캐피어 원말은 유산균, 효모, 다당 및 여러 영양성분을 다량 함유하고 있으며 장기능 개선 효능을 살펴보기 위하여 3주령의 수컷 흰쥐 (Sprague-Dawley)를 4군으로 나누어 정상대조군 (N군), DSS투여 대조군 (DC군)과 두 군의 캐피어 투여군으로 하여 대조군 사료와 캐피어 원말을 각각 1.5%와 3.0% 혼합한 사료로 3주간 사육하였다. 이 후 DSS투여 대조군과 캐피어 투여군들에 5일간 2% DSS 음용수 동일한 양을 투여하여 경미한 대장염을 유도하였다. 대장염 유도 후 희생하여 소장 단백질 및 DNA 함량, 혈장 및 결장의 조직검사와 결장조직에서 TBARS와 MPO 활성, 혈장 백혈구에서의 DNA 손상 정도를 측정하였다. 실험 자료는 Windows용 SPSS package program version12.0을 이용하여 통계 처리하였고, 네 군간의 평균값의 차이를 검증하기 위하여 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA)을 한 후, Duncan's multiple range test로 변인간의 차이를 검증하였다. DSS 투여군 들에서 변 수분함량이 증가하고 음용수 섭취량이 증가하는 경향과 함께 결장의 조직검사 결과 DSS 투여군에서는 염증과 부종 증상을 관찰할 수 있었으며 식이무게의 3% 캐피어 원말 투여군에서는 재생성 변화를 볼 수 있었다. DSS를 투여받은 군들의 소장 점막 단백질 함량은 감소하는 경향을 보였으며 캐피어 3.0%식이섭취한 군들에서는 증가하는 경향을 보였으나 DNA함량에서는 차이를 볼 수 없었다. DSS 투여군에서는 결장조직의 TBARS 값이 유의적으로 증가하였으며 캐피어 투여군에서는 감소하였으나 캐피어 투여 용량에 따른 차이는 보이지 않았다. 혈장 TBARS와 결장조직의 MPO 활성은군 간에 유의한 차이가 없었다. DSS 투여군에서는 혈액 백혈구 DNA의 tail length가 유의하게 증가하였으며 캐피어 투여군에서는 감소하였다. 따라서 약 4주간 캐피어 원말의 투여는 2%의 DSS로 경미한 대장염을 유도한 흰쥐에서 결장 조직의 산화적 스트레스에 대한 저항력을 증가시켜 대장점막을 보호할 수 있는 기능이 있음을 확인할 수 있었다.
캐피어 원말은 유산균, 효모, 다당 및 여러 영양성분을 다량 함유하고 있으며 장기능 개선 효능을 살펴보기 위하여 3주령의 수컷 흰쥐 (Sprague-Dawley)를 4군으로 나누어 정상대조군 (N군), DSS투여 대조군 (DC군)과 두 군의 캐피어 투여군으로 하여 대조군 사료와 캐피어 원말을 각각 1.5%와 3.0% 혼합한 사료로 3주간 사육하였다. 이 후 DSS투여 대조군과 캐피어 투여군들에 5일간 2% DSS 음용수 동일한 양을 투여하여 경미한 대장염을 유도하였다. 대장염 유도 후 희생하여 소장 단백질 및 DNA 함량, 혈장 및 결장의 조직검사와 결장조직에서 TBARS와 MPO 활성, 혈장 백혈구에서의 DNA 손상 정도를 측정하였다. 실험 자료는 Windows용 SPSS package program version12.0을 이용하여 통계 처리하였고, 네 군간의 평균값의 차이를 검증하기 위하여 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA)을 한 후, Duncan's multiple range test로 변인간의 차이를 검증하였다. DSS 투여군 들에서 변 수분함량이 증가하고 음용수 섭취량이 증가하는 경향과 함께 결장의 조직검사 결과 DSS 투여군에서는 염증과 부종 증상을 관찰할 수 있었으며 식이무게의 3% 캐피어 원말 투여군에서는 재생성 변화를 볼 수 있었다. DSS를 투여받은 군들의 소장 점막 단백질 함량은 감소하는 경향을 보였으며 캐피어 3.0%식이섭취한 군들에서는 증가하는 경향을 보였으나 DNA함량에서는 차이를 볼 수 없었다. DSS 투여군에서는 결장조직의 TBARS 값이 유의적으로 증가하였으며 캐피어 투여군에서는 감소하였으나 캐피어 투여 용량에 따른 차이는 보이지 않았다. 혈장 TBARS와 결장조직의 MPO 활성은군 간에 유의한 차이가 없었다. DSS 투여군에서는 혈액 백혈구 DNA의 tail length가 유의하게 증가하였으며 캐피어 투여군에서는 감소하였다. 따라서 약 4주간 캐피어 원말의 투여는 2%의 DSS로 경미한 대장염을 유도한 흰쥐에서 결장 조직의 산화적 스트레스에 대한 저항력을 증가시켜 대장점막을 보호할 수 있는 기능이 있음을 확인할 수 있었다.
Probiotics have emerged as a potential treatment modality for numerous gastrointestinal disorders, including IBD. However, few probiotics have undergone appropriate preclinical screening in vivo. Kefir is considered a probiotic, benefiting the host through its effects in the intestinal tract. Despit...
Probiotics have emerged as a potential treatment modality for numerous gastrointestinal disorders, including IBD. However, few probiotics have undergone appropriate preclinical screening in vivo. Kefir is considered a probiotic, benefiting the host through its effects in the intestinal tract. Despite numerous studies examining the action of probiotics on the host organism, few have analyzed the effects on intestinal environment. We assessed the protective effect of kefir for three weeks before inducing colitis with 2% dextran sodium sulfate for five days. The DSS loads were similar in all DSS treatment group. The results of the experiment are as follows. Food intake and FER of experimental groups were not significantly different each other, but water consumption tended to be higher in all DSS treatment groups as compared with the normal control. And visual inspection of feces revealed mild diarrhea in rat given 2% DSS. The anti-inflammatory activity of kefir was determined by myeloperoxidase activity during the DSS treatment, and there was no significant difference in any group. The levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) as a colonic lipid peroxidation were significantly lower in the kefir intake groups than in rats treated with 2% DSS alone. The DNA % in tail and tail moment values as a DNA damage level of the blood lymphocytes in kefir intake groups tended to be lower than 2% DSS treatment alone, especially tail lengths were significantly diminished. According to the colonic histopathological assay, there were a severe inflammation of lamina propria and submucosa and mild edema in mucosa and sub mucosa in DSS alone treated group. We found a slight regenerative change in kefir treatment groups. In our experiments, this means that ulcerative colitis related to oxidative injury might be prevented by kefir as a probiotic. Further studies of the potential benefits of kefir as a probiotic in inflammatory condition are encouraged.
Probiotics have emerged as a potential treatment modality for numerous gastrointestinal disorders, including IBD. However, few probiotics have undergone appropriate preclinical screening in vivo. Kefir is considered a probiotic, benefiting the host through its effects in the intestinal tract. Despite numerous studies examining the action of probiotics on the host organism, few have analyzed the effects on intestinal environment. We assessed the protective effect of kefir for three weeks before inducing colitis with 2% dextran sodium sulfate for five days. The DSS loads were similar in all DSS treatment group. The results of the experiment are as follows. Food intake and FER of experimental groups were not significantly different each other, but water consumption tended to be higher in all DSS treatment groups as compared with the normal control. And visual inspection of feces revealed mild diarrhea in rat given 2% DSS. The anti-inflammatory activity of kefir was determined by myeloperoxidase activity during the DSS treatment, and there was no significant difference in any group. The levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) as a colonic lipid peroxidation were significantly lower in the kefir intake groups than in rats treated with 2% DSS alone. The DNA % in tail and tail moment values as a DNA damage level of the blood lymphocytes in kefir intake groups tended to be lower than 2% DSS treatment alone, especially tail lengths were significantly diminished. According to the colonic histopathological assay, there were a severe inflammation of lamina propria and submucosa and mild edema in mucosa and sub mucosa in DSS alone treated group. We found a slight regenerative change in kefir treatment groups. In our experiments, this means that ulcerative colitis related to oxidative injury might be prevented by kefir as a probiotic. Further studies of the potential benefits of kefir as a probiotic in inflammatory condition are encouraged.
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문제 정의
일반 가정에서 제조하여 섭취하는 캐피어 음료 (kefir milk) 에 비하여 유산균과 효모, 다당체와 영양성분들을 훨씬 많이 함유하고 있는 캐피어 원말을 그대로 섭취할 수 있다면 건강상 이점이 더욱 클 것이므로 캐피어 원말 자체를 섭취할 수 있도록 가공한 캐피어 제제는 그 나름대로 의의를 갖는다. 본 연구실에서는 이러한 목적으로 생산한 캐피어 원말의 in vivo 활성에 대한 연구가 필요하게 되었으며 본보에서는 특히 캐피어 원말의 장기능 개선에 대한 효능을 알아보고자 하여 경증의 대장염을 유도한 동물모델을 사용하여 혈액과 소장, 대장에서 염증관련 지표 및 산화 관련 지표를 측정함으로써 캐피어 원말이 대장의 보호효과를 나타낼 수 있는지를 확인하고자 하였다.
한편, 캐피어 발효유를 대량 생산하기 위해서는 기존 유산균 음료와는 다른 발효온도, 배양시간, 유산균과 효모의 혼합배양 조건 등 별도의 생산라인을 갖추어야 하는 이유로 국내의 유업계는 아직 대량 생산 체제를 갖추고 있지 못하고 있는 실정이다. 본 연구에서는 가정에서 캐피어 발효유를 제조하는데 따른 불편함을 해소하고 보다 유익한 미생물체의 직접적인 섭취를 돕고자 생산된 캐피어 원말 제제의 건강기능성을 검토하고자 하였다.
이렇게 제조된 캐피어 원말을 직접 섭취하였을 때 그의 건강 기능성을 검토하기 위하여 3주 이상 캐피어 원말을 섭취한 흰쥐에 2% DSS로 경증의 대장염을 유발시켰을 때 캐피어를 섭취하지 않은 군들에 비해 어떠한 건강상 이점이 있는지를 비교 평가하고자 하였다.
가설 설정
A: No sign of edema and inflammation. B: Severe inflammation of lamina propria. C: Severe inflammation with crypt microabscess of lamina propria & slight regenerative change.
B: Severe inflammation of lamina propria. C: Severe inflammation with crypt microabscess of lamina propria & slight regenerative change. D: Slight regenerative change of erosion.
C: Severe inflammation with crypt microabscess of lamina propria & slight regenerative change. D: Slight regenerative change of erosion.
제안 방법
10% 중성 포르말린 용액 (NBF: natural buffered formalin)에 고정시킨 결장 조직을 통상적인 방법으로 paraffin에 포매한 후 5 “m 두께의 연속절편으로 제작하였다. 조직의 일반적인 성상을 관찰하기 위하여 절편한 조직을 Xylene을 이용하여 탈파라핀 (deparaffination)한 후 ethanol을 농도별로 거치면서 가수 (hydration)시킨 후 hematoxylin에서 5분 동안 염색하고, 다시 1% acid alcohol 용액을 거친 후 ammonia water로 처리하였다.
1주간 분말사료에 적응시킨 후 평균 체중이 비슷하게네 군으로 나누어 4주간 실험사료로 사육하였다. 실험군은 정상 대조군 (N군), DSS투여 대조군 (DC)과 두 군의 캐피어 투여군으로 하였으며 실험 사료는 AIN-93M식이26)를기본으로 하여 대조군 사료와 캐피어 원말을 각각 1.
3주간 실험 식이를 섭취시키는 동안 체중 증가량은 일주일에 1회, 식이 섭취량은 2일에 한 번씩 측정하였다. 5 일간 대장염을 유도하는 시기에는 식이 섭취량, 체중 증가량 및 음용수 섭취량을 매일 측정하였다.
결정하였다. 3주간 캐피어 식이를 한 후 같은 식이를 1주일간 더 유지하면서 대장염유도군 (DC, DK-1.5, 3.0군) 에는 2% DSS 용액을 매일 조제하여 5일간 섭취시켰다. 총 DSS 섭취량과 섭취기간은 염증의 정도에 영향을 주므로 모든 동물의 1일 음용수 섭취량이 일정하도록 조절하였다.
5 일간 대장염을 유도하는 시기에는 식이 섭취량, 체중 증가량 및 음용수 섭취량을 매일 측정하였다. 변 수분함량은 대장염을 유도하는 5일 중 1, 3, 5일째의 변을 수거하여 측정하였다.
채혈 후 ligament of Treitz로부터 회맹판까지의 소장을 취하여 1/2씩 공장과 회장으로 나눈 뒤 생리식염수로 헹군 후 각 장의 초기 부분 1 cm씩 잘라 DNA와 단백질 함량 측정에 사용하였다. 결장은 식염수로 내강을 세척하고 수분을 제거한 후 조직검사용 시료로 0.5 cm 를 잘라 중성 포르말린에 담그고 나머지 결장을 반씩 잘라 앞부분은 지질 과산화를 측정하는데 사용하였으며 나머지 결장 조직은 myeloperoxidase (MPO) 활성 측정에 사용하였다.
결장의 지질과산화 측정을 위해서 결장조직의 무게를 측정한 후 1.15%의 KCl 완충용액으로 균질화한 10% 조직액을 시료로 이용하였다. 조직 균질액 200 “l에 8.
조직의 일반적인 성상을 관찰하기 위하여 절편한 조직을 Xylene을 이용하여 탈파라핀 (deparaffination)한 후 ethanol을 농도별로 거치면서 가수 (hydration)시킨 후 hematoxylin에서 5분 동안 염색하고, 다시 1% acid alcohol 용액을 거친 후 ammonia water로 처리하였다. 다시 eosin용액으로 염색한 후 ethan이을 농도별로 거치면서 탈수 (dehydration)시킨 후 xylene을 이용하여 cleaning 하여 구조적 형상을 광학현미경으로 평가하였다.
이후 DSS 투여 대조군과 캐피어 투여군들에 5일간 2% DSS 음용수 동일한 양을 투여하여 경미한 대장염을 유도하였다. 대장염 유도 후 희생하여 소장 단백질 및 DNA 함량, 혈장 및 결장의 조직검사와 결장조직에서 TBARS와 MPO 활성, 혈장 백혈구에서의 DNA 손상 정도를 측정하였다. 실험 자료는 Windows용 SPSS package program version12.
아닌 것으로 판단되었다. 따라서 보다 경한 대장염증세를 유도하기 위하여 2%의 DSS를 5일간 투여하였으며 그 결과 분변에는 육안으로 보아 분별이 가능한 혈변이나 점액성 물질에 의한 변화가 보이지는 않았으나 변의 수분 함량이 많아지고 동물의 수분섭취량이 증가하는 경향 등 경한 설사 증세가 발생하고 있었으므로 본 연구의 실험동물 모델로 선택하였다. 이후 실험 종료시 실시한 조직병리학적 관찰을 통하여 이러한 사실이 확인되었는데 대조군에서는 염증과 관련된 어떠한 소견도 보이지 않았으나 2% DSS 유도군 들에서는 점막 및 점막하층에 경미한 부종과 염증소견이 보였으므로 2% DSS의 5일간 투여로 인하여 염증반응이 유도되었음을 확인할 수 있었다.
5 일간 대장염을 유도하는 시기에는 식이 섭취량, 체중 증가량 및 음용수 섭취량을 매일 측정하였다. 변 수분함량은 대장염을 유도하는 5일 중 1, 3, 5일째의 변을 수거하여 측정하였다. 흰쥐의 항문을 자극하여 직장 내 보유된 신선한 변을 받아 105C dry oven에서 항량이 될 때까지 건조시킨 후 신선한 변의 무게와 건조된 변 무게의 차이로 변의 수분함량을 산출하였다.
살균한 전유에 10% Leuconostoc mesenteroides, Lactbacillus kefiri, Kluyveromyces maxianus로 구성된 캐피어그레인을 첨가하여 25C에서 20시간 정치 배양하여 캐피어 발효유를 제조하였다. 캐피어 액상에서 캐피어 그레인을 분리한 후 동결 건조 및 분쇄 과정을 거쳐 캐피어 원말을 제조하였다.
1N NaOH 용액내에서 polytron homogenizer 로 소장을 균질화한 후 30초간 초음파 파쇄하여 원심분리하였다. 상증액을 취해 발색시약 (Commassie brilliant blue G-250, Bio-Rad, USA)을 가하여 반응시킨 후 595 nm에서 흡광도를 읽어 단백질 함량을 측정하였다.
선행 연구결과18, 27)를 참고하여 dextran sodium sulfate (DSS, molecular weight, 36-44kDa)를 투여하여 대장염을 유도하였고 투여용량 역시 선행연구들과 예비실험을 통하여 최종 음용수 2% (W/V)로 5일간 투여하는 것으로 결정하였다. 3주간 캐피어 식이를 한 후 같은 식이를 1주일간 더 유지하면서 대장염유도군 (DC, DK-1.
세포핵의 image는 Komet 5.5 image analyz-ing system (Andor, UK)을 이용하여 분석하였다. DNA 손상 정도는 핵으로부터 이동한 DNA파편의 거리 (tail length, TL) 와 tail 내의 DNA 파편 함량 (%), 그리고 tail 길이와 tail내 DNA 파편 (fragment)의 곱으로 표시한 tail moment (TM) 로 나타내었다.
5N PCA (Perchloric acid)를 가하여 polytron homogenizer로 균질화 시킨 후 원심분리하여 상층액을 제거하고 남은 침전물을 시료로 사용하였다. 시료를 0.5N PCA 에 분산시키고 100C에서 20분 동안 incubation 후 다시 원심 분리하여 얻은 상층액에 PCA와 diphenylamine 발색제를 가한 다음 냉암소에서 12시간 overnight하여 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 98 “g/ ml의 DNA 표준용액 (SIGMA, USA)을 사용하였다.
1주간 분말사료에 적응시킨 후 평균 체중이 비슷하게네 군으로 나누어 4주간 실험사료로 사육하였다. 실험군은 정상 대조군 (N군), DSS투여 대조군 (DC)과 두 군의 캐피어 투여군으로 하였으며 실험 사료는 AIN-93M식이26)를기본으로 하여 대조군 사료와 캐피어 원말을 각각 1.5%와 3.0% 혼합한 사료 (사료의 1.5%와 3.0%; 각각 DK-1.5 군과 DK-3.0군)로 제조하였다. 캐피어 원말은 전유에 캐피어 원말을 접종하여 발효시킨 후 동결건조하여 분말화한 것으로 영양성분은 전지분유와 유사하므로 대조군 사료의 3%와 캐피어 1.
0% 혼합한 사료로 3주간 사육하였다. 이후 DSS 투여 대조군과 캐피어 투여군들에 5일간 2% DSS 음용수 동일한 양을 투여하여 경미한 대장염을 유도하였다. 대장염 유도 후 희생하여 소장 단백질 및 DNA 함량, 혈장 및 결장의 조직검사와 결장조직에서 TBARS와 MPO 활성, 혈장 백혈구에서의 DNA 손상 정도를 측정하였다.
15%의 KCl 완충용액으로 균질화한 10% 조직액을 시료로 이용하였다. 조직 균질액 200 “l에 8.1% SDS 200 “l와 400 “l의 20% acetic acid를 혼합한 후 200 “l의 0.8%의 TBA롤 넣고 100℃의 항온수조에서 30분간 가열하였다. 냉각후 1, 1, 1, 3-tetraethoxypropane (TMP) 을표준용액으로 사용하여 532 nm에서 흡광도를 측정하였다.
5% HTAB (hexadecyl-trimet-hylammonium bromide)를 가한 후에 얼음위에서 polytron homogenizer를 이용하여 균질화하였다. 조직균질액을 -70C에서 30분간 냉동하고 해동함을 3회 반복한 다음 원심분리하여 상층액 0.1 ml를 취하고 여기에 반응시약 (0.167 mg/ml O-dianisidine dihydrochloride, 0.0005% hydrogen peroxide, 50 mM potassium phosphate, pH 7.0)을 가하여 반응시킨 다음 460 nm 파장에서 H2O2의분해에 따른 흡광도의 변화를 측정하여 myeloperoxidase (MPO)의 활성도를 결정하였다.
제작하였다. 조직의 일반적인 성상을 관찰하기 위하여 절편한 조직을 Xylene을 이용하여 탈파라핀 (deparaffination)한 후 ethanol을 농도별로 거치면서 가수 (hydration)시킨 후 hematoxylin에서 5분 동안 염색하고, 다시 1% acid alcohol 용액을 거친 후 ammonia water로 처리하였다. 다시 eosin용액으로 염색한 후 ethan이을 농도별로 거치면서 탈수 (dehydration)시킨 후 xylene을 이용하여 cleaning 하여 구조적 형상을 광학현미경으로 평가하였다.
즉, 결장조직에 0.5% HTAB (hexadecyl-trimet-hylammonium bromide)를 가한 후에 얼음위에서 polytron homogenizer를 이용하여 균질화하였다. 조직균질액을 -70C에서 30분간 냉동하고 해동함을 3회 반복한 다음 원심분리하여 상층액 0.
희생 전 12시간 절식시킨 실험동물을 diethyl ether로 가볍게 마취한 후 헤파린 처리한 주사기를 이용하여 heart puncture하였으며 전혈의 일부는 Comet assay와 혈구 분석 (CBC)에 사용하고 나머지 혈액은 3, 000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 혈장을 취해 -20C에서 냉동 보관하였다가 혈장 성분 분석에 사용하였다. 채혈 후 ligament of Treitz로부터 회맹판까지의 소장을 취하여 1/2씩 공장과 회장으로 나눈 뒤 생리식염수로 헹군 후 각 장의 초기 부분 1 cm씩 잘라 DNA와 단백질 함량 측정에 사용하였다. 결장은 식염수로 내강을 세척하고 수분을 제거한 후 조직검사용 시료로 0.
0군) 에는 2% DSS 용액을 매일 조제하여 5일간 섭취시켰다. 총 DSS 섭취량과 섭취기간은 염증의 정도에 영향을 주므로 모든 동물의 1일 음용수 섭취량이 일정하도록 조절하였다.
캐피어 원말은 유산균, 효모, 다당 및 여러 영양성분을 다량 함유하고 있으며 장기능 개선 효능을 살펴보기 위하여 3주령의 수컷 흰쥐 (Sprague-Dawley) 를 4군으로 나누어 정상 대조군 (N군), DSS투여 대조군 (DC군)과 두 군의 캐피어 투여군으로 하여 대조군 사료와 캐피어 원말을 각각 1.5%와 3.0% 혼합한 사료로 3주간 사육하였다. 이후 DSS 투여 대조군과 캐피어 투여군들에 5일간 2% DSS 음용수 동일한 양을 투여하여 경미한 대장염을 유도하였다.
0군)로 제조하였다. 캐피어 원말은 전유에 캐피어 원말을 접종하여 발효시킨 후 동결건조하여 분말화한 것으로 영양성분은 전지분유와 유사하므로 대조군 사료의 3%와 캐피어 1.5%군 사료의 1.5%는 카제인 대신 전지분유로 대치하여 제조하였다 (Table 1).
흰쥐의 항문을 자극하여 직장 내 보유된 신선한 변을 받아 105C dry oven에서 항량이 될 때까지 건조시킨 후 신선한 변의 무게와 건조된 변 무게의 차이로 변의 수분함량을 산출하였다. 희생 전 12시간 절식시킨 실험동물을 diethyl ether로 가볍게 마취한 후 헤파린 처리한 주사기를 이용하여 heart puncture하였으며 전혈의 일부는 Comet assay와 혈구 분석 (CBC)에 사용하고 나머지 혈액은 3, 000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 혈장을 취해 -20C에서 냉동 보관하였다가 혈장 성분 분석에 사용하였다. 채혈 후 ligament of Treitz로부터 회맹판까지의 소장을 취하여 1/2씩 공장과 회장으로 나눈 뒤 생리식염수로 헹군 후 각 장의 초기 부분 1 cm씩 잘라 DNA와 단백질 함량 측정에 사용하였다.
변 수분함량은 대장염을 유도하는 5일 중 1, 3, 5일째의 변을 수거하여 측정하였다. 흰쥐의 항문을 자극하여 직장 내 보유된 신선한 변을 받아 105C dry oven에서 항량이 될 때까지 건조시킨 후 신선한 변의 무게와 건조된 변 무게의 차이로 변의 수분함량을 산출하였다. 희생 전 12시간 절식시킨 실험동물을 diethyl ether로 가볍게 마취한 후 헤파린 처리한 주사기를 이용하여 heart puncture하였으며 전혈의 일부는 Comet assay와 혈구 분석 (CBC)에 사용하고 나머지 혈액은 3, 000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 혈장을 취해 -20C에서 냉동 보관하였다가 혈장 성분 분석에 사용하였다.
대상 데이터
Samtaco Bio Korea (Osan, Korea)로부터 3 주령의 수컷 흰쥐 (Sprague-Dawley) 롤 구입하여 12시간 dark-light cycle로 조절한 실험실 내에 설치한 micro ventilation cage system (온도 23 ±2℃, 습도 50 ±5%) 내에서 사육하였다. 1주간 분말사료에 적응시킨 후 평균 체중이 비슷하게네 군으로 나누어 4주간 실험사료로 사육하였다.
DNA 손상 정도는 핵으로부터 이동한 DNA파편의 거리 (tail length, TL) 와 tail 내의 DNA 파편 함량 (%), 그리고 tail 길이와 tail내 DNA 파편 (fragment)의 곱으로 표시한 tail moment (TM) 로 나타내었다. 각 시료마다 준비된 2개의 slide 에서 각각 50 개씩 총 100개의 세포핵을 무작위로 선택하여 측정하였다.
실험에 사용한 캐피어 원말은 (주)더멋진바이오텍으로부터 공급받아 실험에 사용하였으며 그 제조 방법은 다음과 같다. 살균한 전유에 10% Leuconostoc mesenteroides, Lactbacillus kefiri, Kluyveromyces maxianus로 구성된 캐피어그레인을 첨가하여 25C에서 20시간 정치 배양하여 캐피어 발효유를 제조하였다.
5N PCA 에 분산시키고 100C에서 20분 동안 incubation 후 다시 원심 분리하여 얻은 상층액에 PCA와 diphenylamine 발색제를 가한 다음 냉암소에서 12시간 overnight하여 600 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 98 “g/ ml의 DNA 표준용액 (SIGMA, USA)을 사용하였다.
데이터처리
0을 이용하여 통계처리하였고, 실험결과는 평균치 士 표준편차로 표시하였다. 네 군간의 평균값의 차이를 검증하기 위하여 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA)을 한 후 Duncan’s multiple range test로 변인간의 차이를 검증하였다. 모든 통계적인 유의성은 a = 0.
대장염 유도 후 희생하여 소장 단백질 및 DNA 함량, 혈장 및 결장의 조직검사와 결장조직에서 TBARS와 MPO 활성, 혈장 백혈구에서의 DNA 손상 정도를 측정하였다. 실험 자료는 Windows용 SPSS package program version12.0 을 이용하여 통계 처리하였고, 네 군간의 평균값의 차이를 검증하기 위하여 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA) 을 한 후 Duncan's multiple range test로 변인간의 차이를 검증하였다. DSS 투여군 들에서 변 수분함량이 증가하고 음용수 섭취량이 증가하는 경향과 함께 결장의 조직검사 결과 DSS 투여군에서는 염증과 부종 증상을 관찰할 수 있었으며 식이무게의 3% 캐피어 원말 투여군에서는 재생성 변화를 볼 수 있었다.
실험 자료는 Windows용 SPSS package program version12.0을 이용하여 통계처리하였고, 실험결과는 평균치 士 표준편차로 표시하였다. 네 군간의 평균값의 차이를 검증하기 위하여 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA)을 한 후 Duncan’s multiple range test로 변인간의 차이를 검증하였다.
이론/모형
결장의 MPO측정은 Bradley27)의 방법을 이용하여 측정하였다. 즉, 결장조직에 0.
소장 점막의 DNA 함량은 Giles와 Meyer30) 등에 의하여 보완된 Burton31)의 방법에 따라 측정하였다. 조직에 0.
소장 점막의 단백질 함량은 Bradford 법29)에 의하여 제조된 Bio-Rad 사의 단백질 측정용 kit 시약을 사용하여 측정하였다. 0.
지질과산화는 Ohkawa28)의 방법을 이용하여 혈장과 결장조직 내 생성된 malondialdehyde (MDA)의 수준을 thiobarbituric acid reactive substances로 측정하였다. 결장의 지질과산화 측정을 위해서 결장조직의 무게를 측정한 후 1.
혈액 백혈구의 DNA fragmentation을 측정하기 위하여선행연구32)에서 기술한 방법대로 alkaline comet assay를 실시하였다. 세포핵의 image는 Komet 5.
성능/효과
만성 UC 증상과 유사한 표현형 (phenotype)으로17) crypt 단축, crypt 탈락의 진행, 점막 염증과 상피의 미란 (erosion)같은 조직학적 변화를 일으킬 수 있다.1) 또한 대장 상피세포에 손상을 주어 주로 좌측 대장에서 궤양과 대장 길이의 축소 등이 관찰되었으며 장기 투여시 발암단계의 초기변화인 aberrant crypt foci (ACF)가 관찰되면서 선암이 유발되기도 하고 임상적 증상으로 설사와 혈변이 나타나기도 한다.2) 이러한 DSS 유도 모델은 식수에 DSS를 섞어 투여할때 투여 용량에 따라 일정 정도의 염증이 유발되는 비교적 간단하고 재현성이 높은 방법이기 때문에 대장염 조절을 위한 새로운 합성 화합물의 효능평가에 많이 사용되는 가장 오래된 실험모델 중 하나이다.
58-61) DSS는 염증반응을 통하여 활성산소를 생성하고62) 세포의 DNA에 산화적 손상을 초래한다. 47, 56) 반면, 녹차의 폴리페놀, dehydroepiandrosterone 등 항산화물질은 대장염의 증세의 악화를 완화시키는데 효과적이라는 것이 확인되었다. 본 연구 결과 정상 대조군에 비하여 DSS를 투여한 흰쥐의 결장점막 조직내 TBARS 가 유의하게 높아졌으나 캐피어를 섭취시킴으로서 DSS 투여 후에도 TBARS의 수준이 낮게 유지되었다.
유의적인 차이는 아니었다. DC 군의 tail length는 N 군에 비하여 26% 높아 증가하는 경향을 보였으며 DC 군에 비하여 캐피어를 섭취시킨 군 (DK-1.5군, DK-3.0군) 에서 유의적으로 감소하였다 (p < 0.05). Tail moment 역시 유의적인 차이는 아니었으나 DC 군이 다른 군들에 비하여 높은 경향을 보여주었고 N 군과 DK 군들은 같은 수준에 있었다 (Table 6).
0 을 이용하여 통계 처리하였고, 네 군간의 평균값의 차이를 검증하기 위하여 일원배치 분산분석 (one-way ANOVA) 을 한 후 Duncan's multiple range test로 변인간의 차이를 검증하였다. DSS 투여군 들에서 변 수분함량이 증가하고 음용수 섭취량이 증가하는 경향과 함께 결장의 조직검사 결과 DSS 투여군에서는 염증과 부종 증상을 관찰할 수 있었으며 식이무게의 3% 캐피어 원말 투여군에서는 재생성 변화를 볼 수 있었다. DSS를 투여받은 군들의 소장 점막 단백질 함량은 감소하는 경향을 보였으며 캐피어 3.
0% 식이섭취한 군들에서는 증가하는 경향을 보였으나 DNA 함량에서는 차이를 볼 수 없었다. DSS 투여군에서는 결장조직의 TBARS 값이 유의적으로 증가하였으며 캐피어 투여군에서는 감소하였으나 캐피어 투여 용량에 따른 차이는 보이지 않았다. 혈장 TBARS와 결장조직의 MPO 활성은 군 간에 유의한 차이가 없었다.
혈장 TBARS와 결장조직의 MPO 활성은 군 간에 유의한 차이가 없었다. DSS 투여군에서는 혈액 백혈구 DNA의 tail length가 유의하게 증가하였으며 캐 피어 투여군에서는 감소하였다. 따라서 약 4주간 캐피어 원말의 투여는 2%의 DSS로 경미한 대장염을 유도한 흰쥐에서 결장 조직의 산화적 스트레스에 대한 저항력을 증가시켜 대장 점막을 보호할 수 있는 기능이 있음을 확인할 수 있었다.
DSS 투여군 들에서 변 수분함량이 증가하고 음용수 섭취량이 증가하는 경향과 함께 결장의 조직검사 결과 DSS 투여군에서는 염증과 부종 증상을 관찰할 수 있었으며 식이무게의 3% 캐피어 원말 투여군에서는 재생성 변화를 볼 수 있었다. DSS를 투여받은 군들의 소장 점막 단백질 함량은 감소하는 경향을 보였으며 캐피어 3.0% 식이섭취한 군들에서는 증가하는 경향을 보였으나 DNA 함량에서는 차이를 볼 수 없었다. DSS 투여군에서는 결장조직의 TBARS 값이 유의적으로 증가하였으며 캐피어 투여군에서는 감소하였으나 캐피어 투여 용량에 따른 차이는 보이지 않았다.
이러한 결과는 lactoferrin이 DSS를 투여한 대장의 점막 손상을 감소시키는 예방적 인자로 작용하고 호중구의 축적을 저해할 수 있는 인자임을 시사한다. 그러나 이러한 연구 결과들과는 달리 본연구에서는 DSS 투여 후나 캐피어 투여 군에서 통계학상 유의한 MPO 활성의 차이가 보이지 않았고 정상대조군에 비하여 DSS를 투여한 군에서 증가하는 경향만을 보여주었는데 이는 개체간의 차이가 큰데서 비롯되는 결과로 볼 수 있다. 궤양성 대장염 모델의 동물에서 지질과산화는 조직 손상을 악화시키기 때문에 malondialdehyde (MDA)는 대장염 실험 모델에서 염증반응과 관련된 지표로 평가된다.
DSS 투여군에서는 혈액 백혈구 DNA의 tail length가 유의하게 증가하였으며 캐 피어 투여군에서는 감소하였다. 따라서 약 4주간 캐피어 원말의 투여는 2%의 DSS로 경미한 대장염을 유도한 흰쥐에서 결장 조직의 산화적 스트레스에 대한 저항력을 증가시켜 대장 점막을 보호할 수 있는 기능이 있음을 확인할 수 있었다.
47, 56) 반면, 녹차의 폴리페놀, dehydroepiandrosterone 등 항산화물질은 대장염의 증세의 악화를 완화시키는데 효과적이라는 것이 확인되었다. 본 연구 결과 정상 대조군에 비하여 DSS를 투여한 흰쥐의 결장점막 조직내 TBARS 가 유의하게 높아졌으나 캐피어를 섭취시킴으로서 DSS 투여 후에도 TBARS의 수준이 낮게 유지되었다. DSS 투여로 인한 TBARS 수준의 증가는 8% DSS로 대장염을 유도한 동물의 MDA 수준이 정상 대조군에 비하여 높았다고 보고한 Naito 등56)의 연구 결과나 만성 대장염 흰쥐 모델에서 결장내 MDA 수준이 증가되고 acetic acid로 대장염 유도 시 높은 MDA 수준을 나타낸 Girgin 등63, 64)의 연구 결과에서도 볼 수 있다.
또한 Tsutomu 등66)은손상된 세포에 캐피어 액상 추출물을 투여함으로써 세포 내 활성산소종의 소거, 형태학적 변화 억제 등의 효과를 보여캐피어가 손상된 세포 내 DNA를 회복시킬 수 있음을 제시하였다. 본 연구에서 혈장 백혈구의 DNA fragmen-tation 를 살펴본 결과, DSS 단독투여군에서는 DNA 손상이 증가하였으며 캐피어 원말 투여군에서는 정상대조군 수준으로 감소하여 위의 연구결과들과 유사한 결과를 도출하였다. 따라서 본 연구에서 사용한 캐피어 원말이 DSS로 유도된 염증을 통한 산화적 스트레스에 대응하여 DNA 손상을 방어하는데 기여했다고 생각할 수 있으며 이 기전을 좀 더 명확하게 규명하기 위해서는 캐피어 원말의 항산화 효능에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.
소장 점막의 단백질 함량은 회장에서 정상대조군에 비하여 DSS투여 대조군 (DC군)에서 감소하는 경향을 보였으며 DK-3.0군에서는 증가하는 경향을 보여주었으나 통계적으로 유의한 차이는 아니었다. DNA 함량은 처리군 간에 유의한 차이를 보이지 않았다 (Table 4).
염증모델에서 지질과산화 지표인 TBARS (thiobarbituric acid reactive substances)는 혈장에서는 모든 군 간에 유의적인 차이를 보이지 않았으나 염증 유발 부위인 결장에서는 정상대조군에 비하여 DC군이 유의적으로 높았다. 캐피어를 섭취시킨 군들의 결장조직에서는 유의적으로 감소하여 (p < 0.
따라서 보다 경한 대장염증세를 유도하기 위하여 2%의 DSS를 5일간 투여하였으며 그 결과 분변에는 육안으로 보아 분별이 가능한 혈변이나 점액성 물질에 의한 변화가 보이지는 않았으나 변의 수분 함량이 많아지고 동물의 수분섭취량이 증가하는 경향 등 경한 설사 증세가 발생하고 있었으므로 본 연구의 실험동물 모델로 선택하였다. 이후 실험 종료시 실시한 조직병리학적 관찰을 통하여 이러한 사실이 확인되었는데 대조군에서는 염증과 관련된 어떠한 소견도 보이지 않았으나 2% DSS 유도군 들에서는 점막 및 점막하층에 경미한 부종과 염증소견이 보였으므로 2% DSS의 5일간 투여로 인하여 염증반응이 유도되었음을 확인할 수 있었다. Kefir 투여군의 경우 여전히 부종과 염증, 미란의 소견이 보이고있으나 부분적으로 erosion에 따른 재생성 변화가 관찰되어 DC 군에 비하여 장 보호 효과를 예측할 수 있었다.
조직 검사한 결과는 다음과 같다. 정상대조군의 결장조직에는 어떠한 부종이나, 염증 증세를 보이지 않았으나 2% DSS로 대장염을 유도한 군에서는 점막층 (muco-sa) 과 점막하층 (submucosa)에서 경미한 부종 (edema) 현상이 관찰되었고 고유층 (lamina propria)과 점막 하층에서 심한 염증 (Fig. 1B-D)을 관찰할 수 있었다. 캐피어 투여군에서는 점막하층에서 여전히 부종과 염증반응 (Fig.
DSS 투여군에서는 결장조직의 TBARS 값이 유의적으로 증가하였으며 캐피어 투여군에서는 감소하였으나 캐피어 투여 용량에 따른 차이는 보이지 않았다. 혈장 TBARS와 결장조직의 MPO 활성은 군 간에 유의한 차이가 없었다. DSS 투여군에서는 혈액 백혈구 DNA의 tail length가 유의하게 증가하였으며 캐 피어 투여군에서는 감소하였다.
혈장 백혈구의 DNA fragmentation 정도를 관찰한 결과 tail-DNA함량 (%)은 DC군이 N군에 비하여 증가하는 경향을 보였으며 캐피어 섭취군에서는 감소하는 경향을 보였으나 유의적인 차이는 아니었다. DC 군의 tail length는 N 군에 비하여 26% 높아 증가하는 경향을 보였으며 DC 군에 비하여 캐피어를 섭취시킨 군 (DK-1.
후속연구
43-45) 그러나 Doron 등은 미생물들의 작용기전은 모두 다르기 때문에 모든 프로바이오틱스가 동일한 작용기전으로 대장 염증이나 설사증세를 개선하는 것이라고 볼 수 없다고 하였다.46) 본 연구에 사용되었던 캐 피어 원말은 유산균과 효모, 그리고 발효시 생산되는 다당류와 영양소의 혼합체로서 일반 유산균에 비하여 더 다양한 생리활성을 기대할 수 있다.
fermentum의 장 보호효과를 규명하고 이 방어기전은 결장내 glutathione의 수준 유지, proinflammatory cytokine 생성 감소와 단쇄지방산의 증가 같은 다양한 항산화 기전에 의한 것이라고 하였다.67) 따라서캐피어 원말의 장 보호효과 기전을 설명하기 위해서는 장내 단쇄지방산의 변화, 염증 반응 조절, 점막 barrier 안정성, 결장내 미생물 균주의 변화 등과 같은 다양한 잠재적 요인에 대한 연구도 필요할 것으로 사료된다.
본 연구에서 혈장 백혈구의 DNA fragmen-tation 를 살펴본 결과, DSS 단독투여군에서는 DNA 손상이 증가하였으며 캐피어 원말 투여군에서는 정상대조군 수준으로 감소하여 위의 연구결과들과 유사한 결과를 도출하였다. 따라서 본 연구에서 사용한 캐피어 원말이 DSS로 유도된 염증을 통한 산화적 스트레스에 대응하여 DNA 손상을 방어하는데 기여했다고 생각할 수 있으며 이 기전을 좀 더 명확하게 규명하기 위해서는 캐피어 원말의 항산화 효능에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다. TNBS로 대장염을 유도한 다른 연구에서 L.
단 이러한 결과가 통계학상 유의하지 않게 나타난 이유는 DSS 투여량이 적어 비교적 경미한 대장염이 유도된 결과로 볼 수 있다. 캐피어 섭취는 역시 통계학상 유의한 결과는 아니었으나 DC군에 비하여 DK -3.0군에서 정상대조군에 가까운 결과를 보여주어 투여 용량이나 기간을 조정한다면 좀 더 유의한 결과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
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