[논문]Ginsenoside Rg3 및 그 유도체 Ginsenoside Rg3-2H의 NO 생성 및 lymphocyte 분열 억제 효과

조재열

doi:10.5142/jgr.2008.32.3.264

문제 정의

5, 6) 그러나, 현재까지 각 인삼 성분들이 보이는 염증관련 면역반응의 억제에 관한 보고들은 매우 제한적이며, 특별히 항암제로 처방되고 있는 G-Rg3 의 경우에 관한 연구 결과는 거의 전무한 상태다. 따라서 본 연구에서는 대표적인 그람 음성균 유래 염증 유발 물질인 lipopolysaccharide (LPS)와 이에 반응하는 대식세포의 NO 생성 과정, 그리고 LPS 및 concanavalin A (con A) 에의해 분열되는 B 및 T lymphocyte의 증식에 관한 G-Rg3 및 그 유도체인 25-hydroxy Rg3 (G-Rg3-2H)의 조절작용을 조사하여 보았다.
진행되어 있지 않은 실정이다. 따라서 본 연구에서는 대표적인 대식세포주 인 RAW264.7 세포와 생쥐의 비장 및 골수로부터 분리된 lymphocyte를 이용하여 NO 생성 및 lymphocyte 분열 조건에서 G-Rg3 및 그 유도체인 G-Rg3- 2H의 조절 효과를 조사하여 보았다.
이들 염증물질로서의 NO 억제에 관한 ginsenoside류의 효능을 조사하기 위해 구조적 관점에서 분석하여 보았다. 이를 위해 대표적인 diol type의 ginsenoside류(G-Rb1, G-Rc, G- Rd, G-Rg3) 및 triol type의 ginsenoside류(G-Rg1, G-Rg2, G-Rh1, G-Re)들을 선택하여 LPS로 처리된 RAW264.
2B). 따라서, 본 결과를 통해 효과를 나타낸 G-Rg3 및 그 유도체인 G-Rg3-2H에 관한 NO 억제 효능을 보다 자세하게 조사하였다.
G-Rg3 및 G-Rg3-2H가 대식세포의 NO 분비능 및 lym phocyte 의 분열능에 미치는 억제능을 조사하여 다음과 같은 결론을 도출하였다. 1.

제안 방법

01 M HCl)을 분주하였다. 세포 생존율은 MTT가 form azan으로 환원된 양을 570 nm에서 흡광도를 측정하여 얻어진 OD 값을 통해 산출하였다.
다음의 방법으로 조사하였다. Balb/c 생쥐로부터 무균조작으로 비장 및 골수를 적출하고 주사기을 이용하여 차가운 RPMI1640 배지로 비장세포를 분리하였다.8) 분리된 비장 및 골수세포를 원심분리로 모은 후 0.
이를 위해 대표적인 diol type의 ginsenoside류(G-Rb1, G-Rc, G- Rd, G-Rg3) 및 triol type의 ginsenoside류(G-Rg1, G-Rg2, G-Rh1, G-Re)들을 선택하여 LPS로 처리된 RAW264.7 세포를 이용하여 NO 억제능을 비교하였다.
따라서 G-Rg3 및 G-Rg3-2H에 의한 lymphocyte 분열조절 효능을 생쥐 spleen에서 분취한 lymphocyte에 B 및 T cell mitogen인 LPS 및 Con A를 처리한 후 조사하여 보았다. Fig.

대상 데이터

본 실험에 사용된 G-Rg3유도체인 G-Rg3-2H(Fig. 1)는 Ambo 연구소의 박명환 박사로부터 공급 받았으며, 약물의 순도는 97% 이상이었다. Diol type의 ginsenoside류(G-Rb1, G-Rc, G-Rd, G-Rg3) 및 triol type의 ginsenoside류(G- Rg1, G-Rg2, G-Rh1, G-Re)는 KT&G로부터 공급받아 사용하였匸다.
1)는 Ambo 연구소의 박명환 박사로부터 공급 받았으며, 약물의 순도는 97% 이상이었다. Diol type의 ginsenoside류(G-Rb1, G-Rc, G-Rd, G-Rg3) 및 triol type의 ginsenoside류(G- Rg1, G-Rg2, G-Rh1, G-Re)는 KT&G로부터 공급받아 사용하였匸다. 실험에 사용한 마우스 대식세포주 RAW264.
Diol type의 ginsenoside류(G-Rb1, G-Rc, G-Rd, G-Rg3) 및 triol type의 ginsenoside류(G- Rg1, G-Rg2, G-Rh1, G-Re)는 KT&G로부터 공급받아 사용하였匸다. 실험에 사용한 마우스 대식세포주 RAW264.7 세포는 ATCC(Rockville, MD, USA)로부터 분양받아 사용하였다. 세포배양을 위한 RPMI1640 배지, fetal bovine serum (FBS) 그리고 항생제 (penicillin/streptomycin)는 Hyclone (Hyclone, South Logan, UT, USA)사 제품을 사용하였다.
7 세포는 ATCC(Rockville, MD, USA)로부터 분양받아 사용하였다. 세포배양을 위한 RPMI1640 배지, fetal bovine serum (FBS) 그리고 항생제 (penicillin/streptomycin)는 Hyclone (Hyclone, South Logan, UT, USA)사 제품을 사용하였다. Lipopoly- saccaride(LPS), concanavalin(Con) A 및 MTT(3-[4, 5-dimethyl- thiazol-2-yl]-2, 5-diphinyltetrazolium bromide)를 포함한 화학시약은 Sigma 제품(St.
세포배양을 위한 RPMI1640 배지, fetal bovine serum (FBS) 그리고 항생제 (penicillin/streptomycin)는 Hyclone (Hyclone, South Logan, UT, USA)사 제품을 사용하였다. Lipopoly- saccaride(LPS), concanavalin(Con) A 및 MTT(3-[4, 5-dimethyl- thiazol-2-yl]-2, 5-diphinyltetrazolium bromide)를 포함한 화학시약은 Sigma 제품(St. Louis, MO, USA)을 이용하였다.
7 세포들은 5% CO₂, 37oC incubator에서 배양하였다. 배지는 penicillin (100 IU/ml) 및 streptomycin (100㎍/ml)과 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하였다.

데이터처리

통계처리는 Student's t-test를 이용하여 실시하였으며 p 값이 0.05미만일 때 유의성 있다고 판정하였다. 각 데이타는 n=3으로 진행한 독립 실험을 세 번 실시하여 얻어진 값을 평균 士 표준편차 (mean ± SEM)로 나타냈다.
05미만일 때 유의성 있다고 판정하였다. 각 데이타는 n=3으로 진행한 독립 실험을 세 번 실시하여 얻어진 값을 평균 士 표준편차 (mean ± SEM)로 나타냈다.

이론/모형

시험에 사용한 ginsenoside류에 의한 세포생존 영향은 MTT assay법을 이용하여 분석하였다.7) 96-well plate에 1X106 개의 RAW264.
여러 농도의 약물을 30분전에 처리하고 이후 LPS (10 ug/ml) 혹은 Con A(10 ug/ml)를 추가 처리하여 48시간 동안 배양하였다. Lymphocyte 분열증식은 MTT assay로 확인하였다.
(A and B) Lymphocytes (5 x 106 cells/ml) were incubated with G-Rg3 (A) or G-Rg3-2H (B) in the presence or absence of LPS (10 pig/ml) or Con A (10 jug/ml) for 48 h. The proliferation was measured by MTT assay. (C) Bone marrow-derived lymphocytes (5 x 106 cells/ml) were incubated with G-Rg3 or G-Rg3-2H for 48 h.

성능/효과

이들 세포들은 외부로부터 침입한 세균들이나 바이러스 등의 탐식 후 가공된 항원성 펩타이드를 통해 서로 활성을 유도함으로써 내재성 및 획득성 면역반응을 상호 조절하는 세포군간 네트워크를 형성하고 있다. 1) 활성화된 대식세포는 특별히 일산화질소 (nitric oxide: NO) 및 활성산소(reactive oxygen species) 등과 같은 독성물질, 그리고 사이토카인 이나 프로스타그란딘류와 같은 염증 매개물질의 분비를 유도하여 전체적인 면역반응을 조절하는데 있어서 중추적인 역할을 수행하게 된다.2) 이들 세포로부터 탐식 된 면역원을 통해 가공된 펩타이드는 major histocompatibility (MHC) class II 분자와 함께 T lymphocyte의 T cell receptor (TCR)을 자극함으로써 이들 T cell의 활성 및 분열 증식을 유도하게 한다.
결국 활성화된 T tymphocyte는 Th1 type 혹은 Th2 type의 T lymphoctyte로 분화되어 B lymphocyte로부터의 항체 생산 및 cytotoxic T lymphocyte의 활성을 조절하게 된다.3) 이들 세포들의 과도한 활성은 관절염 혹은 알러지/아토피성 피부질환 등과 같은 면역 관련 질병발생과 관련성이 크므로, 효과적인 기능 및 분열저해는 초기 병인제거를 위한 치료적 표적이 되고 있다.1)
4) 무엇보다 중요한 인삼의 약리작용 중 하나는 면역기능에 미치는 작용으로 알려져 있다. 즉 인삼의 다양한 성분들(다당류 및 ginsenoside (G)류)은 NK 세포의 활성 촉진, 대식세포의 기능 향상 및 lymphocyte의 분열증식 유도 작용 등이 있는 것으로 확인되었다.5, 6) 그러나, 현재까지 각 인삼 성분들이 보이는 염증관련 면역반응의 억제에 관한 보고들은 매우 제한적이며, 특별히 항암제로 처방되고 있는 G-Rg3 의 경우에 관한 연구 결과는 거의 전무한 상태다.
생성되는 대표적인 라디칼이다.9) 혈관 확장에 관여하는 neurotransmitter로서의 역할 이외에도, NO는 염증 상태에서 분비되어 세균을 제거하기 위한 독성물질 역할을 수행하거나, 암세포를 사멸시키기 위한 apoptosis유도 작용을 타나낸다. 이와 같은 이로운 작용 이외에도, 과량의 NO는 정상 세포를 죽이거나 염증을 유도하여 급성 또는 만성 염증질환의 원인이 되는 세포내 물질로 작용하기도 한다.
2는 대부분의 ginsenoside류가 NO 억제 효능이 없음을 나타낸다. 다만, 50 uM의 농도로 처리된 G-Rg3에서 유의적인 NO 분비 억제효과가 확인되었다. 즉 이는 diol-type의 ginsenoside에서 확인된 TNF-a 억제 효과와 달리, NO 억제는 ginsenoside류의 구조적 특징과는 상관성이 결여되어 있는 것으로 판단된다.
이는 이들 화합물의 NO 억제 효능은 세포독성 유도에 기인된 비특이적 반응에서 유도된 것이 아님을 시사한다. 또한, NO 억제 효능과 일치하여, 이들 화합물은 LPS 에 의해 유도된 세포독성 작용을 효과적으로 억제하였으며, 이에 따라 LPS 처리 군과 달리, 이들 화합물 처리군에서는 세포의 생존율이 상승되었다 (Fig. 3C).
흥미있게도, 두 약물들은 정상상태의 lymphocyte의 생존율은 억제하지 않았으며, 오히려, 특정 농도(12.5 및 25 pM)에서 유의성 있게 생존율을 증가시킨 것으로 확인되었다 (Fig. 4). 그러나 G-Rg3-2H의 분열증식 억제작용은 G-Rb2의 억제 효과(IC₅₀ = 약 25 pM)13) 보다는 다소 낮은 것으로 판단되었 匸匸.
도출하였다. 1. Ginsenoside류의 NO 억제능은 gin- senoside류가 갖는 구조적 상관성과 관련이 적은 것으로 나타났다. 2.
Ginsenoside류의 NO 억제능은 gin- senoside류가 갖는 구조적 상관성과 관련이 적은 것으로 나타났다. 2. G-Rg3 및 그 유도체 G-Rg3-2H는 농도의존적으로 NO 생성을 억제하였다. 3.
G-Rg3 및 그 유도체 G-Rg3-2H는 농도의존적으로 NO 생성을 억제하였다. 3. G-Rg3와 달리, G-Rg3-2H는 LPS 및 Con A로 처리된 비장 유래 B 및 T lymphocyte의 분열 능을 농도의존적으로 저해하였다. NO분비 및 lymphocyte 증식과정은 여러가지 염증질환에서 동반되는 주요 면역반응이다.

후속연구

현재까지 이들 두 화합물이 보이는 상반된 효과에 관한 자세한 기전적 연구는 진행되어 있지 않으나, 본 결과로 미루어 볼 때, 25번 탄소는 이들 ginsenoside류가 가지는 lymphocyte관련 증식조절효능 수행시 결정적인 구조적 pharmacophore역할을 담당하는 부위로 판단된다. 이와 같은 가능성은 추가적인 유도체 합성을 통해 보다 자세히 증명될 예정이다.
NO분비 및 lymphocyte 증식과정은 여러가지 염증질환에서 동반되는 주요 면역반응이다. M) 따라서, 차후에는 이들 매개에 의한 염증질환 모델에서의 치료능 및 억제 기전에 관한 분자수준에서의 연구들이추가적으로 진행될 예정이다.

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