선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
제안 방법
- 9) 본 실험에서는 위령선 추출물과 각 분획에 대한 약리작용을 평가하고자, 항염 활성을 측정하기 위하여 RAW 264.7 세포에 추출물과 각 분획을 LPS와 처리하여 NO 생성 억제 효과를 측정 하였고,10-15) 멜라닌 생성 억제 작용에 대해 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 α-MSH와 위령선 에탄올 추출물 및 각 용매분획을 처리하여 melanin을 정량하였으며,16-19) 각각의 Western blot assay와 RT-PCR법을 이용하여 protein과 mRNA 수준의 억제효과를 측정하였다.
- MTT 시험법을 이용한 세포 독성 측정 − B16F10 melanoma 세포를 48 well plate에 1.5×104 cells/ml 농도로 접종한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 하루 동안 안정화 시킨 후 시료를 농도별로 처리한 후 48시간 동안 배양하였다.
- Western blot 법에 의한 Tyrosinase 단백질의 측정 − B16F10 cell을 1×105 cells/ml로 분주한 후 24시간 후 α-MSH, 시료처리군으로 나눠 농도별로 처리하고, 48시간 동안 배양하였다.
- Western blot 법에 의한 Tyrosinase 단백질의 측정 − 위령선의 에탄올 추출물과 각 분획들이 멜라닌 생성과정에서 중요한 tyrosinase의 단백질 발현에 어떠한 영향을 나타내는지 알아보기 위해 α-MSH(0.4 µM)로 B16F10 melanoma 세포를 자극시킨 후 시료를 분획별(10 µg/ml)로 처리한 후 western blot assay를 이용하여 단백질 발현 양상을 측정하였고, tyrosinase 발현 억제효과가 우수한 dichloromethane 분획을 농도별로(2.5~10 µg/ml) 처리하였을 때 농도 의존적으로 억제하는 효과를 나타내었다 (Fig. 8).
- 양성 대조약물로는 ascorbic acid를 농도 별로 용시 조제하여 사용하였다. 각 시료의 항산화 활성을 비교 검토하기 위하여 EDA가 50%에 이르도록 하는 데 필요한 시료의 양(IC50)을 측정하였다.
- 그 후 각 well의 배지들을 제거 하고 MTT solution(0.5 mg/ml in PBS)을 첨가하고, 37oC에서 4 시간 동안 반응 시킨 후 MTT solution을 제거하고, 각 well에 400 µl의 dimethylsulfoxide(DMSO)를 첨가하여 1시간 동안 plate shaker로 흔들어 준 다음 microplate reader을 사용하여 대조파장을 650 nm로 하고 측정 파장을 570 nm로 하여 흡광도를 측정하였다.
- 멜라닌 생성 억제 작용의 측정 − 위령선의 에탄올 추출물과 각 분획의 5~15 µg/ml 시료농도에서의 멜라닌 생성 억제작용을 측정하였다.
- 배지를 제거 하고 0.4 µM α-MSH(alpha-melanocyte stimulated hormone)와 시료를 농도별로 처리하여 배지를 교체한 후 48시간 배양하였다.
- 세말한 위령선(4.2 kg)을 에탄올로 4시간씩 5회 가온 추출 후 온시 여과하고 여액을 감압 농축하여 에탄올 추출물(254 g, 수득률: 6.04%)을 얻었다. 이 에탄올 추출물을 물 가용부로 나눠 각각을 헥산 분획, 디클로로메탄 분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획, 물 분획으로 분획하였다.
- 각 시료를 농도별로 조제하여 시험관 진탕기로 10초간 진탕한 후 37℃에서 30분 동안 반응시키고 spectrophotometer를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 항산화 활성을 측정하기 위하여 전자 공여능(electron donating ability, EDA%)에 의한 환원력으로 표시하였다. 양성 대조약물로는 ascorbic acid를 농도 별로 용시 조제하여 사용하였다.
- -20oC에서 1시간 이상 보관하고 원심분리 후 미색침전으로 얻어진 RNA에 superscript transcriptase II와 hexamer를 가한 후 42℃에서 1시간 반응시켜 cDNA로 전환하였다. 얻어진 cDNA 일정량과 primer, polymerase를 가한 후 PCR thermal cycler에서 DNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA의 특정 band를 1% agarose gel에 전개시켜 DNA image reader로 확인함으로써 mRNA의 발현 정도를 관찰하였다 (Table I).
- 이 시료를 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동 한 후, PVDF membrane에 transfer하고 i-NOS, COX-2, β-actin 항체를 결합시킨 후, horseradish peroxidase 결합성의 2차 항체를 결합시킨 후 ECL kit를 이용하여 LAS-3000으로 측정하였다.
- 04%)을 얻었다. 이 에탄올 추출물을 물 가용부로 나눠 각각을 헥산 분획, 디클로로메탄 분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획, 물 분획으로 분획하였다. 감압 농축하여 가용부 헥산 분획 22.
- 얻어진 cDNA 일정량과 primer, polymerase를 가한 후 PCR thermal cycler에서 DNA를 증폭하였다. 증폭된 DNA의 특정 band를 1% agarose gel에 전개시켜 DNA image reader로 확인함으로써 mRNA의 발현 정도를 관찰하였다 (Table I).
대상 데이터
- 이 에탄올 추출물을 물 가용부로 나눠 각각을 헥산 분획, 디클로로메탄 분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획, 물 분획으로 분획하였다. 감압 농축하여 가용부 헥산 분획 22.25 g(수득률: 11.13%), 디클로로메탄 분획 12.46 g(수득률: 6.23%), 에틸아세테이트 분획 28.59 g(수득률: 14.30%), 부탄올 분획 58.88 g(수득률: 29.44%), 물 분획 66.66 g(수득률: 33.33%)을 얻어 시료로 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 위령선은 경동시장내 동경종합상사에서 구입하여 사용하였으며 확증 표본은 본 대학 생약표본실에 보관하였다.
- 세포주의 배양 − Mouse macrophage RAW 264.7 세포는 한국 세포주 은행에서 분양받아 10% FBS(fetal bovine serum), penicillin G(100 IU/ml), streptomycin(100 µg/ml), amphotericin(0.25 µg/ml)을 포함한 DMEM 배지를 이용하여 온도 37℃와 5%의 CO2를 유지하면서 배양기에서 배양하였다.
- 시료의 항산화 활성을 측정하기 위하여 전자 공여능(electron donating ability, EDA%)에 의한 환원력으로 표시하였다. 양성 대조약물로는 ascorbic acid를 농도 별로 용시 조제하여 사용하였다. 각 시료의 항산화 활성을 비교 검토하기 위하여 EDA가 50%에 이르도록 하는 데 필요한 시료의 양(IC50)을 측정하였다.
데이터처리
- 실험결과에서 얻은 모든 값은 평균±표준편차로 나타내었다.
- 통계적 유의적 차이의 정도는 Student's t-test를 사용하여 p<0.01, p<0.001인 값에 대해 유의적인 것으로 처리하였다.
이론/모형
- MTT 시험법을 이용한 세포 독성 측정 − RAW 264.7 세포에 대한 세포독성 및 실험시 처리농도를 결정하기 위해 MTT 시험법을 실시하였다.
- 단백질 정량은 Bradford 법으로 하였으며, 20 µg의 단백질을 이용하여 10% SDS-PAGE 이용하여 전기영동을 한 후, PVDF membrane에 transfer하고, Tyrosinase(SantaCruz), β-actin(Cell Signaling) 항체를 결합시킨 후, 2차 항체를 2시간 동안 반응 시키고, ECL kit를 이용하여 LAS-3000으로 측정하였다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.