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문제 정의
- 본 연구는 한약재 중 산수유, 황기, 감초를 물과 에탄올로 추출한 후, 각 한약재 추출물의 폴리페놀 함량, 항산화능 및 항암활성을 조사하여 천연의 식품 보존료 개발 및 건강 기능성 식품 개발에 활용하기 위한 기초자료를 얻고자 하였다.
- 본 연구의 목적은 항산화활성을 가진 건강식품 소재를 개발하기 위하여 3종류의 한약재(산수유, 황기, 감초)를 물과 70% 에탄올로 추출한 후, 각 추출물의 폴리페놀 함량, 항산화능과 항암활성을 측정하였다. 한약재 100 g 중의 폴리페놀 함량은 산수유에서 가장 많았으며 물추출물에서 342.
- 이러한 관점에서 본 연구는 산수유, 황기, 감초를 물과 에탄올로 추출하여 생리활성물질로서 중요한 폴리페놀 함량을 측정하고 추출물들의 항산화 능과 항암 활성을 측정하여 건강식품을 개발하는 소재로 활용하고자 하였다. 본 실험에서 사용한 산수유는 물과 에탄올 추출물 모두 추출수율이 60% 이상이었으며 폴리페놀의 함량이 높고 항산화능과 항암 활성이 우수하였다.
제안 방법
- Mosman T의 방법”에 따라 10% fetal bovine serum(FBS)을 함유한 RPMI 1640 배지에 배양한 A549cell(폐암세포)과 MDAcell(유방암 세포)을 5시0, cells/mL 되게 희석하여 각각의 well에 1&山씩 첨가한 후 4시간 동안 항온기(37℃, 5%(◎)에서 배양시켰다 그 후각각의 추출물을 최종농도가 100, 300, 500, 1,000回이 되도록 20成씩 첨가하여 密시간 동안 다시 배양시켰다. 대조구에는 동일한 양의 phosphate buffered saline(PBS)을 첨가하였으며 시료 당 각각의 실험군은 3개의 词1을 동일 조건으로 사용하였다.
- 에탄올추출물은 70%의 에탄올 1, 000 mL에 100 g의 시료를 가하여 70 ℃ 에서 3시간 동안 3회 반복 추출, 여과하였다. 각 추출물은 회전식 증발 농축기(EYELA, Japan)로 농축하여 동결건조한 후, 기능성 실험 시료로 사용하였으며, 시료의 추출 수율은 추출전 시료의 중량에 대한 각 추출물의 동결건조 후 중량 백분율로 나타내었다.
- 대조구에는 동일한 양의 phosphate buffered saline(PBS)을 첨가하였으며 시료 당 각각의 실험군은 3개의 词1을 동일 조건으로 사용하였다. 여기에 5mg/mL의 metliylthiazd tetrazolium(MTT) 을 20成씩 첨가하여 4시간 동안 배양 시켜 formazan을 형성시킨 후 dimethyl sulfoxide (DMSO) 150 rL를 첨가하여 formazan을 녹인 다음 Microplate reader(Molecular Device, Emax)를 이용하여 550nm에서 홉광도를 측정하였다.
- 대조구에는 동일한 양의 phosphate buffered saline(PBS)을 첨가하였으며 시료 당 각각의 실험군은 3개의 词1을 동일 조건으로 사용하였다. 여기에 5mg/mL의 metliylthiazd tetrazolium(MTT) 을 20成씩 첨가하여 4시간 동안 배양 시켜 formazan을 형성시킨 후 dimethyl sulfoxide (DMSO) 150 rL를 첨가하여 formazan을 녹인 다음 Microplate reader(Molecular Device, Emax)를 이용하여 550nm에서 홉광도를 측정하였다.
- 0으로 보정한 다음 반응용액의 부피를 10 m止로 하였다. 이 용액을 37 ℃에서 1시간 반응시킨 후 각 반응액 im止를 취하여 Griess 시약(1% sulfanilic acid : 1 % naphthylamine = 1 : 1) 0.4 mL를 가한 후 혼합하여 실온에서 15분간 방치 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산염의 백분율로 나타내었으며 공시험은 Griess 시약 대신 증류수를 가하여 동일하게 행하였다.
- 4 mL를 가하여 혼합하고 증류수를 첨가하여 4 mL로 만든 후 실온에서 1시간 방치하여 상징액을 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 폴리페놀 화합물은 tannic acid를 0, 50, 100, 150, 200 및 300 pg/mL 용액이 되도록 취하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다.
- 즉 1 mM NaNO2 용액 2 mL에 각 시료 추출물 1 mL 를 가하고, 0.2 M 구연산 완충액으로 반응용액의 pH를 각각 pH 1.2, 3.0, 6.0으로 보정한 다음 반응용액의 부피를 10 m止로 하였다. 이 용액을 37 ℃에서 1시간 반응시킨 후 각 반응액 im止를 취하여 Griess 시약(1% sulfanilic acid : 1 % naphthylamine = 1 : 1) 0.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 약재인 산수유(국내산), 황기(중국산), 감초(중국산)를 대구시내의 약령시장에서 구입하여 사용하였으며, 증류수 1,000 n止에 100 g의 시료를 가하여 80℃ 에서 3시간 동안 3회 반복 추출, 여과하였다. 에탄올추출물은 70%의 에탄올 1, 000 mL에 100 g의 시료를 가하여 70 ℃ 에서 3시간 동안 3회 반복 추출, 여과하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻어진 결과는 SPSS 통계분석 프로그램(version 12.0)을 이용하여 평균치와 표준오차를 산출하였으며, one way ANOVA test 및 Duncan's multiple range test를 통하여 각 데이터 구간에 유의적인 차이를 분석하였다.
이론/모형
- SOD 유사활성은 Marklund S와 Maridund G의 방법24) 에 따라 각 시료 0.2 也에 Tris-HQ buffer(pH 8.5) 3 mL와 7.2 mM pyrogallol 0.2 mL를 가하고 25℃ 에서 10분간 반응시킨 후 IN HC1 1 mL로 반응을 정지시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하여 시료 용액의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율 (%)로 나타내었다.
- 아질산염 소거작용 (nitrite scavenging ability; NSA) 측정은 Kato H 등의 방법25)에 준하였다. 즉 1 mM NaNO2 용액 2 mL에 각 시료 추출물 1 mL 를 가하고, 0.
-
1) 전자공여능
전자공여능(electron donating ability; ED臥은 Blois MS의 방법23)에 준하여 각 시료 2 mL에 0.2 mM DPPH(l-l-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 1.0 mL 를 넣고 혼합하여 30분 동안 반응시킨 다음 분광광도계로 517 nm 에서 반응액의 흡광도를 측정한 후, 시료첨가 전·후의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.
- 한약재 추출물의 폴리페놀 화합물 함량은 Folin- Denis법22)으로 측정하였다. 즉 시료를 10 mg/mL 농도로 증류수에 녹인 다음 0.
성능/효과
- Fig. 1은 한약재 물추출물의 전자공여능으로서, 1, 000 Ug/mL에서 물추출물은 감초, 황기, 산수유의 순으로 각각 87.6%, 83.7% 및 82.3%로서 유의적 차이가 없었으며, 3종류의 추출물 모두 500 iig/mL에서도 70% 이상의 높은 활성을 나타내었다, 3가지 한약 재중 황기는 300 胞/mL에서도 70% 이상의 활성을 나타내어 동일한 농도의 다른 한약재에 비하여 높은 활성을 나타내었다(p<0.05).
- Fig. 4는 한약재 에탄올추출물의 SOD 유사 활성으로서, 1,000 ug/mL에서 산수유, 감초가 각각 37.2%, 35.3%로 높았으며 황기는 30.2%로서 산수유와 감초보다 활성이 낮았으나(p<0.05) 에탄올추출물의 SOD 유사활성이 물추출물보다 약 3-5% 높았다. 에탄올 추출물 500 μg/mL에서 산수유, 감초, 황기의 유사 활성은 각각 28.
- 각 물추출물 500 u g/mL에서 소거능은 황기가 283%로서 산수유와 감초 1,000 ug/mL의 활성과 비슷한 수준으로서 가장 높은 소거능을 나타내었다. pH 3.0에서 소거능은 산수유, 황기, 감초의 순으로 각각 26.2, 22.3, 21.2%였으며 pH 6.0에서는 모두 20% 미만으로서 pH의 증가에 따라 활성은 감소하였다.
- 2%)의 순으로 각 한약재 추출물 간에 유의적인 차이를 나타내었으며 (p<Q05), 황기와 감초는 물추출물에 비하여 4% 이상 높은 소거 능을 나타내었다. pH 3.0에서 소거능은 황기, 산수유, 감초의 순으로 각각 28.2, 25.2, 17.2%였으며 pH 6.0에서는 모두 20% 미만으로 활성이 감소하였다.
- 62 mg이었다. 각 한약재 추출물 1,000 μ g/mL 농도의 전자공여능은 감초의 물과 에탄올 주줄 물에서 각각 87%, 田%로서 한약재 중 가장 높았다. 한약재 추출물의 아질산염 소거능은 pH 1.
- 하였다. 본 실험에서 사용한 산수유는 물과 에탄올 추출물 모두 추출수율이 60% 이상이었으며 폴리페놀의 함량이 높고 항산화능과 항암 활성이 우수하였다. 타 연구자들도 산수유의 항암활성爲, 항산화능이°), 항당뇨的 활성이 우수한 것으로 보고하여 본 실험 결과와 비슷한 결과로서 산화스트레스를 억제할 수 있는 건강식품의 가치를 지닌 것으로 생각된다.
- 산수유, 황기, 감초의 추출수율은 Table 1과 같이 물과 에탄올추출물의 수율은 산수유가 각각 63.20, 59, 條%로 유의적으로 높았으며 (p<0.05), 감초는 각각 25.12, 29.42%였고 황기는 각각 14.89, 1478%로 가장 수율이 낮았다.
- 산화적 스트레스는 동맥경화, 당뇨병, 관절염 및 치매 등의 성인병의 원인으로 알려져 있으며비만과 만성 퇴행성 질환의 발병 기전 역시 산화스트레스 측면에서 연구가 이루어지고 있다跚 인체는 superoxide dismutase(SOD), catalase(CAT), glutathiae peroxidase (GPX) 등의 항산화 효소로 활성산소의 유리기를 제거함으로써 산화적 스트레스로부터 인체를 보호하고있다$ gas는 비만 청소년은 혈청의 항산화 관련 무기질농도가 유의적으로 낮아서 SOD 활성도가 낮고 체내의 산화스트레스가 증가하여 질병의 발생과 관련성을 가지는 것으로 분석하였다.
- 05) 에탄올추출물의 SOD 유사활성이 물추출물보다 약 3-5% 높았다. 에탄올 추출물 500 μg/mL에서 산수유, 감초, 황기의 유사 활성은 각각 28.3%, 26.3% 및 19.2%였으며 300 μ g/mL에서도 산수유는 23.2%의 활성을 나타내었다.
- 에탄올추출물의 pH별 아질산염 소거능은 Fig. 6 과 같으며, pH 1.2, 1,000 pg/mL에서 황기가 49.2% 로 가장 높은 높은 활성을 나타내었으며, 산수유 (35.3%), 감초05.2%)의 순으로 각 한약재 추출물 간에 유의적인 차이를 나타내었으며 (p<Q05), 황기와 감초는 물추출물에 비하여 4% 이상 높은 소거 능을 나타내었다. pH 3.
- 25 mg)의 순이었다. 전체적으로 감초를 제외한 2종류의 한약재는 에탄올 추출물의 폴리페놀 함량이 물추출물에 비하여 높은 편이었다.
- 7은 유방암세포(MDA cell)에 대한 한약 재물추출물의 항암활성을 나타내었다. 추출물 1,000 u g/mL 농도에서 감초(446%), 산수유(42.2%), 황기 (39.1%)의 순으로 높은 항암활성을 나타내었고 감초는 500 iig/mL에서도 황기 1, 00) pg/mL의 활성과 유사한 높은 활성을 나타내었다.
- 05). 추출물 500 ng/n止에서 산수유, 감초, 황기의 유사활성은 각각 24.5%, 20.2% 및 18.7% 였으며 300 μg/mL에서는 모두 20% 미만의 활성을 나타내었다.
- 05) 3종류의 추출물 모두 500 pg/mL에서도 70% 이상의 높은 활성을 나타내었다. 특히 감초는 500 pemL에서도 87.7%의 전자공여능으로 1,000 μg/mL의 활성과 유의적 차이가 없었으며, 300 pg/mL에서도 73.7%御 높은 활성을 나타내었다.
- 한약재 물추출물의 SOD 유사활성은 Fig. 3과 같으며 1,000 ug/mL에서 산수유, 감초, 황기의 순으로 각각 34.5%, 30.5% 및 25.2%로서 산수유의 활성이 높았다(p<0.05). 추출물 500 ng/n止에서 산수유, 감초, 황기의 유사활성은 각각 24.
- 한약재 물추출물의 폐암세포(A549 cell)에 대한 항암 활성은 Fig. 9와 같이 추출물 1,000 pg/mL 농도에서 감초는 33.6%, 황기와 산수유는 약 30%의 활성을 나타내어 유의적 차이가 없었으며, 500 yg/mL 에서는 산수유와 감초가 약 25%, 황기는 22.7%의 항암 활성을 나타내었다.
- 한약재 에탄올추출물의 전자공여능은 Fig. 2와 같으며, 1, 000 iig/mL에서 감초 황기, 산수유의 순으로 각각 91.4%, 85.1% 및 75.9%로서 활성에 차이를 나타내었으며 (p<0.05) 3종류의 추출물 모두 500 pg/mL에서도 70% 이상의 높은 활성을 나타내었다. 특히 감초는 500 pemL에서도 87.
- 각 한약재 추출물 1,000 μ g/mL 농도의 전자공여능은 감초의 물과 에탄올 주줄 물에서 각각 87%, 田%로서 한약재 중 가장 높았다. 한약재 추출물의 아질산염 소거능은 pH 1.2, 1,000 R g/mL 농도에서 황기의 물과 에탄올추줄물이 가장 우수하였으며 pH의 증가에 따라 아질산염 소거 능은 감소하였다. 감초의 물과 에탄올 주줄물은 유방암세포(MDA cell)와 폐암세포(A589 cell)에 대한.
- 한편 감초는 물과 에탄올주출물의 전자공여 능이 우수하고, MDA cell과 A549 cell에 대하여 가장 높은 항암활성을 나타내었는데, 다른 연구자들도 감초는 아질산의 생성과 폐암세포(A549)의 증식을 억제하며 % 항산화능이 우수하고儿(2) 면역기능 증강 효과를⑸ 나타내어 건강식품 소재로서 감초가 널리 이용되고 있음을 알 수 있다. 특히 감초는 높은 온도에서 추출하면 추출수율과 항산화 활성이 더욱 증가하며'。, 실제 식품가공이나 가열조리에서도 항산화 효능을 유지할 수 있으며 단맛을 이용할 수 있는 기능성 식품소재로 생각된다.
- 황기는 본 실험 결과에서, 물과 에탄올추출물 모두 아질산염 소거능이 특히 우수하였으며 MDA cell과 A549 cell에 대하여 높은 항암활성을 나타내었다. 타 연구자들도 황기는 ACE 저해능이 우수하며"* 혈관 형성 촉진泌, 항염증작용⑺이 우수한 결과를 보고하였으며 황기 뿌리에서 생합성되는 주요 약리물질인 astragalosides를 대량생산을 위한 연구결과, 대조군에 비해 2배 이상의 생산되는 결과를 얻었다®.
후속연구
- 특히 감초는 높은 온도에서 추출하면 추출수율과 항산화 활성이 더욱 증가하며'。, 실제 식품가공이나 가열조리에서도 항산화 효능을 유지할 수 있으며 단맛을 이용할 수 있는 기능성 식품소재로 생각된다. 그리고 항산화제는 가열 중에 cholesterol oxidation products(COPs)의 생성을 억제하는 작용32, 도 보고되고 있어 가공식품의 제조에서 유용하게 이용될 것으로 생각된다.
- 항암 활성이 가장 우수하였다. 본 실험결과로 볼 때 산수유, 황기, 감초는 건강식품 개발에서 높은 항산화 활성을 가진 유용한 건강식품소쟤로 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
- 이러한 결과로 미루어 본 실험에 사용한 산수유, 황기, 감초등은 항산화 활성이 우수한 한약재로서 부작용이 없이 항산화 치료의 효과를 나타낼 수 있으며 비만으로 인한 고지혈증이나 동맥경화증 등의 심혈관계 질환 예방에 효과가 있을 것으로 추정된다. 앞으로 더 많은 종류의 한약재와 천연식품의 항산화작용에 관한 연구가 이루어지게 되면, 부작용이 없는 건강식품의 개발에 큰 도움이 될 것으로 생각된다.
- 보고한 바 있다. 이러한 결과로 미루어 본 실험에 사용한 산수유, 황기, 감초등은 항산화 활성이 우수한 한약재로서 부작용이 없이 항산화 치료의 효과를 나타낼 수 있으며 비만으로 인한 고지혈증이나 동맥경화증 등의 심혈관계 질환 예방에 효과가 있을 것으로 추정된다. 앞으로 더 많은 종류의 한약재와 천연식품의 항산화작용에 관한 연구가 이루어지게 되면, 부작용이 없는 건강식품의 개발에 큰 도움이 될 것으로 생각된다.
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