[논문]삼소음 알코올 추출물이 생쥐 면역세포의 시토킨 조절에 미치는 효과

류내형; 박성민; 강희; 심범상; 김성훈; 최승훈; 안규석

문제 정의

이에 본 저자는 한의학에서 일컬어지는 精氣를 補하면서 傷寒을 치료하는 蔘蘇飮이 면역력을 키울 수 있을 것이라 생각하였다. 이는 삼소음이 어떤 특정질병에 쓰이기보다 '전체적인 인체의 精氣가 耗損된 상태에서 외부의 邪氣가 침 입했을 때 사용한다5), 라는 용법을 감안하였고 또한 삼소음이 항알레르기에 유효한 결과가 있었다可는 점에 이러한 가정을 하였으며, 이러한 가정을 토대로 삼소음이 면역을 담당하는 T-cell에, 틐히 체액성 면역을 담당하는 Th2 분화에 어떤 효과를 주는가에 대해서 실험하여 결과를 관찰해보았다.
본 실험에서는 삼소음 추출물이 CD4 T 세포의 증식에 미치늘 효과, 삼소음이 mitogen으로 자극쬔 CD4 T 세포의 인터페론감마 (interferon-Y; IFN-?) 와 인터루킨-4(interleukin-4; IL-4) 분비에 미치는 효과, 삼소음 경구투여가 생쥐의 T 세포 활성과 세포증식 및 혈청 내 IFN-y/IL-4 분비에 미치는 효과, 삼소음이 Thl/Th2 편향(polarization)에 미치는 영향을 측정한 결과 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
본 실험은 위와 같이 虛症을 補하면서 解表할 수 있는 처방인 삼소음이 면역세포에 미치는 영향을 확인하픂 이를 통해 삼소음이 전체적인 면역작용에 어떠한 작용을 할지에 대해서 알아보고자 시행되었다.
삼소음의 경우투여 후 생쥐 serum 내의 cytokine 분비 량의변화를 알아보는 실험도 하였는데 이늖 Anti-CD3 antibodyM 전체 면역계를 인위적으로 자극했을 때 이 두 가지 사이토카인의분비에 미치는 영향을 본 것이다. 삼소음이 Thl cell/Th2 ceU 분화와 관련이 있는 IFN-x와 IL-4 이 두 물질의 분비에 어떠한 영향을 주는지에 대한 실험이었다.
미치는 영향을 본 것이다. 삼소음이 Thl cell/Th2 ceU 분화와 관련이 있는 IFN-x와 IL-4 이 두 물질의 분비에 어떠한 영향을 주는지에 대한 실험이었다. 이 실험 결과 삼소음은 IFN-x나 IL4의 증감에 유의성있는 결과를 나타내지는 못하였다.

가설 설정

이는 삼소음이 어떤 특정질병에 쓰이기보다 '전체적인 인체의 精氣가 耗損된 상태에서 외부의 邪氣가 침 입했을 때 사용한다5), 라는 용법을 감안하였고 또한 삼소음이 항알레르기에 유효한 결과가 있었다可는 점에 이러한 가정을 하였으며, 이러한 가정을 토대로 삼소음이 면역을 담당하는 T-cell에, 틐히 체액성 면역을 담당하는 Th2 분화에 어떤 효과를 주는가에 대해서 실험하여 결과를 관찰해보았다.

제안 방법

2. 비장세포 부유액의 준비

비장을 생쥐로부터 적출하여 10% FBS, 1% antibiotic-antimycotic 이 함유된 RPMI-1640으로 세척하였다. Micro slide glass로 비장을 잘게 으깬 뒤 0.
1000 rpm, 10분간 원심분리한 후 RBC lysis buffer로 적 혈구를 파괴하였다. 2회 원심분리한 후 비장 세포를 trypan blue exclusion assay를 통해 생존율을 확인한 후 세포수를 측정하였다.
비장의 CD4+ T 세포를 anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody (mitogen)으로 자극하였을 때의 증식능력을 측정하기위해 anti-CD3e (10 ㎍/㎖)가 칠해진 96-well plate 에 4xl04 5cells/200 ㎕의 농도로 세포를 넣은 후 anti-CD28 (2 ㎍/㎖) 을 넣고 함께 증식을 자극시켰다. 삼소음을 0, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖의 농도로 투여하고 37 ℃, 5% CO2 배 양기에서 48시간 동안 배양하였다.
넣고 함께 증식을 자극시켰다. 삼소음을 0, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖의 농도로 투여하고 37 ℃, 5% CO2 배 양기에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 cell titer 96R aqueous one solution reagent를 20 ㎕ 씩 well 에 첨가하였다.
배양 후 cell titer 96R aqueous one solution reagent를 20 ㎕ 씩 well 에 첨가하였다. 세포와 반응하여 형성된 formazan 색 소를 microplate reader (Tecan, Austria)# 이용하여파장 490-650 nm 에서 optical density를 측정하였다.
여기에 anti-CD28 (2 ㎍/㎖)을 넣고 함께 증식을 자극시켰다. 삼소음을 0, 10, 50, 200 ㎍/㎖의 농도로 투여한 후, 48시간 동안 37 ℃, 5% CO2 배 양기에서 배양한 후 상층액을 수거하여 ELISA로 분석하였다.
첨가하였다. Thl 편향 조건(polarizing condition)을 만들기 위해서 rIL-12 (5 ng/㎖) 와 anti-IL-4 (10 ㎍/㎖)를 넣었으며 Th2 편향조건을 위해서는 rIL-4 (5 ng/㎖) 과 anti-IL-12 (10㎍/㎖) 을 추가한 후 3일간 배양하였다. 이후 상층액을 수거하여 ELISA로 분석하였다.
Thl 편향 조건(polarizing condition)을 만들기 위해서 rIL-12 (5 ng/㎖) 와 anti-IL-4 (10 ㎍/㎖)를 넣었으며 Th2 편향조건을 위해서는 rIL-4 (5 ng/㎖) 과 anti-IL-12 (10㎍/㎖) 을 추가한 후 3일간 배양하였다. 이후 상층액을 수거하여 ELISA로 분석하였다.
삼소음을 PBS에 녹여 생쥐 몸무게 1 g/kg 농도로 7일 동안하루에 한 번씩 경구 투여 하였다. 정상군과 대조군은 동량의 PBS를 투여하였다.
한 번씩 경구 투여 하였다. 정상군과 대조군은 동량의 PBS를 투여하였다. 8일째 되는 날, 생쥐는 anti-CD3e (4 ㎍/㎖ in 0.
정상군과 대조군은 동량의 PBS를 투여하였다. 8일째 되는 날, 생쥐는 anti-CD3e (4 ㎍/㎖ in 0.1㎖ of PBS) 로 생쥐 미정맥에 정맥주사 하였다. 90분이 지난후, 생쥐 심장에서 혈액을 채취한 후, 비장을 적출하여 비장세포를 분리하였다.
1㎖ of PBS) 로 생쥐 미정맥에 정맥주사 하였다. 90분이 지난후, 생쥐 심장에서 혈액을 채취한 후, 비장을 적출하여 비장세포를 분리하였다. 혈청은 -20 ℃ 보관 후, IL4와 IFN-y levels를 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다.
90분이 지난후, 생쥐 심장에서 혈액을 채취한 후, 비장을 적출하여 비장세포를 분리하였다. 혈청은 -20 ℃ 보관 후, IL4와 IFN-y levels를 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. 또한 분리한 비장 임파구는 FACS analysis 를 위해 cells/㎖로 세포수를 맞추어 anti-CD3e-FITC/ anti-CD69-PE 혹은 anti-CD8-FITC/ anti-CD4-PE 로 세포증식을 자극시 킨 후 FACScan (Becton Dickinson, USA)과 software program (WinMDI 2.
혈청은 -20 ℃ 보관 후, IL4와 IFN-y levels를 측정하기 위해 ELISA를 수행하였다. 또한 분리한 비장 임파구는 FACS analysis 를 위해 cells/㎖로 세포수를 맞추어 anti-CD3e-FITC/ anti-CD69-PE 혹은 anti-CD8-FITC/ anti-CD4-PE 로 세포증식을 자극시 킨 후 FACScan (Becton Dickinson, USA)과 software program (WinMDI 2.7; Scripps Institute, USA)로 분석하였다.
10% FBS가 함유된 PBS를 200 成 /well씩 넣고 1시간 상온에 둔 채 blocking하였다. 3회 세척하여 blocking buff er 를 완전히 제거한 후 standard mlL -4과 standard mlFN-x 및 각각의 적당량 희석된 시료들을 100 ㎕씩 분주하여 2시간 상온에 두었다. 5회 세척한 후 각각의 biotinylated detection antibody를 100 ㎕씩 분주한 후 1시간 상온에 두었다.
3회 세척한 후에 streptavidin-HRP를 100 ㎕ 분주한 후 상온에 30분간 두었다. 3회 세척한 후에 각각의 시료에 TMB substrate reagent 100 ㎕씩 가한 후 30분이 지 나서 IM H2SO4 50 ㎕를 첨가하였다. Microplate reader로 파장 450-570nm에서 optical density를 측정하였다.
삼소음 알코올 추출물이 anti-CD3/CD28로 자극했을 때의 CD4+ T cell의 proliferation과 cytokine 분비에 미치는 영향/ 삼소음의 경구투여가 mouse의 T cell activation과 population에 미치는 영향/ 경구투여 후 mouse의 serun내의 cytokine 분비 량의변화/ mouse의 Thl/Th2 polarization에 미치는 영향을 살펴보아다음과 같은 결론을 얻었다.

대상 데이터

용해를 촉진하였다. 이 용액을 여과지로 여과한 다음 rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan)로 감압 농축한 뒤 1000 round flask에 옮겨 freezing dryer (Eyela, Japan) 로 24시간 동안동결건조하여 건조된 분말을 실험에 사용하였다 (yield: 9.68 %).

데이터처리

실험결과는 평균값으로 표시하였으며 SPSS 12.0을 이용하여 Studenfs t-test로 처리하였다.

성능/효과

삼소음 추출물을 농도별로 mouse CD4+ T 세포에 넣고 anti-CD3e 와 anti-CD28로 48시간 자극한 결과 50, 100, 200 ㎍/㎖ 투여군은 세포증식이 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 증가한 반면 400 ㎍/㎖투여군은 유의한 차이가 없었다(Fig. 1).
Anti-CD3e (10 ㎍/㎖) 와 anti-CD28 (2 ㎍/㎖)를 처리한 비장 임파구에 삼소음을 0, 10, 50, 200 ㎍/㎖의 농도로 투여하고배 양액 중의 IFN-y 와 IL4의 변화를 ELISA 방법으로 측정한 결과, IFN-x는 삼소음 투여군 모두에서 대조군에 비해 통계적으로유의하게 감소하였고, IL4는 삼소음 50, 200 ㎍/㎖에서 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Table 2, Fig. 2, 3).
Balb/c 생쥐에게 삼소음을 7일간 경구투여한 후 미정맥에 anti-CD3 antibody# 주사하고 90분 후에 생쥐의 비장세포를 면역형광염색법으로 CD3(+)/CD69(+) 세포의 비율을 확인한 결과삼소음을 투여한 군은 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 증가하였다(Fig. 4).
Balb/c 생쥐에게 삼소음을 7일간 경구투여한 후 미정맥에 anti-CD3 antibody를 주사하고 90분 후에 생쥐의 비장세포를 면역형광염색법으로 CD4와 CD8의 세포수를 측정한 결과, 삼소음을 투여한 군은 CD4+ T 세포가 대조군과 비교하여 7% 증가하였으나 통계적 유의성은 없었고, CD8+ I 세포는 대조군과 비교하여 8% 증가하였고 통계적으로도 유의성이 있었다(Fig. 5).
Balb/c 생쥐에게 삼소음을 7일간 경구투여한 후 미정맥에 anti-CD3 antibody# 주사하고 90분 후에 생쥐의 혈액을 채취하여 혈청내 면역능의 변화를 관찰한 결과, IFN-x와 IL-4 모두 실험군과 대조군 사이에 통계적으로 유의한 차이가 없었다(Table 3, Fig. 6, 7).
삼소음의 알코올 추출물이 CD4 T-cell의 증식에 미치는 효과를 알아보기 위해서 삼소음 추출물을 농도별로 생쥐 CD4 T-cell에 벟고 mitogen으로 자극한 결과 50 ㎍/㎖에서 30%의 증식이 있었으며 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖게서도 증식이 있었다. 그러나 400 ㎍/㎖에서는 오히려 증식을 억제하는 효과를 나타내었는데 이는 삼소음 추출물이 면역세포 증식에 있어서 일정한 증식이나 억제의 효과를 내는 것이 아니라 농도에 따라 각기 다른 효과를 발휘함을 알 수 있다.
삼쇼음이 mitogen으로 자극된 CD4 T-cell의 cytokine 분비에 미치는 효과를 알아보기 위해서 생쥐 비장임파구에 삼소음을 0, 10, 50, 200 ㎍/㎖의 농도로 처리한 결과 IFN-y수치는 농도 의존적으로 감소하였으며 IL-4 수치 또한 50, 200 ㎍/㎖에서 70% 감소를 보였다. 이는 삼소음에 의해서 T-cell의 세포수가 증식된다고 해서 IFN-x와 IL-4 이 두 가지 cytokine도 증가하는 것은 아니며 삼소음이 unskewed condition에서 Thl polarization이나 Th2 polarization을 결정짓는 이 두 가지 사이토카인의 분비를모두 감소하는 것으로 보인다고 말할 수 있다.
삼소음을 경구투여 했을 때 생쥐의 T-cell activation에 어떠한 영향을 미치는가를 알아본 실험에서는 9%의 activation 증가를 나타내고 있어 세포 증식 실험과 마찬가지로 면역세포의 활성도를 높인다고 할 수 있다. 또한 삼소음 경구투여 후 생쥐의 T-cell population의 차이에 대한 실험에서는 CD4/CD8 둘다 7~8% 증식시키는 결과가 나타나서 삼소음의 경구투여는 면역세포를 증식시키면서 활성도를 높이는 데 유효한 것으로 관찰되었다.
높인다고 할 수 있다. 또한 삼소음 경구투여 후 생쥐의 T-cell population의 차이에 대한 실험에서는 CD4/CD8 둘다 7~8% 증식시키는 결과가 나타나서 삼소음의 경구투여는 면역세포를 증식시키면서 활성도를 높이는 데 유효한 것으로 관찰되었다.
이 실험 결과 삼소음은 IFN-x나 IL4의 증감에 유의성있는 결과를 나타내지는 못하였다. 다만 IFN-x는 다소 감소하였으며 IL-4는 다소 증가한 결과를 보였다. 마지막 실험으로 생쥐 CD4 T-cell을 Thl type cells 과 Th2 type cells 로 polarization해서 IFN-x와 IL-4 level을 측정하였는데 이는 세포수준에서 인위적으로 Till cell로 분화시키거나 Th2 cell 로 분화시킬 때 삼소음이 주는 영향을 본 것이다.
다만 IFN-x는 다소 감소하였으며 IL-4는 다소 증가한 결과를 보였다. 마지막 실험으로 생쥐 CD4 T-cell을 Thl type cells 과 Th2 type cells 로 polarization해서 IFN-x와 IL-4 level을 측정하였는데 이는 세포수준에서 인위적으로 Till cell로 분화시키거나 Th2 cell 로 분화시킬 때 삼소음이 주는 영향을 본 것이다. 실험결과 Thl type cells로 polarization된 경우 삼소음 50 ㎍/㎖으로 처리 했을, 때 IFN-y가 대조군에 비해 크게 감소되었으며 T112 type cells로 polarization 된 경우에는 농도에 관계없이 대조군에 비하여 증가하였고 10 ㎍/㎖으로 처리했을 때가 50 ㎍/㎖으로 처리했을때보다 더 많이 증가되었다.
마지막 실험으로 생쥐 CD4 T-cell을 Thl type cells 과 Th2 type cells 로 polarization해서 IFN-x와 IL-4 level을 측정하였는데 이는 세포수준에서 인위적으로 Till cell로 분화시키거나 Th2 cell 로 분화시킬 때 삼소음이 주는 영향을 본 것이다. 실험결과 Thl type cells로 polarization된 경우 삼소음 50 ㎍/㎖으로 처리 했을, 때 IFN-y가 대조군에 비해 크게 감소되었으며 T112 type cells로 polarization 된 경우에는 농도에 관계없이 대조군에 비하여 증가하였고 10 ㎍/㎖으로 처리했을 때가 50 ㎍/㎖으로 처리했을때보다 더 많이 증가되었다. 이는 삼소음이 Thl cell로 가는 것을억제하면서 Th2 cell로 분화하는 것을 촉진하는 효과가 있다는것으로 해석할 수 있다.
본 실험으로 삼소음이 전체적인 면역 세포의 증식을 돕고, 활성도를 높이는 효과를 준다고 평가할 수 있다. Thl/Th2 분화에 대 한 효과는 Thl cell로 분화를 억 제하고 Th2 cell로 분화를 활성화 하는 것으로 나타났는데 이는 체액성 면역에 활성화로 면역력 강화에 도움을 주며 세포성 면역의 항진을 떨어뜨려 자가면역질환에 대한 위험도를 낮출 수 있는 가능성을 제시한다.
삼소음 알코올 추출물을 생쥐 CD4 T-cell에 넣고 anti-CD3 와 anti-CD28로 48시간 자극한 결과 CD4 T-cell population이 50 ㎍/㎖에서 30% 증가, 100, 200 ㎍/㎖에서도 증가하였다.
생쥐에 삼소음을 7일간 경구투여 후 생쥐에 anti-CD3 antibody를 주사하고 CD3/CD69 cell 비 율을 확인한 결과 T-cell activation이 9% 증가하였다.
생쥐에 삼소음을 경구투여 후 CD4와 CD8을 확인한 결과 CD8 positive population이 8% 증가하였다.
생쥐 CD4 T-cell을 Thl cell과 Th2 cell로 polarization 한 후 3일간 삼소음 추출물과 배 양한 결과 Thl 세포의 IFN%는 삼소음 10 ㎍/㎖에서 2% 증가하였으나 50 ㎍/㎖에서 44% 감소하였고/ Th2 세포의 IL4는 삼소음 10 ㎍/㎖일 때 60% 증가하였다.

후속연구

Thl/Th2 분화에 대 한 효과는 Thl cell로 분화를 억 제하고 Th2 cell로 분화를 활성화 하는 것으로 나타났는데 이는 체액성 면역에 활성화로 면역력 강화에 도움을 주며 세포성 면역의 항진을 떨어뜨려 자가면역질환에 대한 위험도를 낮출 수 있는 가능성을 제시한다. 그러나 위에서 언급했듯이 Till cell이 병적으로 많을 경우 세포성 면역이 과항진되어 자가면역 질환이 발생할 가능성이 높아지고, Th2 cell 이 병적으로 많을 경우 체액성 면역이 과항진되어 알레르기 질환이 발생할 가능성이 많아지게 되는 양날의 검과 같은 면역의 역효과가 존재함으로 이러한 TM/T112 분화의 효과적인 조절방법에 대해서는 추후에 심도깊은 연구가 필요할 것으로 보인다.

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