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문제 정의
- 이에 저자는 枳實의 멜라닌 합성에 대한 억제효과와 억제기전을 알아보고자 B16/F10세포를 이용하여 tyrosinase 활성과 멜라닌 형성에 미치는 영향을 관찰하고 멜라닌 합성에 관여하는효소인 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 단백질 발현변화를 조사하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 1 M PMSF]로 세포를용해하였다. 4℃, 13, 000 rpm에서 30분간 원심분리를 하여 얻은상층액을 tyrosinase 활성측정 용액으로 사용하였고/ protein assay 용액 (Bio Rad, USA) 으로 흡광도(595 nm)를 측정/ 동량의단백 질 양을 계산하였다. 시료 50 ul와 0.
- B16/F10 세포를 6 cm 배양용기에 5xl04 개씩 분주하여 세포를 부착시키고 tyrosinase 활성 측정 방법과 동일한 방법으로 枳實을 각각 처리하여 배양한 후 B16/F10세포의 수지상 돌기의 변화를 위상차도립 현미경 (inverted phasecontrast microscope, Leica)를 이용하여 관찰하였다.
- 측정하였다. B16/F10세포를 6 well 배양용기에 3×105개씩 분주하여 24시간 동안 배양하여 세포를 부착시킨 후, 枳實(50, 80 ug/ml)을 각각 처리하고 72시간 배양하였다. 배양이 끝난 세포는 PBS로 세척하고 lysis buffer[5 mM EDTA, 0.
- MTT 정량은 Mosmann의 방법14)을 변형하여 실시하였다. B16/F10세포를 24well 배양용기에 2x10, 개씩 분주하여 24시간동안 배양하여 세포를 부착 시킨 후, 枳實 추출물을 처리하고 3 일 동안 배 양한 후 상층액을 버 리고 당일 제조한 0.
- 5% SDS polyacrylamide gel에서 전기영동 하였다. Nitrocellulose membrane에 전이시키고 5% non-fat skim milk로 blocking 시킨 후/ tyrosinase, actin’ TRP-1, TRP-2의 antibody를 1:500으로 희석하여 각각 실온에서 3시간 동안 반응시켰다. TBST로 3회 세척한 후 tyrosinase는 anti-rabbit HRP로, actin, TRP-1 및 TRP-2는 goat polyclonal IgG로 2차 antibody를 1:1000 으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.
- 처리한 후 5% formalin 용액으로 고정하였다. PBS로 3회세척하고 0.1% DOPA로 염색, 탈수하여 봉입한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
- TBST로 3회 세척한 후 tyrosinase는 anti-rabbit HRP로, actin, TRP-1 및 TRP-2는 goat polyclonal IgG로 2차 antibody를 1:1000 으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST로 세척한후 western detection 용액으로 발색 후 image analysis 기기 (ChemidocXRS)를 이용하여 band의 사진을 촬영하였다.
- 枳實 에탄올추출물을 50 ug/ml 및 80 ug/ml의 농도로 3일동안 처리하고, 각 군당 3×106 개의 세포를 수집한 다음 멜라닌양을 측정하였다. 그 결과 枳實 에탄올추출물 50 ug/ml과 80 ug/ml 처리군은 대조군의 0.
- 枳實 에탄올추출물이 B16/F10세포 증식에 미치는 영향을알아보기 위하여 12.5 ug/ml, 에서 80 ug/ml까지 다양한 농도로 처리하고 24시간 배양하면서 각각 MTT assay 방법으로 세포생존율을 조사하였다. 그 결과 枳實 에탄올추출물의 농도가 증가함에따라 세포생존율이 감소하였으며, 24시간 처리군의 경우 모든 농도 구간에서 대조군보다 낮은 생존율을 보였다(Fig.
- 枳實의 멜라닌 합성에 대한 억제효과와 조절기전에 미치는영향을 알아보고자 B16/F10세포를 이용하여 枳實 에탄올추출물의 tyrosinase 활성과 멜라닌 형성에 미치는 영향을 관찰하고, 멜라닌 합성에 관여하는 효소인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 단백질 발현을 조사하였다.
- 12). 또한 枳實 추출물에 대한 보고로는, MeOH로 추출하고 이를 유기용매와 물로 분획하여 시료를 이용하여 B16 mouse melanoma cell lines에서 melaniri생성 저해 활성만을 측정하였다19).
- 멜라닌 정량은 Hosoi 등의 방법16)을 변형하여 사용하였다. B16/F10 세포를 직경 10 cm 배양용기에 개씩 분주하여 부착시킨 후, 枳實을 각각 처리하여 3일 동안 배양하였다.
- 1% MTT를 배양용기에 분주한 후 3시간 동안 배양하였다. 상층액을 제거하고쎨온에서 25분간 DMSO에 fomiazan 침전물을 녹인 후 ELISA reader로 흡광도(540 rm)를 측정하여 대조군과 비교하였다.
- 4℃, 13, 000 rpm에서 30분간 원심분리를 하여 얻은상층액을 tyrosinase 활성측정 용액으로 사용하였고/ protein assay 용액 (Bio Rad, USA) 으로 흡광도(595 nm)를 측정/ 동량의단백 질 양을 계산하였다. 시료 50 ul와 0.1 M sodium phosphate buffer 150 ul 0.1 M catechol 50 ul를 분주하여 혼합한 후 ELISA reader기로 37℃에서 405 nm의 파장으로 1시간동안 30분간격으로 흡광도의 변화를 측정하였다. 활성율은 대조군의 흡광도를 기준으로 한 백분율로 환산하였다.
- 10% DMSO가 첨가된 1 N NaOH 용액으로 85℃에서 1시간 동안 멜라닌을 용해시키고, 405 run에서 흡광도를 측정하였다. 한편 멜라닌 색소는 각 군당 5×106개의 세포를 수거하여 육안 적으로 멜라닌세포의 색깔을 관찰하였다.
대상 데이터
- Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), antibiotic-antimycotic/ trypsine Gibco사(NY/ USA) 제품/ fetal bovine serum(FBS)은 Hyclones사(Logan, UK) 제품/ thiazolyl blue tetrazolium bromide(MTT), dimethylsul-foxide(DMSO), triton X-100/ phenylmethyl sulfonylfluor ide(PMSF), L-3/4-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA)는 Sigma(MOz USA)사제품/ protein assay 시약은 bio-rad사(CA, USA) 제품/ anti-rabb it tyrosinase, TRP-1, TRP-2 antibody는 Santa Cruz(CA, USA)사제품/ hybond-ECL nitrocellulose membrane, western blotting detection reagents 는 Amersham Biosciences사 제품/ non-fat skim milk는 Becton사 제품/ leupeptin, aprotinin, bovine serum albtimin(BSA), N/N/NeN2 * * * * 7-tetramethylethylenediamine(TEMED) 은 Sigma사 제품을 사용하였다.
- 국산 규격품인 枳實 200g 에 에탄올 2 /를 가하고 밀봉하여 48시간 동안 실온에서 냉침 시킨 후 거즈로 여과하여 감압 농축후 3.53 g의 시료 (수득률: 1.765%)를 얻어 냉장 보관하였으며, 시료는 분주하여 DMSO에 녹여 사용하였다.
- 실험에 사용된 枳實 (Ponciri Fructus)은 한국 경북 영천시에서 채취한 국산 규격품을 정선 하여 냉장실에 보관하면서 사용하였다.
- 한국 세포주 은행 에서 분양받은 B16/F10 mouse melanoma 세포를 10% fetal bovine serum(FBS)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)을 사용하여 CO2 incubator(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 Paired t-test를 이용하여 p-value를 구하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 세포 내 tyrosinase 활성은 Martinez-Esparza 등의 방법⑸으로 측정하였다. B16/F10세포를 6 well 배양용기에 3×105개씩 분주하여 24시간 동안 배양하여 세포를 부착시킨 후, 枳實(50, 80 ug/ml)을 각각 처리하고 72시간 배양하였다.
성능/효과
- B16/F10세포를 수거하여 멜라닌 색소침착의 변화를 확인한결과 대조군은 갈색의 세포침전물을 이루는 반면, 枳實 에탄올추출물 80 ug/ml 처리군은 현저히 옅은 갈색으로 멜라닌색소의 생성이 현저히 감소되었음을 확인하였다(Fig. 3).
- 枳實 에탄올추출물은 B16/F10세포의 tyrosinase의 활성을 억제하였다. 枳實 에탄올추출물은 B16/F10 세포의 멜라닌 합성 양을 유의하게 감소시 켰으며, 색소침 착의 육안적 관찰에서도 멜라닌 생성이 감소되었다. 枳實 에탄올추출물은 tyrosinase와 TRP-1의 단백질발현을 억 제하였다.
- 측정하였다. 그 결과 枳實 에탄올추출물 50 ug/ml과 80 ug/ml 처리군은 대조군의 0.511(O.D.값, 100%)에 비해 0.151(30%), 0.097(19%)으로 멜라닌색소를 유의하게 감소시켰다(Fig. 2).
- 5 ug/ml, 에서 80 ug/ml까지 다양한 농도로 처리하고 24시간 배양하면서 각각 MTT assay 방법으로 세포생존율을 조사하였다. 그 결과 枳實 에탄올추출물의 농도가 증가함에따라 세포생존율이 감소하였으며, 24시간 처리군의 경우 모든 농도 구간에서 대조군보다 낮은 생존율을 보였다(Fig. 1). 즉 枳實 에탄올추출물은 12.
- 두 단계 반응을 촉매하면서 시작된다. 따라서 枳實 에탄올 추출물이 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 조사한 결과/ 枳實 에탄올추출물 50 ug/ml과 80 ug/ml 농도에서 각각 대조군에 비하여감소하였다(Fig. 4).
- 하고 있다찌. 본 실험에서 western blot 분석을 통해 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 단백질을 측정한 결과, 枳實 추출물 80 ug/ml 농도에서 대조군에 비하여 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2 의 단백질 양이 유의하게 감소하였음을 알 수 있었다(Fig. 5).
- 본 실험에서 枳實 에 탄올추출물의미 백효능을 조사한 결과 80 傩/皿 농도에서 B16/F10세포의 멜라닌 생성을 효과적으로억제하였다(Fig. 3). 이와 더불어 枳實 에탄올추출물은 80 ug/ml 농도까지도 B16F10세포의 증식을 억제하는 것으로 나타났다 (Fig.
- 효소 반응에 의하여 일어난다. 본 연구에서 western blot을 이용하여 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 단백질을 측정한 결과 枳實 에탄올추출물 80 ug/ml 농도에서 대조군에 비하여 tyrosinase, TRP-1 및 TRP-2의 단백질 양이 유의하게 감소하였음을 알 수 있었다(Fig. 5)
- 의해 시작된다. 본 연구에서 枳實 에탄올추출물이 tyrosinase 효소 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 枳實 에탄올추출물 50 ug/ml과 80 ug/ml 농도에서 각각 대조군의 74±2.1%, 50±9.0% 로 tyrosinase의 활성이 감소하였다(Fig. 4).
- 이상의 결과 枳實 에 탄올추출물은 tyrosinase와 TRP-1 발현억제를 통하여 멜라닌합성을 감소시켰으며 미백 활성 물질로서의 가능성을 나타내었다.
- 3). 이와 더불어 枳實 에탄올추출물은 80 ug/ml 농도까지도 B16F10세포의 증식을 억제하는 것으로 나타났다 (Fig. 1). 이는 기존의 hydroqtiinone, kojic acid와 같은 미백물질이 세포독성을 나타낸 사실과 비교해볼 때 枳實 에탄올추출물은매우 안정적인 후보물질로 생각된다.
- 1). 즉 枳實 에탄올추출물은 12.5 ug/ml부터 80 ug/ml까지 모든 농도 구간에서 B16/F10세포의 증씩을 약간 억제 하는 것으로 나타났다.
후속연구
- 이상의 결과 枳實 에 탄올추출물은 tyrosinase와 TRP-1 효소의 발현 억제를 통하여 멜라닌 합성을 감소시켰으며 B16/F10세포의 증식을 억제하여 枳實 에탄올추출물이 미백효과가 있음을알 수 있었으며, 아울러 ct-MSH 등 자극된 세포에서의 枳實 에탄올추출물의 미백효과 등 보다 추후적인 연구가 필요할 것으로사료된다.
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