에서의 약리효능에 대한 연구는 이루어져 있지 않다. 따라서 본 논문에서는 생강의 메탄올(methanol) 추출물로부터 클로로포름 분획물을 분리하여 microglia 활성화에서 항염증 효과를 검증하여 유의한 효과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 생강 클로로포름 분획 (GCF) 이 활성화된 BV2 세포로부터 생성되는 염증사이토카인을 억제할 수 있는지 조사하기 위해서 세포배양액 내 TNF-a와 Ⅱ.-1P 의 양을 ELISA 방법으로 측정하였다.
- 본 연구에서는 퇴행성뇌질환을 개선시키기 위한 신경 보호 약물을 발굴하기 위해서 뇌신경 교세포잎 BV2 세포의 활성화에서 생강 클로로포름 분획물의 항염증 효과와 그 작용기전을 조사하였다.
가설 설정
- 최근 COX-2 '저해제의 투여가 각종 염증질환의 개선에 매우 효과적인 것으로 알려지면서 치료제 개발을 중심으로 활발히 연구되고 있다. 본 연구에서 생강의 클로로포름 분획물은 COX-2의 발현을 억제하여 PGE?의 생성을 효과적으로 감소시키는 것으로 나타났는데 (Fig. 3), 이는 생강의 핵산 분획물이 COX-2의 전사단계를 조절하여 최종적으로 PGE?의 합성을 억제시킬 수 있는 것으로 보인다
제안 방법
- 생강 클로로포름 분획 (GCF) 의 BV2 세포에 대한 세포독성 (cytotoxicity)을 평가하기 위해서 BV2 세포 (5x104 cells/well) 를 96-well culture plate에 DMEM 배양액 0.1血와 함께 하룻밤 배양한(37℃, 5% CO2) 후, 다양한 농도(0~1 m/rnC)의 GCF를 처리하여 24시간 배잉하였다. 3-(4, 5-dimethy;lthazol-2-yl-2, 5eteterazolium bromide (MTT; Sigma, St.
- 1 mC의 DMSO 용액 첨가하였다. 이를 Microplater Reader (Asys, Sunnyvale, CA, US A) 를 이용하여 550 nm 에서 흡광도를 측정하였으며, 세포만 배양한 대조군을 기준으로 처리 구의 세포 생존율(%)을 계산하였다
- 1% naphthylethylaiecliamine & 1% sulfanilamide in 5% H3PO4)을 넣어 15분간 실온에서 암반응 시켰다. 반응액을 microplate reader (Asys) 에서 540 nm 흡광도를 측정하였으며, 세포로부터 생성된 NO의 양은 NaNQ? 표준액의 농도(uM)를 기준 (standard curve)으로 계산하였다.
- Plate의 반응정도를 microplate reader (Asys)에서 450 nm 흡광도로 측정하였다. BV2 세포로부터 분비된 각 사이토카인의 양은 재조합단백질로부터 얻은 표준 흡광 곡선(stamdatd curve)을 기준으로 계산하였다.
- 생강 클로로포름 분획 (GCF) 이 iNOS, COX-2 및 염증사이토카인들의 유전자 발현에 미치는 효과를 조사하기 위해 RT-PCR을 수행하였다 먼저, BV2 세포(5x10, cells/m。)를 6-well plate에 하룻밤 배양하여서로 다른 농도의 GCF를 30분간 전처리하였다. 전처리한 세포에 LPS (1 您/做를 처리하여 6시간 동안 배양한 다음, 세포로부터 TRIzol 시약을 이용하여 total RNA를 분리하였다.
- 전처리한 세포에 LPS (1 您/做를 처리하여 6시간 동안 배양한 다음, 세포로부터 TRIzol 시약을 이용하여 total RNA를 분리하였다. 이를 oligo-(dT) piimer와 Improm-II™ reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA))를 이용하여 25℃ 에서 10분, 4 2℃ 에서 1 시간, 70'C 에서 15분 조건으로 cDNA를 합성하였다. PCR 반응을 위해 cDNA 1 飓에 iNOS primers [Forward; 5'—TTT GGA GCA GAA GTG CAA AGT CTC-3\ Reverse; 5」GAT CAG GAG GGA TTT CAA AGA CCT-3] COX-2 primerstForward; 5'—AAC CGT GGG GAA TGT ATG AGC A-3', Reverse; SeAAC TCT CTC CGT AGA AGA ACC TTT TCC A -8], TNF-a primers [Forward; 5'—TTC TGT CTA CTG AAC TTC GGG GTG ATC GGT CC-3', Reverse; 5'-GTA TGA GAT AGC AAA TCG GCT GAC GGT GTG GG-3'] 및 IL-1P primers [Forward; 5-GAA GCT GTG GCA GCT ACC TAT GT CT-3', Reverse; 5'-CTC TGC TTG TGA GGT GCT GAT GTA C-3']에 lOx PCR bufferflO mM Tris-HCl, pH 8.
- 이를 oligo-(dT) piimer와 Improm-II™ reverse transcriptase kit (Promega, Madison, WI, USA))를 이용하여 25℃ 에서 10분, 4 2℃ 에서 1 시간, 70'C 에서 15분 조건으로 cDNA를 합성하였다. PCR 반응을 위해 cDNA 1 飓에 iNOS primers [Forward; 5'—TTT GGA GCA GAA GTG CAA AGT CTC-3\ Reverse; 5」GAT CAG GAG GGA TTT CAA AGA CCT-3] COX-2 primerstForward; 5'—AAC CGT GGG GAA TGT ATG AGC A-3', Reverse; SeAAC TCT CTC CGT AGA AGA ACC TTT TCC A -8], TNF-a primers [Forward; 5'—TTC TGT CTA CTG AAC TTC GGG GTG ATC GGT CC-3', Reverse; 5'-GTA TGA GAT AGC AAA TCG GCT GAC GGT GTG GG-3'] 및 IL-1P primers [Forward; 5-GAA GCT GTG GCA GCT ACC TAT GT CT-3', Reverse; 5'-CTC TGC TTG TGA GGT GCT GAT GTA C-3']에 lOx PCR bufferflO mM Tris-HCl, pH 8.3, 50 mM KC1, 0.1% Triton X-100), 250 ;/M dNTP mixture, 1U Tag polymerase (Promega)를 혼합한 후 denatuuation을 위해 94 ℃에서 30초, annealing을 위해 60 ℃ 에서 30초, extension 을 위해서 70℃에서 1분의 조건으로 30 cycles을 수행하였다 PCR 반응의 표준 대조구로 house keeping gene인 GAPDHs [Forward; 5'- CTC GTG GAG TCT ACT GGT GT-8, Reverse; GTC ATC ATA CTT GGC AGG TT-3']를 사용하였다.
- 각 단백질의 발현에 대한 대조군으로 actin에 대한 일차항체를 이용하여 위와 동일한 방법으로 수행하였다.
- 생강 클로로포름 분획 (GCF) 의 세포독성을 조사하기 위해서 BV2 세포에 10-500 fig/ine 농도의 GCF를 처리하여 MTT assay를 수행하였다.
- 한편 GCF가 NO의 합성효소인 iNOS의 유전자와 단백질 발현에 미치는 영향을 RT-PCR(Fig. 2B)과 Western blot(Fig. 2C) 방법으로 확인하였다. BV2 세포만 배양한 경우에는 iNOS 유전자와 단백질의 발현이 관찰되지 않은 반면, LPS처리에 의해 유도되었다 또한 LPS에 의해 유도된 iNOS의 유전자와 단백질의 발현은 GCF처리에 의해 현저히 억제되었다.
- 5B). 따라서 GC3는 BV2 세포에서 LPS 에 의해 유도되는 MAPK의 phsophi끼ation과 NF-kB의 핵 내로의 이동을 차단하므로 염증매개물질틀씌 발현 억제를 확인하였다.
- 생강 클로로포름 분획물은 LPS에 의해 활성화된 BV2 세포에서 염증 신호전달분자들인 ERK1/2와 P38.MAPK의 인산화를 억제하였으며, NF-kB p65의 핵 내로의 이동을 억제하므로 염증신호전달경로를 차단하였다.
- TNF-a와 ILT。의 양을 Ready-Set-Go mouse TNF-a 및 IL-IB CytoSets™ Biosource ELISA kits (eBioscience™, San Diego, CA, USA)를 사용하여 세포배양액에서 측정하였다. 먼저, 각 사이토카인의 capture Ab를 96-well ELISA plate (Nunc™, Rochester, NY, USA)에 넣고 4℃ 에서 하룻밤 반응시켰다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 생강은 경상북도 영천시 약재시장에서 건조된 것을 구입하여 동국대학교 한의과대학 본초학 교실에서 검정하고 정선한 것을 사용하였다. 건조된 생강(500g)을 잘게 잘라 grinder를 이용하여갈은 후 80% 메탄올 1L를 가하여 70 ℃ 에서 14시간 동안 두 번 전탕하였다.
데이터처리
- 세포배양액 내 존재하는 PGEz의 농도(pg/m© 는 표준용액의 농도를 기준 .SS- 환산하여 계산하였다.
- 결과는 3회 반복실험에 대한 평균(mean)士표준오차(standard deviation; SD)로 나타내었으며, 통계학적 h석은 GrapliPad Prism program의 Two-way ANOVA로 검정하여 p값이 0.05 이하인 경우를 유의성이 있는 것으류판정하였다
이론/모형
- 생강 클로로포름 분획 (GCF) 이 iNOS와 COX-2 단백질의 발현 및 염증신호전달인자인 MAPK와 NF-k B의 활성화에 미치는 효과를 조사하기 위해 Western blot을 수행하였다. 먼저, BV2 세포(5시正 cells/mW 를 6-well plate에 하룻밤 배양한 후 서로 다른 농도의 GCF를 30분간 전처리하고 LPS (1 陽/i此)를 처리하여 24시간 동안 배양하였다.
- 생강 클로로포름 분획 (GCF) 이 LPS에 의해 활성화 된 BV2 세포로부터 염증매개물질인 NO의 생성을 억제하는지 조사하기 위해 Griess 반응법으로 세포배양액 내 NO의 양을 측정하였다.
- 생강 클로로포름 분획 (GCF)이 BV2 세포로부터 생성되는 염증매개물질인 PGEz를 효과적으로 억제할 수 있는지 EIA 반응법으로 측정하였다
- Ⅱ.-1P 의 양을 ELISA 방법으로 측정하였다.
- 있다. 따라서 본 연구에서는 LPS 자극에 의해 활성화되는 MAPK 분자들과 NF-kB 의 negative regulator로 알려져 있는 I-kBci의 발현 및 NF-kB의핵 내로의 이동(translocation)에 대한 생강 클로로포름 분획 (GCF)의 약리기전을 Western blot 방법으로 조사하였다.
성능/효과
- 건조하였다. 최종회수된 생강 클로로포름 분획은 총 2.84 g이었으며, 수득율은 0.568%였다. 생강 클로로포름 분획 (Ginger Chloroform Fraction; GCF)을 저온에서 보관하면서 실험 직전 DMSO에 적정 농도로 완전히 녹여 사용하였다
- BV 세포에 대한 GCF의 세포독성은 세포만 배양한 대조구의 세포생존율 100%를 기준으로 GCF의 10 /zg/m£, 20 /zg/m£, 50 /zg/m£, 100 /zg/m£, 200및 500 fig/M 농도에서 각각 100.6+0.88%, 101.7+ 1.95%, 102.4+1.27%, 95.4+0.14%, 92.8+2.71% 및 61.3±2.21%로 측정되었다(Fig. 1). 즉 GCFe 200您/ ni« 농도까지 BV2 세포에서 세포독성을 나타내지 않는 것으로 나타났다.
- 1). 즉 GCFe 200您/ ni« 농도까지 BV2 세포에서 세포독성을 나타내지 않는 것으로 나타났다.
- BV2 세포만 배양한 경우에는 6.05+0.01 uM로 낮은 농도의 NO가 검출된 반면, LPS를 처리하였을 때, 63.23+1.12 uM의 NO가 검출되어 LPS 처리에 의해 BV2 세포가 활성화되었음을 확인하였다(Fig. 2A).
- 또한 GCF를 각각 10 /zg/mC, 20 /zg/mC, 50 /zg/mC, 100 /zg/m£ 및 200 fig/M 농도로 처리하였을 때, 60.1+0.15 UM, 44.7+2.17 uM, 41.9+0.13 uM, 27.35+0.84 uM 및 14.1+0.87 uM의 NO가 검출되었으며, LPS에 의해 유도된 NO의 생성이 GCF의 농도에 의존적이고 유의적으로 감소되는 것을 알 수 있었다.
- 2+14.22 pg/W로 낮은 농도의 PGE?가 검출된 반면 LPS 처리에 의해 2407+64.33 pg/rnC로 PGEz의 양이 현저히 증가돠는것을 확인하였다(Fig. 3A). 반면, GCF를 각각 10 询 ml, 20 您/n比, 50 您/畝 100 /zg/m£ 및 200 /zg/J 농도로 처리하였을 때, 2148+27.
- 3A). 반면, GCF를 각각 10 询 ml, 20 您/n比, 50 您/畝 100 /zg/m£ 및 200 /zg/J 농도로 처리하였을 때, 2148+27.18 pg/毗 1148+27.18 pgM 768.7+41.79 pg/m£, 478.3+4.93 pg/m£ 및 343.3 +7.16 pg/W의 PGEz가 검출되어, BV2 세포로부터 LPS에 의해 증가된 PGEz의 생성이 GCF의 농도에 의존적이고 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다. 한편 GCF가 PGE?의 합성효소인 COX-2의 유전자와 단백질 발현에 미치는 영향을 RT-PCR(Fig.
- 3B)과 Western blot(Fig. 30 방법으로 확인한 결과, 세포만 배양한 경우에는 COX-2의 유전자와 단백질의 발현이 거의 관찰되지 않은 반면, LPS처리에 의해 현저히 증가되었고, GCF 처리에 의해 농도에 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다. 즉 CGF는 COX-2의 유전자와 단백질의 발현을 억제시켜서 PGE?의 생성을 억제할 수 있는 것으로 나타났다.
- 먼저 TNF-a의 경우 BV2 세포만 배양하였을 때는 228.2 ± 18.81 pg/血로 낮은 농도의 TNF-a가 검출되는 반면, LPS를 처리하면 1178 + 27.83 pg/业로 TNF-a 생성이 현저히 증가하는 것을 확인하였다 (Fig. 4A). 또한 GCF의 처리농도 10 飓ZmC에서 1154 士 4.
- 4B). 또한 GCF의 처리농도 10 kM, 20 50 您/毗 100 /zg/m£ 및 200 에서 각각 154.3 + 4.51 pg/血, 143.4 + 1.81 pg/mt 125.7+1.84 pg/畝 79.5 + 1.11 pg/m£ 및 72.2+2.78 pg/mC로 ILTB의 생성이 GCF의 처리농도에 유의적으로 감소되는 것을 확인하였다.
- 따라서 CGF는 염증사이토카인들의 유전자 발현을 억제하여 염증사이토카인들의 분비를 억제시킬 수 있는 것으로 나타났다. 즉 CGF는 염증사이토카인들의 유전자 발현을 억제하여 염증사이토카인들의 생성을 막아줄 수 있는 헜企로 나타났다.
- 것으로 나타났다. 즉 CGF는 염증사이토카인들의 유전자 발현을 억제하여 염증사이토카인들의 생성을 막아줄 수 있는 헜企로 나타났다.
- 그 결과 BV2 세포에 LPS를 처리하였을 때 p38, ERK1/2 및 JNK MAPK의 인산화(phosphorylation, 가 강하게 유도되었으며, GCF를 50 /zg/m£, 100 您/ 畝 200 ug/mll 농도로 처리한 BV2 세포에서는 농도 의존적으로 p38 MAPK와 ERK의 인산화가 억제되는 것으로 나타났으며, JNK MAPK는 억제되지 않는 것으로 나타났다(Fig. 5A).
- 한편 NF-kB의 활성을 조절하는 I-kBci의 발현에 있어 GCF를 처리한 BV2 세포에서는 I-kBci의 인산화가 감소하여 I-kB의 degradation이 억제되었으며, 핵에서 NF-kB p65 subunit의 인산화가 농도에 의존적으로 감소되었다(Fig. 5B). 따라서 GC3는 BV2 세포에서 LPS 에 의해 유도되는 MAPK의 phsophi끼ation과 NF-kB의 핵 내로의 이동을 차단하므로 염증매개물질틀씌 발현 억제를 확인하였다.
- 따라서 염증반응이 진행되는 동안 유의적으로 증가하는 NO의 분비를 효과적으로 억제할 수 있는 억제제 개발은 각종 뇌질환을 치료하는 유용한 치료방법으로 여겨지고 있다. 본 연구에서 생강의 클로로포름 분획물은 IPS에 의해 활성화된 BV2 세포로부터 생성되는 NO를 유의적으로 감소시키고 NO 합성효소인 iNOS 의 gene transcription 단계를 조절하여 항염증효과가 있는 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌 질환에서 활성화된 micro읺ia로부터 분비되어 TNF- a와 IL-1B는 염증유발에 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 최근 LPS 인식기전의 이해 및 염증 유발 관련 유전자의 발굴, 나아가 이들의 조절을 통한 퇴행성뇌질환 치료에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다33 특히 TNF-a는 뇌졸중이나 파킨슨병, 알츠하이머병 환자의 경우, 환자의 혈청과 뇌 조직에서 증가되어 있으며 mRNA와 단백질 발현이 증명되고 있어 TNI」a가 뇌신경세포사멸 등의 병인기전에 중요한 역할을 하는 사이토카인으로 인식되고 있다35齐). 본 연구결과에서 생강의 클로로포름 분획물은 LPS에 의해 활성화된 BV2 세포로부터 분비되는 TNF-a와 IL-1B의 생성을 유의적으로 감소시켰으며, 나아가 이들의 유전자 발현을 억제시켰다(Fig. 4). 이는 생강의 핵산 분획물이 염증사이토카인의 유전자 발현단계를 조절하여 이들 사이토카인의 생성을 억제할 수 있음을 의미하며, 염증관련 뇌질환 개선 및 증상 완화에 효과적일 수 있음을 시사한다
- 4). 이는 생강의 핵산 분획물이 염증사이토카인의 유전자 발현단계를 조절하여 이들 사이토카인의 생성을 억제할 수 있음을 의미하며, 염증관련 뇌질환 개선 및 증상 완화에 효과적일 수 있음을 시사한다
- 39). 본 연구에서 생강의 클로로포름 분획물은 BV2 세포에서 LPS에 의해 유도되는 p38 MAPK와 ERK1/2의 phosphorylation을 농도에 의존적으로 감소시켰으며, 핵 내 NF-kB p65 subunit의 translocation 을 억제하였다(Fig. 5). 따라서 생강의 클로로포름 분획물에 의한 MAPK와 NF-kB의 활성 억제는 GCF 에 의한 염증사이토카인의 발현을 억제하는 작용에 직접적인 영향을 미치는 것으로 보인다.
- 결론적으로 생강의 클로로포름 분획은 LPS에 의해 활성화된 BV2 세포로부터 유도되는 NI」kB의 신호전달 경 로를 차단하여 염 증매 개 물질 인 NO, PGE2 및 염증사이토카인(TNF-a, IL-IB)의 생성을 억제하여 항염증 효과를 나타내었다. 따라서 생강의 클로로포름 분획은 각종 퇴행성뇌질환의 치료제 개발에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
- 1. BV2 세포에서 생강 클로로포름 분획물의 세포독성은 200您/mC 이상의 농도에서 나타났다.
- 2. 생강 클로로포름 분획물은 LPS에 의해 활성화된 BV2 세포로부터 분비되는 염증물질인 NO, PGE2 및 염증사이토카인 (TNF-a, IL-1。)을 처리 농도에 의존적이고 유의적으로 감소시켰으며, 각 염증 물질들의 합성효소인 iNOS, COX-2 및 염증사이토카인의 유전자와 단백질의 발현을 억제시켰다.
- 3. 생강 클로로포름 분획물은 LPS에 의해 활성화된 BV2 세포에서 염증 신호전달분자들인 ERK1/2와 P38.MAPK의 인산화를 억제하였으며, NF-kB p65의 핵 내로의 이동을 억제하므로 염증신호전달경로를 차단하였다.
- 따라서 생강 클로로포름 분획물은 뇌 신경 교세포의 활성화로 인한 뇌 염증반응을 억제시켜서 신경보호 효과를 나타낼 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 생강클로로포름 분획물이 다양한 퇴행성뇌질환의 치료약물로 개발되어질 수 있음을 시사한다.
후속연구
- 항염증 효과를 나타내었다. 따라서 생강의 클로로포름 분획은 각종 퇴행성뇌질환의 치료제 개발에 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
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