[국내논문]탄소원 조성 조절을 이용한 Azotobacter indicus var. myxogenes L3로부터 PS-7 생산 최적화 Optimization of PS-7 Production Process by Azotobacter indicus var. myxogenes L3 Using the Control of Carbon Source Composition원문보기
Flask 배양으로 기본 유청 배지MSM를 배지로 하고 첨가한 각 탄소원의 PS-7생산 효과를 살펴보면 fructose, glucose와 sucrose의 첨가가 PS-7의 생산을 다른 당에 비해 향상시킴을 알 수 있었다. 그러나 galactose의 경우 첨가량이 증가될수록 오히려 PS-7의 생산량이 감소되는 경향을 나타내었다. 여러 가지 배양 변수를 고려한 결과 glucose씨 첨가가 최적임을 확인하였다. 5L 발효조에 의한 PS-7 생산의 경우 유청과 glucose를 함께 첨가한 것이 유청과 glucose만을 배지의 탄소원으로 사용했을 때 보다 PS-7의 생산량이 월등히 향상되는 것을 알 수 있었으며, 유청 1%와 glucose 1%배지의 경우 PS-7생산량이 3 g/L를 생산하였다. 유청 1%와 glucose 2%배지의 경우 4 g/L의 PS-7의 생산하였으나 잔당량이 $30{\sim}40%$가 남아 생산효율(yield)면에서는 떨어짐을 알 수 있었다. 배지내 Glucose농도 변화에 따른 점성(viscosity)의 변화는 PS-7의 생산량의 변화와 비슷한 패턴을 보이지만 분자량 증대에 따른 점도의 증가는 훨씬 높게 나타났다. 본 실험의 결과 일반적으로 C/N ratio가 다당류인 PS-7생산에 중요한 역할을 하고 있으며, 유청 1%+glucose 1% 배지를 사용할 때 높은 점도와 수율의 PS-7을 얻을 수 있는 최적 배지임을 알 수 있었다.
Flask 배양으로 기본 유청 배지MSM를 배지로 하고 첨가한 각 탄소원의 PS-7생산 효과를 살펴보면 fructose, glucose와 sucrose의 첨가가 PS-7의 생산을 다른 당에 비해 향상시킴을 알 수 있었다. 그러나 galactose의 경우 첨가량이 증가될수록 오히려 PS-7의 생산량이 감소되는 경향을 나타내었다. 여러 가지 배양 변수를 고려한 결과 glucose씨 첨가가 최적임을 확인하였다. 5L 발효조에 의한 PS-7 생산의 경우 유청과 glucose를 함께 첨가한 것이 유청과 glucose만을 배지의 탄소원으로 사용했을 때 보다 PS-7의 생산량이 월등히 향상되는 것을 알 수 있었으며, 유청 1%와 glucose 1%배지의 경우 PS-7생산량이 3 g/L를 생산하였다. 유청 1%와 glucose 2%배지의 경우 4 g/L의 PS-7의 생산하였으나 잔당량이 $30{\sim}40%$가 남아 생산효율(yield)면에서는 떨어짐을 알 수 있었다. 배지내 Glucose농도 변화에 따른 점성(viscosity)의 변화는 PS-7의 생산량의 변화와 비슷한 패턴을 보이지만 분자량 증대에 따른 점도의 증가는 훨씬 높게 나타났다. 본 실험의 결과 일반적으로 C/N ratio가 다당류인 PS-7생산에 중요한 역할을 하고 있으며, 유청 1%+glucose 1% 배지를 사용할 때 높은 점도와 수율의 PS-7을 얻을 수 있는 최적 배지임을 알 수 있었다.
The proteins in whey are separated and used as food additives. The remains (mainly lactose) are spray-dried to produce sweet whey powder, which is widely used as an additive for animal feed. Sweet whey powder is also used as a carbon source for the production of valuable products such as polysacchar...
The proteins in whey are separated and used as food additives. The remains (mainly lactose) are spray-dried to produce sweet whey powder, which is widely used as an additive for animal feed. Sweet whey powder is also used as a carbon source for the production of valuable products such as polysaccharides. Glucose, fructose, galactose, and sucrose as asupplemental carbon source were evaluated for the production of PS-7 from Azotobacter indicus var. myxogenes L3 grown on whey based MSM media. Productions of PS-7 with 2% (w/v) fructose and sucrose were 2.05 and 2.31g/L, respectively. The highest production of PS-7 was 2.82g/L when 2% (w/v) glucose was used as the carbon source. Galactose showed low production of PS-7 among the carbon sources tested. The effects of various carbon sources addition to whey based MSM medium showed that glucose could be the best candidate for the enhancement of PS-7 production using whey based MSM medium. To evaluate the effect of glucose addition to whey based media on PS-7 production, fermentations with whey and glucose mixture (whey 1, 2, 3%; whey 1% + glucose 1%, whey 1% + glucose 2% and glucose 2%, w/v) were carried out. Significant enhancement of PS-7 production with addition of 1% (w/v) and 2% (w/v) glucose in 1% (w/v) whey media was observed. The PS-7 concentration of 2% glucose added whey lactose based medium was higher than that of 1% glucose addition, however, the product yield $Y_{p/s}$ was higher in 1% glucose added whey lactose based MSM medium. Therefore, the optimal condition for the PS-7 production from the Azotobacter indicus var.myxogenes L3, was 1% glucose addition to 1% whey lactose MSM medium.
The proteins in whey are separated and used as food additives. The remains (mainly lactose) are spray-dried to produce sweet whey powder, which is widely used as an additive for animal feed. Sweet whey powder is also used as a carbon source for the production of valuable products such as polysaccharides. Glucose, fructose, galactose, and sucrose as asupplemental carbon source were evaluated for the production of PS-7 from Azotobacter indicus var. myxogenes L3 grown on whey based MSM media. Productions of PS-7 with 2% (w/v) fructose and sucrose were 2.05 and 2.31g/L, respectively. The highest production of PS-7 was 2.82g/L when 2% (w/v) glucose was used as the carbon source. Galactose showed low production of PS-7 among the carbon sources tested. The effects of various carbon sources addition to whey based MSM medium showed that glucose could be the best candidate for the enhancement of PS-7 production using whey based MSM medium. To evaluate the effect of glucose addition to whey based media on PS-7 production, fermentations with whey and glucose mixture (whey 1, 2, 3%; whey 1% + glucose 1%, whey 1% + glucose 2% and glucose 2%, w/v) were carried out. Significant enhancement of PS-7 production with addition of 1% (w/v) and 2% (w/v) glucose in 1% (w/v) whey media was observed. The PS-7 concentration of 2% glucose added whey lactose based medium was higher than that of 1% glucose addition, however, the product yield $Y_{p/s}$ was higher in 1% glucose added whey lactose based MSM medium. Therefore, the optimal condition for the PS-7 production from the Azotobacter indicus var.myxogenes L3, was 1% glucose addition to 1% whey lactose MSM medium.
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문제 정의
myxogenes 의 변이주로서 유당 분해효소를 가지고 있는 것으로 확인되었고 이 균주는 유당이 포함된 유청을 기질로 사용했을 때 PS-7을 생산할 수 있다는 연구보고가 있다. [9], 그러므로 본 연구에서는 유청을 본 기질로 이용하였을 때 최대의 PS-7을 생산할 수 있는 당성분의 최적 조건을 결정하기 위하여 수행되었다.
제안 방법
Glucose, galactose, fructose 그리고 sucros를 유청 넙H 지 (whey lactose)에 첨가되는 탄소원으로 사용하였다, 총 20 g/ L의 탄소원 중 첨가된 탄소원은 0%(20 g/L whey lactoe), 25%(15 g/L whey lactose, 5 g/L첨가탄소원), 50%(10 g/L whey lactose, 10 g/L 첨가탄소원), 75%(5 g/L whey lactose, 15 g/L첨가탄소원) 그리고 100%(20g/L첨가탄소원) 로 유청 배지에 첨가하였다. 탄소원은 증류수에 용해하여 따로 멸균하여 배지에 첨가하였다.
탄소원은 증류수에 용해하여 따로 멸균하여 배지에 첨가하였다. 배양은 진탕 배양기에서 200 rpm으로 30℃, 24시간 동안 배양한 seed culture를 250 mL baffled Erlenmeyer flask에 50 mL각 배지에 5%의 양으로 접종하여 같은 조건으로 72시간 동안 배양하였으며 건조 균체 중량(DCW, Dry Cell Weight, g dcw/L), 점도 (Viscosity, cP), PS-7의 생산량(g/L)을 측정하였다.
Flask 배양으로는 PS-7 생산의 경우로 기본 유청 배지 MSM 배지에 glucose를 첨가하는 것이 최적이라는 것을 확인하였다. 이를 기초로 기본 유청 배지에 fucose 첨가량을 조절하여 5 L 발효조로 PS-7을 생산하였다.
myxogenes L3는 기본 유청 배지 MSM(mineral salts medium) agar plate에 배 양하였다. 기본 유청 배지MSM 배지는 5.0 g/L KH2PO4, 0.1 g/L MgSO4 - 7H2O, 7.5 mM NH4NO3, 0.4 g/L Bacto yeast extract(Difco Lab., Detroit, USA), 0.2 g/L Bacto peptone, 4 g/L glucose, 16 g/L lactose, 1 mL trace minerals solution (1% FeSO4-7H2O, 0.1% MnSO4-5H2O, 0.25% ZnSO4-6H2O, 0.2% CuSO4 -6H2O, 0.25% Na2MoO4 - H2O)^ 조성을 가지며 pH 6.8로 조절하기 위하여 2 M NaOH를 멸균과정 전 배지에 첨가하였다. Seed culture는 3 g/L Bacto yeast extract, 10 g/L lactose, 5 g/L Bacto peptone 이 포함된 yeast lactose(YL) 배지로 배양하였다.
대상 데이터
0 vvm으로 72시간 동안 배양을 실시하였다. 유청 배지는 Dlamini와 Peiris 의 방법 [1]을 이용하여 20g/L 유청에 5.0 g/L KH2PO4, 0.1 g/L MgSO4-7H2O, 1 ml의 trace mineral sohitiorr을 첨가하여 사용하였다.
성능/효과
5 L 발효조에 의한 PS-7 생산의 경우 유청과 glucose를 함께 첨가한 것이 유청과 glucose 만을 배지의 탄소원으로 사용했을 때 보다 PS-7의 생산량이 월등히 향상되는 것을 알 수 있었으며, 유청 1%와 glucose 1% 배지의 경우 PS-7 생산량이 3 g/L 를 생산하였다. 유청 1%와 glucose 2% 배지의 경우 4 g/L의 PS-7의 생산하였으나 잔당량이 30-40%가 남아 생산효율(yield)면에서는 떨어짐을 알 수 있었다.
본 실험의 결과 일반적으로 C/N ratio가 다당류인 PS-7생산에 중요한 역할을 하고 있으며, 유청 1%+glucose 1% 배지를 사용할 때 높은 점도와 수율의 PS-7을 얻을 수 있는 최적 배지임을 알 수 있었다.
이는 유청에 포함된 질소성분에 의해 C/N ratio가 낮아서 균체 성장이 촉진되므로 많은 양의 당성분이 균체 성장에 사용되는 결과로 볼 수 있다. 그래서 유청 배지를 배지로 하고 첨가한 각 탄소원의 PS-7생산 효과를 살펴보면 fructose, 이ucose와 sucrose의 첨가가 PS-7의 생산을 다른 당에 비해 향상시킴을 알 수 있었다(Fig. 2). 그러나 galactose의 경우 첨가량이 증가될수록 오히려 PS-7의 생산량이 감소되는 경향을 나타내었다.
그러나 galactose의 경우 첨가량이 증가될수록 오히려 PS-7의 생산량이 감소되는 경향을 나타내었다. 절대량의 비교에 있어서는 이ucose의 첨가가 fructose나 sucrose에 비해 PS-7 생산에 나은 효과를 보이고 있지는 않았으나 가격이나 미생물의 이용성을 고려할 때 glucose 첨가로 PS-7 생산이 가장 합리적인 것으로 판단된다. 이는 Wu[9]의 논문에서 Azotobacter indicus var.
myxogene~7\ glucose-generating sugars를 기질로 사용했을 때 PS-7 생산을 증가시킨다는 보고와도 일치한다. 비용적인 측면과 PS-7의 생산 경향을 비교해봤을 때 sucrose의 경우는 비용적 측면, fructose, galactose는 PS-7의 생산경향 측면으로 인해 glucose를 유청에 첨가할 탄소원으로 선택하는 것이 적절하다고 판단되었다.
3). Fructose의 경우 첨가량이 증가함에 따라 균체량이 줄어드는 것을 확인할 수 있으며, glucose의 경우는 균체량 변화가 많지 않은 결과를 보였다. Sucrose의 경우 50% 이상의 농도에서는 비례하여 균체량이 늘어나는 것을 관찰할 수 있었다.
galactose첨가의 경우는 점도의 변화가 거의 없다는 것을 알 수 있다. Flask 배양으로는 PS-7 생산의 경우로 기본 유청 배지 MSM 배지에 glucose를 첨가하는 것이 최적이라는 것을 확인하였다. 이를 기초로 기본 유청 배지에 fucose 첨가량을 조절하여 5 L 발효조로 PS-7을 생산하였다.
5에 나타내었다. 유청 1%, 2%, 3%, 유청 1%+glucose 1%, 2%, 그리고 glucose 2%를 배지로 PS- 7의 생산량을 살펴본 결과 유청과 glucose를 함께 첨가한 것이 유청이나 glucose 만을 배지의 탄소원으로 사용했을 때보다 PS-7의 생산량이 월등히 향상되는 것을 알 수 있었다. 유청 1%, 유청 2%, 유청 3%, glucose 2%를 탄소원으로 사용하였을 경우, 처음 40시간까지 PS-7의 농도가 증가하다가 이후 70시간까지는 PS-7의 농도의 변동이 없었다.
그러나 유청과 glucose를 혼합하여 탄소 원으로 사용한 경우 유청 1%와 glucose 1%를 배지로 사용한 경우 60, 000 cP를, 유청 1%와 fucose 2%일 경우에는 65,000 cP의 점성을 나타내었다. 이는 PS-7의 생산량이 많아질수록 점도가 증가한다는 것을 고려해 볼 때 당연한 결과이지만 또한 점성의 증가가 PS-7단위 g당 증가분 보다 높다는 것으로 보아 분자량의 증가도 함께 일어난다는 것을 알 수 있었다.
특히 유청 배지의 경우 PS-7 생산량이 적고 또한 점도도 낮음을 관찰하였는데 이는 flask 배양시와 동일한 결과를 보여 주었다. 이러한 유청 배지의 결과는 유청내에 포함된 질소성분이 균체 성장을 촉진하여 PS-7의 생산량을 감소시킨다는 것을 알 수 있었다. 즉 탄소/질소비 (C/N ratio)가 유청 배지에서 낮으므로 다당류인 PS-7생산량이 낮다는 것이다.
이와 같이 C/N ratio가 polysaccharide의 생산에 중요한 역할을 한다는 결과를 실험에서 보여주었다. 본 실험의 결과에서도 배지에서 적절한 C/ N ratio가 다당류 발효에서 중요한 변수임을 보여주었다.
Hask 배양으로 기본 유청 배지MSM를 배지로 하고 첨가한 각 탄소원의 PS-7생산 효과를 살펴보면 fructose, glucose 와 sucrose의 첨가가 PS-7의 생산을 다른 당에 비해 향상시킴을 알 수 있었다. 그러나 galactose의 경우 첨가량이 증가될수록 오히려 PS-7의 생산량이 감소되는 경향을 나타내었다.
그러나 galactose의 경우 첨가량이 증가될수록 오히려 PS-7의 생산량이 감소되는 경향을 나타내었다. 여러가지 배양 변수를 고려한 결과 glucose의 첨가가 최적임을 확인하였다.
Sucrose의 경우 50% 이상의 농도에서는 비례하여 균체량이 늘어나는 것을 관찰할 수 있었다. 전체적으로 볼 때 50-75% 사이에서 균체생산량이 제일 낮은 것으로 판단된다.
참고문헌 (9)
Dlamini, A. M. and P. S. Peiris. 1997. Production of high viscosity whey broths by lactose utilizing Xanthomonas campestris strain. Appl. Environ. Microbiol. 50: 1483-1485
Dubois, M., Ka. A. Gilles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers, and F. Smith. 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28: 350-356
Falk, C., P. E. Jansson, M. Rinaudo, A. Heyrad, G. Widmalm, and P. Hebbar: 1996. Structural studies of the exocellular polysaccharide from Sphingomonas aucimobilis strain I-886. Carbohydr. Res. 285: 69-79
Gulin, S., A. Kussak, P. E. Jansson, and G. Widmalm. 2001. Structural studies of S-7, another exocellular polysaccharide containing 2-deoxy-arbino-hexuronic acid. Carbohydr. Res. 311: 285-290
Jurgen, O. 2000. Respiratory protection of nitrogenase in Azotobacter species: is a widely held hypothesis unequivocally supported by experimental evidence. FEMS Microbiol. Rev. 24: 321-333
Lee, J. W., W. G. Yeomans, A. L. Allen, R. A. Gross, and D. L. Kaplan. 1997. Compositional consistency of a heteropolysaccharide- 7 produced by Beijerinckia indica. Biotechnol. Lett. 19: 803-807
Saier, M. H., G. M. Cook, J. Deutscher, I. T. Paulsen, J. Reizer, and J. J. Ye. 1996. Catabolite repression and inducer control in gram-positive bacteria. Microbiol. 142: 217-230
Wu, J. R., J. H. Son, K. M. Kim, S. W. Nam, J. W. Lee, and S. K. Kim. 2005. Optimization of heteropolysaccharide-7 production by Beijerinckia indica. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 33: 117-122
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