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문제 정의
- 이에 저자는 威靈仙 추출물의 STZ 유발 당뇨 모델에 대한 방어효과를 조사하였으며/ 그 기전 조사를 위하여 heme oxygenase-1 의 발현을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Paraffin으로 block을 만든 후 4 μm 두께로 잘라 section을 만들었다, Deparaffinization 과정을 거친 후에 Protein Block Serum-Free (DAKO)로 실온에서 10 분간 반응시켜 비특이적 반응을 제거하였다. 2 시간 동안 실온에서 인슐린에 대한 항체 (Santa Cruz Biochemicals) 반응시켜 면역염색을 실시하였다.
- 대조군은 citrate buffer만 투여하였다. 5일째 마우스를 희생시키고, 혈액을 채취하여 1 mg/ml EDTA가 들어있는 tube에 보관하여 인슐린과 glucose 농도를 측정하였다. Glucose 농도는 glucose oxidase 방법 (Sigma)을 통해 측정하였고/ 인슐린 농도는 radioimmunoassay kit (Linco Research)# 통해 측정하였다.
- The effect of Radix Clematidis extract(RCE) on blood glucose and insulin levels. ICR mice were injected with RCE via oral administration in a daily dose of 250 ㎎/㎏/day, and then injected with STZ (50 ㎎/㎏) via i.p. for 5 days. After 16 h fasting, levels of fasting glucose and insulin were determined as described in Materials and Methods, the results of samples are expressed as the mean ± the SEM.
- STZ 유발 당뇨쥐 모델을 사용하였다. ICR mice에 威靈仙 추출물(250 ㎎/㎏/day)을 3 일간 복강내로 투여한 후 STZ을 50 ㎎/㎏ 농도로 5일간 복강내로 주사하였다.
- 1 M PBS로 세척하였다. Paraffin으로 block을 만든 후 4 μm 두께로 잘라 section을 만들었다, Deparaffinization 과정을 거친 후에 Protein Block Serum-Free (DAKO)로 실온에서 10 분간 반응시켜 비특이적 반응을 제거하였다. 2 시간 동안 실온에서 인슐린에 대한 항체 (Santa Cruz Biochemicals) 반응시켜 면역염색을 실시하였다.
- 威靈仙 추출물의 항당뇨 효과 기전을 조사하기 위하여 ICR mice에 威靈仙 추출물(250 ㎎/㎏/day)을 3 일간 복강내로 투여한 후 STZ을 50 ㎎/㎏ 농도로 5일간 복강내로 주사하였다. 모든 실험이 끝난 후 췌장 조직을 획득하여 Western blotting방법을 이용하여 조사하였다.
- 0) 에 녹여 복강내로 주사하였다. 威靈仙의 효과를 관찰하기 위해 마우스에게 STZ을 주사하기 전에 威靈仙 추출물을 3일간 250 ㎎/㎏/day씩 구강내로 주사하였다. 마우스는 다음과 같이 3군으로 나누어 실험을 했다.
- 다음으로 췌장 조직을 떼어 islets의 파괴 정도를 H&E 염색 (Fig. 2a-2c) 및 인슐린에 대한 inimunohistochemish'y(Fig. 2d-2f)를 이용해 조사하였다. STZ에 의해 당뇨병 유발 마우스의 경우 lymphocyte의 침윤과 islets의 퇴행성 변화를 롼찰할 수 있었다 (Fig.
- 5-6주령의 암컷 ICR mice를 사용하였다. 당뇨병을 유발하기 위해 하루에 한번씩/ 5일간 STZ(50 ㎎/㎏ body weight; 0.2 ml)을 sodium citrate buffer (pH 4.0) 에 녹여 복강내로 주사하였다. 威靈仙의 효과를 관찰하기 위해 마우스에게 STZ을 주사하기 전에 威靈仙 추출물을 3일간 250 ㎎/㎏/day씩 구강내로 주사하였다.
- 처음 STZ을 처리 한 날을 day 1로 정의 하였다. 대조군은 citrate buffer만 투여하였다. 5일째 마우스를 희생시키고, 혈액을 채취하여 1 mg/ml EDTA가 들어있는 tube에 보관하여 인슐린과 glucose 농도를 측정하였다.
- Heme oxygenase-1에 대한 일차항체(primary antibody)는 TBS-T에 1:1,000으로 희석하여 nitrocellulose membrane과 상온에서 24시간 반응시키고 TBS-T로 10분 3번 세척 한 후/ 이 차항체 (secondary antibody) 인 horseradish peroxidase- conjugated I#G를 반응시켰다. 발현된 단백질양은 Chemi-doc image 분석기(Bio-Rad, UK)를 이용하여 확인하였다.
- 이에 威靈仙의 항당뇨 효과 기전을 조사하기 위하여 각군의 췌 장 조직 또는 islet을 이용하여 HO-1 발현을 조사하였다. Fig.
- 적출한 췌장을 조직파쇄용액과 4℃에서 30분 반응시킨 후, 30 ㎍의 단백질을 두 배의 sample buffer(5 mM EDTA, 4% sodium dodesyl sulfate (SDS), 20% glycerol, 200 mM Tris, pH 6.8/ 0.06% bromophenol blue)와 혼합 후/ 100℃ 에서 3분 가열하여 단백질 변성을 유도하고 10% gel에서 sodium dodesyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 시행하였다.
대상 데이터
- 5-6주령의 암컷 ICR mice를 사용하였다. 당뇨병을 유발하기 위해 하루에 한번씩/ 5일간 STZ(50 ㎎/㎏ body weight; 0.
- 본 연구에 사용한 威靈仙은 전북 익산시 신용동 원광대학교익 산한방병원에서 구입하여 원광대학교 한의과대학 본초학교실에 검증 받은 후 사용하였다. 실험에 이용한 동물은 암컷 ICR 생쥐(Orientobio Inc.
- 검증 받은 후 사용하였다. 실험에 이용한 동물은 암컷 ICR 생쥐(Orientobio Inc. 성남, 경기도)로 4-5주령의 21마리를 구입하여 실험에 이용하기 전 7일간 무균상태의 조건에서 적응시킨 후 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 mean±S.E.M으로 표시하였으며 유의성의 검정은 One-Way Anova test (Microcal Origin; version6.0; Microsoft; USA)에 의하였으며 p< 0.05인 것만 유의한 것으로 하였다.
이론/모형
- 5일째 마우스를 희생시키고, 혈액을 채취하여 1 mg/ml EDTA가 들어있는 tube에 보관하여 인슐린과 glucose 농도를 측정하였다. Glucose 농도는 glucose oxidase 방법 (Sigma)을 통해 측정하였고/ 인슐린 농도는 radioimmunoassay kit (Linco Research)# 통해 측정하였다.
- 威靈仙 추출물의 항당뇨 효과를 in vivo 실험에서 확인하고자 STZ 유발 당뇨쥐 모델을 사용하였다. ICR mice에 威靈仙 추출물(250 ㎎/㎏/day)을 3 일간 복강내로 투여한 후 STZ을 50 ㎎/㎏ 농도로 5일간 복강내로 주사하였다.
- 단백질 정량은 bovine serum albumin을 기준치로 이용한 Bradford의 방법14)에 의거하여 정량 하였다.
- 1). 또한 췌장 β 세포의 특이적인 파괴와 이로 인한 인슐린의 감소를 면역조직화학염색법에 의하여 확인하였다(Fig. 2). 그러나 威靈仙 추출물을 투여한 군의 혈중 glucose, 인슐린 농도는 STZ를 투여에 의해 나타난 당뇨 현상을 유의하게 억제하였다.
- 면역염색을 위해' DAKO Envision system (DAKO)을 이용하였다. 췌장을 떼어서 즉시 고정액 (10% formalin solution in 0.
- 모든 실험이 끝난 후 췌장 조직을 획득하여 Western blotting방법을 이용하여 조사하였다. 그 결과 STZ를 투여한 군의 HO-1 단백질의 발현은 대조군에 비하여 유의하게 감소하였으나, 威靈仙 추출물을 투여한 군은 STZ에 의한 HO-1 발현의 감소를 유의하게 억제하였다(Fig.
성능/효과
- 모든 실험이 끝난 후 췌장 조직을 획득하여 Western blotting방법을 이용하여 조사하였다. 그 결과 STZ를 투여한 군의 HO-1 단백질의 발현은 대조군에 비하여 유의하게 감소하였으나, 威靈仙 추출물을 투여한 군은 STZ에 의한 HO-1 발현의 감소를 유의하게 억제하였다(Fig. 3).
- 2). 그러나 威靈仙 추출물을 투여한 군의 혈중 glucose, 인슐린 농도는 STZ를 투여에 의해 나타난 당뇨 현상을 유의하게 억제하였다. 이러한 결과는 威靈仙 추출물이 제1형 당뇨병의 치료제 또는 예방제로서 개발될 수 있는 실험적 근거를 시사 한다.
- 2b). 또한 immunoliistochemistry 결과의 경우에도 insulin-immunoreactive P 세포의 수가 현저하게 감소하였다(Fig. 2e). 하지만 威靈仙 추출물을 전처리 한 군의 경우 STZ 유발 islets의 파괴를 막을 수 있었고(Fig.
- 본 연구에서 威靈仙 추출물은 STZ에 의한 당뇨병 유발을 유의하게 억제하였다. 실험적 보고에 의하면 威靈仙 추출물은 주로 관절염 모델에서 항염증 효과가 있다고 알려져 있다11-13).
- 이러한 STZ에 의한 췌장 E세포의 파괴는 인슐린의 분비를 감소시키고, 인슐린 분비의 감소는 혈중 glucose 농도를 높게 유지시켜 다양한 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있다. 실험에서 STZ를 투여한 군의 혈중 glucose 농도는 대조군에 비하여 유의한 증가를 나타냈으며 이런 효과는 인슐린 분비의 감소에 의한 것으로 나타났다(Fig. 1). 또한 췌장 β 세포의 특이적인 파괴와 이로 인한 인슐린의 감소를 면역조직화학염색법에 의하여 확인하였다(Fig.
후속연구
- 이상의 결과는 威靈仙을 이용하여 항당뇨 치료제 또는 예방제를 개발할 수 있는 실험적 근거를 제시한 것으로 사료되며, 앞으로 威靈仙의 항당뇨 효과에 대한 후속 연구가 필요하리라 생각된다.
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