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문제 정의
- 이에 본 논문은 홍삼의 추출된 일부 성분이 아닌 일반적인 홍삼 복용방법인 홍삼의 전체 성분에 대한 면역 효과에 대해 동물실험을 통해 규명해 보고자 하였고, 한국산 홍삼과 중국산 홍삼과의 면역학적 변화의 양상을 비교하여 산지에 따른 효능의 차이를 살펴보고자 하였다.
제안 방법
- Ethyl ether를 이용하여 흡입 마취를 시키고 심장에서 10 ml의 채혈을 한 후 사망시킨 뒤 Rat의 복부에서 비장을적출하였다. 적출한 비장을 수거해서 멸균된 수술용 메스를이용하여 3-4개의 절편으로 자른 후, 주사바늘 2개를 이용하여 파쇄한 후 비장 내 세포를 얻었다.
- 077)을 넣고 PBS로 희석된 림프구 부유액 35 ml을 중첩시킨 후 실온에서 400xg에서 30분간 원심분리한 후 중간층에 분리된 단핵세포 (mononuclear cell)를 수거하였다. 그 후 PBS 용액으로 400xg에 5분간 2회 원침 세척하여 수확하였으며, 최종적으로획득한 림프구 세포를 hemocytometer를 이용하여 측정하였다.
- 각각 7마리씩 나누었다. 대조군은 0.9% 생리식염수 3 ml를, 실험군은 각각 한국홍삼 및 중국홍삼 분말 500 mg을 증류수 3 ml에 혼합하여 zonde needle을 이용하여 매일 오전 10시경에 1일 1회 3개월간 경구 투여하였다.
- 본 실험에서는 먼저 3개월간 한국 및 중국 홍삼을 투여하고 비장에서 적출한 림프구에 T세포를 분화시키는 mitogen 인 Con-A와 PHA-L을 처리한 후 림프구의 활성도를 비교하였다. 그 결과, 한국홍삼 투여군에서 유의하게 림프구 수가 증가하였다.
- 분리한 비장의 림프구를 penicilin/streptomycin(100 unit/ ml, 100 昭/ml)이 첨가된 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640 배지에서 5.0 X102 * * * 6 cells/ml 농도로 조제한 뒤 Con-A(10 μg/ ml) 및 PHA-L(10 μg/ml)으로 각각 자극하였다. 이들 세포들을 24 well plate에 well당 200 p!씩 분주한 후 72시간 동안 37oC, 5%, CO2 incubater에서 배양하였다.
- 형태의 약품을 사용하였다. 시료는 캡슐에 담긴 분말 형태의 약물을 캡슐을 분해하여 분말 500 mg을 채취하여 3 ml 의 일정량의 증류수에 녹여 제조하였다.
- 위와 같이 홍삼의 추출된 성분은 면역학적으로 다양하게 영향을 미치는 것으로 나타났는데, 이에 본 실험에서는 홍삼의특정 성분 추출물이나 추출물이 아닌 완제품 분말을 흰쥐에경구 투약하였으며, 또한 홍삼의 산지에 따른 면역활성에 대한 차이를 규명하기 위하여 한국 홍삼과 중국 홍삼을 각각투여하면서, 면역 세포의 활성도와 여러가지 cytokine을 비교하였다.
- 이들 세포들을 24 well plate에 well당 200 p!씩 분주한 후 72시간 동안 37oC, 5%, CO2 incubater에서 배양하였다. 이후 배양으액을 원심 분리 (1,500rpm, 10분)한 다음 상등액 40 pl를 취하여 cytokine을 측정하였다. 수거된 상등액은 측정전까지] -70oC 에서 냉동 보관하였고 Rat IL-1a, INF-y, IL-2 및 TNF-a 는 ELISA Kit를 이용하여 측정하였으며, 실험 방법은 manufacturer's instruction 에 따랐다.
- 적출한 비장을 수거해서 멸균된 수술용 메스를이용하여 3-4개의 절편으로 자른 후, 주사바늘 2개를 이용하여 파쇄한 후 비장 내 세포를 얻었다. 획득한 비장세포를 PBS용액에 부유한 후 400xg에서 5분간 2회 원침 세척하였다.
- Assay(Promega)의 protoc이을 사용하였다. 준비된 비장 림프구를 penicilin-streptomycin(100IU-100 ieg/ml)이 첨가된 10% FBS-RPMI 1640 조직배양액에 2.5X106 cells/ml의 농도로 조정하여 96-well plate에 100 pel씩 분주한 다음 ConA(10 pg/ml) 및 PHAL(10 pg/ml) mitogen이 포함된 조직배양액을 각각 100 #씩 첨가하고, 37oC, 5% CO2 환경에서 120시간 동안 배양한 후 MTS-PES solution(Promega) 20 #를 각 wel에] 첨가하고 1, 2, 3시간 동안 37oC, 5% CO2 환경에서 배양시킨 뒤 Elisa plate reader를 이용하여 490 nm 에서 흡광도 (Optical Density)를 측정하였다.
- 총 21마리의 흰쥐를 대조군과 실험군으로 나누고, 실험군은 한국홍삼 투여군(이하 KRG군) 및 중국홍삼 투여군(이하 CRG군)으로 각각 7마리씩 나누었다. 대조군은 0.
대상 데이터
- (Gaithersburg, MD, USA) 에서 구입하여 사용하였고, Ficoll-hypaque solution(이하 F-H용액이라 함)은 Sigma Co.(STLouis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit (Promega), Beckman tabletop centrifuge GS-6R(Beckmancoulter, Inc, USA)이 사용되었으며, Rat interleukin-1a(이하 IL-1a라 함) immunoassay kit, Rat interferon-Y(이하 IFN-y라 함) immunoassay kit, Rat interleukin-2(이하 IL-2라 함) immunoassay kit, Rat tumor necrosis fector-(이하 TNF-a 라 함) immunoassay kit는 BioSource International, Inc(California, USA)에서 구입하여 사용하였고, 기타 시약은 세포 배양용 및 1급 시약을 사용하였다.
- (STLouis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay Kit (Promega), Beckman tabletop centrifuge GS-6R(Beckmancoulter, Inc, USA)이 사용되었으며, Rat interleukin-1a(이하 IL-1a라 함) immunoassay kit, Rat interferon-Y(이하 IFN-y라 함) immunoassay kit, Rat interleukin-2(이하 IL-2라 함) immunoassay kit, Rat tumor necrosis fector-(이하 TNF-a 라 함) immunoassay kit는 BioSource International, Inc(California, USA)에서 구입하여 사용하였고, 기타 시약은 세포 배양용 및 1급 시약을 사용하였다.
- CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay(Promega)의 protoc이을 사용하였다. 준비된 비장 림프구를 penicilin-streptomycin(100IU-100 ieg/ml)이 첨가된 10% FBS-RPMI 1640 조직배양액에 2.
- 본 실험에 사용된 실험동물은 생후 6주령의 평균 208.7g 의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐((주) 샘타코 바이오 코리아, 韓國, 경기도, 용인)를 동물실험실 환경에 7일간 적응시켰으며적응 기간 동안 동물실험실의 온도는 23±3oC, 습도 50±10% 내외, 명암주기 12시간 주기 (06:00-18:00)로 일정하게 유지하였다. 실험동물은 1주일간 실험실 환경에 적응시킨후 사용하였고, 실험기간 내내 사료와 물을 제한 없이 적당량을 충분히 공급 하였으며, 사료는 삼양사료(주)에서 구입하여공급하였다.
- 본 실험에 사용한 한국 홍삼(이하 KRG) 및 中國 紅蔘(이하 CRG)은 KT&G 중앙연구원 인삼연구소에서 제공한 캡슐제 형태의 약품을 사용하였다. 시료는 캡슐에 담긴 분말 형태의 약물을 캡슐을 분해하여 분말 500 mg을 채취하여 3 ml 의 일정량의 증류수에 녹여 제조하였다.
- 7g 의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐((주) 샘타코 바이오 코리아, 韓國, 경기도, 용인)를 동물실험실 환경에 7일간 적응시켰으며적응 기간 동안 동물실험실의 온도는 23±3oC, 습도 50±10% 내외, 명암주기 12시간 주기 (06:00-18:00)로 일정하게 유지하였다. 실험동물은 1주일간 실험실 환경에 적응시킨후 사용하였고, 실험기간 내내 사료와 물을 제한 없이 적당량을 충분히 공급 하였으며, 사료는 삼양사료(주)에서 구입하여공급하였다.
데이터처리
- 0 for Windows# 사용하였다. 평균과 표준 편차 및 표준오차를 구하고, 통계 분석은 모수적 검정방법인 일원 분산 분석 (one way ANOVA)으로 사후검정은 Turkey's test로 분석하였다. P-value는 0.
이론/모형
- 이후 배양으액을 원심 분리 (1,500rpm, 10분)한 다음 상등액 40 pl를 취하여 cytokine을 측정하였다. 수거된 상등액은 측정전까지] -70oC 에서 냉동 보관하였고 Rat IL-1a, INF-y, IL-2 및 TNF-a 는 ELISA Kit를 이용하여 측정하였으며, 실험 방법은 manufacturer's instruction 에 따랐다.
- 획득한 비장세포를 PBS용액에 부유한 후 400xg에서 5분간 2회 원침 세척하였다. 이후, 밀도구배법 (Density gradient method)을 이용하는데, Boyum의 비중 원심 분리법 (Boyum, 1968)에 따라 50 ml 원심용 시험관에 15ml의 F-H용액(비중 1.077)을 넣고 PBS로 희석된 림프구 부유액 35 ml을 중첩시킨 후 실온에서 400xg에서 30분간 원심분리한 후 중간층에 분리된 단핵세포 (mononuclear cell)를 수거하였다. 그 후 PBS 용액으로 400xg에 5분간 2회 원침 세척하여 수확하였으며, 최종적으로획득한 림프구 세포를 hemocytometer를 이용하여 측정하였다.
성능/효과
- 1. 림프세포 증식능에 있어서, 림프구의 활성도를 비교한 결과 실험군 간에 유의한 면역활성도 차이가 있었으며, 한국홍삼투여군이 유의하게 림프세포의 증식을 증가시켰다.
- 2. IL-1a는 대조군과 중국홍삼투여군에서는 유의하게 증가되지 않았으나 , 한국홍삼투여군에서는 유의하게 증가되었다.
- 3. IL-2는 대조군, 중국홍삼투여군과 한국홍삼투여군 사이에서 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 3개월 동안 흰쥐에 각각의 홍삼을 투여하고 획득한 비장 림프구에 mitogen을 처리한 뒤 분비되는 IL-2의 양을 측정한 결과, 대조군, 중국홍삼투여군과 한국홍삼투여군 사이의 유의한 차이가 없었다 (Table 2).
- 3개월 동안 흰쥐에 각각의 홍삼을 투여하고 획득한 비장 림프구에 mitogen을 처리한 뒤 분비되는 INF-y의 양을 측정한 결과, 두 실험군 모두 대조군 보다 유의하게 증가하였는데, 한국홍삼투여군의 증가량 은 중국홍삼투여군의 증가량 보다 Con-A로 처리했을 때 67.6%, PHA-L로 처리했을 때 7.4% 의 증가를 보였다 (Table 2, Fig 2).
- 3개월 동안 흰쥐에 각각의 홍삼을 투여하고 획득한 비장림 프구에 mitogen을 처리한 뒤 분비되는 TNF-a의 양을 측정한 결과, 대조군, 중국홍삼투여군과 한국홍삼투여군 사이의 유의한 차이가 없었다(Table 2).
- 3개월 동안 흰쥐에 각각의 홍삼을 투여하고 획득한 비장림프구에 mitogen을 처리한 뒤 분비되는 IL-1a의 양을 측정한결과, 대조군과 중국홍삼투여군에서는 유의하게 증가하지 않았으나, 한국홍삼투여군은 대조군에 비해 Con-A로 처리했을때 552.4%(약 5.5배)의 증가를, PHA-L로 처리했을 때 517.9%약 5.1배)의 증가를 보였다. 한편, 한국홍삼투여군에의한 증가량은 중국홍삼투여군에 의한 증가량 보다 Con-A로 처리했을 때 2324.
- 3개월간 한국 및 중국 홍삼을 투여하고 비장에서 적출한 림프구에 mitogen 자극 후 림프구의 활성도를 비교한 결과실험 군 간에 유의한 면역활성도 차이가 있었으며, 한국 홍삼 투여군이 대조군보다 유의하게 림프세포의 증식이 증가하였다 (Table 1, Fig 1).
- 4. INF-y는 중국홍삼투여군과 한국홍삼투여군 모두 대조군보다 유의하게 증가되었다.
- 5. TNF-a는 대조군, 중국홍삼투여군과 한국홍삼투여군 사이의 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 그 결과, 한국홍삼 투여군에서 유의하게 림프구 수가 증가하였다. 이는 한국홍삼이 중국홍삼에 비해 림프구 증식의 효과가 뛰어나 면역활성이 다양한 경로로 더욱 증강될 수 있다는 것을 시사한다고 하겠다.
- 유의하게 상승되었다. 두 가지 홍삼 모두에서 INF-y가증가되는 것으로 보아 Th1 type 의 세포를 통한 면역증강 효과가 기대된다. IL-2 분비는 CD4+ T세포를 통해 증가하고, INF-y는 CD4+와 CD8+ T세포를 통해 증가하는 것으로 보아25), 특히 홍삼은 CD8+ T세포를 상대적으로 더욱 증가시킬 가능성이 있는 것으로 사료된다.
- 또한 IL-1a는 한국홍삼에서 유일하게 유의한 증가를 보였는데, IL-1은 거의 모든 세포에 작용하는 cytokine으로 감염을 방어하고 치유하는 기전을 유발시키는데 필요한 것으로 숙주의 방어력을 증가시키는작용이 보고되어져 있다26, 27). 따라서 한국홍삼을 투여하면 중국홍삼보다 빠르게 면역반응의 활성 증가를 가져올 것으로 사료되며, 특히 감염에 대한 방어력이 더 뛰어날 것으로 사료된다. 각 cytokine의 생리학적, 면역학적인 작용이 밝혀지고 있으므로 이에 따른 홍삼의 여러 cytokine과 여러 면역학적인지표에 대한 영향을 더욱 광범위하고 자세한 실험을 통해 규명해야 할 것으로 사료된다.
- 또한 각각의 cytokine 분비를 측정한 결과, IL-2와 TNF- a의 양은 대조군, 중국홍삼투여군과 한국홍삼투여군 사이의유의한 차이가 없었으나, INF-y의 양은 양측 홍삼투여군에서동일하게 증가되었고, 특히 IL-1a 분비는 한국홍삼 투여군에서만 유의하게 상승되었다. 두 가지 홍삼 모두에서 INF-y가증가되는 것으로 보아 Th1 type 의 세포를 통한 면역증강 효과가 기대된다.
- 이를 통해 볼 때, 한국홍삼은 중국홍삼에 비해 림프구증식의 효과가 뛰어나 면역활성이 다양한 경로로 더욱 증강될 수 있으며, 보다 빠르게 면역반응의 활성 증가를 가져올 것으로 기대되며, 특히 감염에 대한 방어력이 더 뛰어날 것으로 사료된다. 또한, 홍삼은 IL-2보다 INF-y를 선택적으로 증가시키는 것으로 보아 CD8+ T세포를 상대적으로 더욱 증가시킬 가능성이 있는 것으로 사료된다.
- 1배)의 증가를 보였다. 한편, 한국홍삼투여군에의한 증가량은 중국홍삼투여군에 의한 증가량 보다 Con-A로 처리했을 때 2324.7%(약 23.2배), PHA-L로 처리했을 때 1072.3%(약 10.7배)로 증가된 결과를 보여, 한국홍삼투여군이대조군과 중국홍삼투여군보다 유의하게 증가하였다 (Table 2, Fig 2).
후속연구
- 6. 이를 통해 볼 때, 한국홍삼은 중국홍삼에 비해 림프구증식의 효과가 뛰어나 면역활성이 다양한 경로로 더욱 증강될 수 있으며, 보다 빠르게 면역반응의 활성 증가를 가져올 것으로 기대되며, 특히 감염에 대한 방어력이 더 뛰어날 것으로 사료된다. 또한, 홍삼은 IL-2보다 INF-y를 선택적으로 증가시키는 것으로 보아 CD8+ T세포를 상대적으로 더욱 증가시킬 가능성이 있는 것으로 사료된다.
- 따라서 한국홍삼을 투여하면 중국홍삼보다 빠르게 면역반응의 활성 증가를 가져올 것으로 사료되며, 특히 감염에 대한 방어력이 더 뛰어날 것으로 사료된다. 각 cytokine의 생리학적, 면역학적인 작용이 밝혀지고 있으므로 이에 따른 홍삼의 여러 cytokine과 여러 면역학적인지표에 대한 영향을 더욱 광범위하고 자세한 실험을 통해 규명해야 할 것으로 사료된다.
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