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문제 정의
- 나타났다. 그러나 실제로 in vM에서의 명확한 효능에 대해서 보고된 바가 없었으므로 본 실험에서 제니스테인의 in vivo 효능에 대해 확인하였다.
- 본 실험에서는 세포수준에서 제니스테인의 멜라닌 생성억제 효과를 측정하고자 하였다. Melan-a 세포에 제니스테인을 0.
- 본 실험에서는 제니스테인을 melan-a 세포에 처리하였을 때, tyrosinase의 glycosylation을 저해하는지 관찰하였다. Melan-a 세포에 제니스테인은 5, 50 uM, 양성대조군인 DNJ 는 10 uM의 농도로 3일간 처리한 후, Endo H로 12시간 처리하고 western blot을 실시하였다.
- 본 실험에서는 제니스테인이 tyrosinase의 발현에 미치는 영향을 관찰함으로써 제니스테인이 tyrosinase의 발현을 저해하여 미백 활성을 나타내는지 확인하고, 또 어떤 단계에서 작용하는지 확인하고자 하였다. Melan-a 세포에 제니스테인을 0.
- 본 실험을 통해 제니 스테인이 melan-a 세포에서 a-glu- cosidase를 억제하여 tyrosinase의 glycosylation을 저해하는 것을 밝혔다. 따라서 지금까지의 실험결과에서 제니스테인은 tyrosinase 활성을 억제하여 멜라닌 생성을 억제흐}는데 이것은 tyrosinase 발현을 억제하는 것이 아니고 tyrosinase의 이ycosylation을 저해하여 나타나는 결과이다.
- 본 연구에서는 melna-a 세포에서 제니스테인이 멜라닌 생성 억제 효과의 유무, a-glucosidsase 활성의 저해정도, 그리고 tyrosinase의 glycosylation의 저해정도를 실험하여 제니스테인의 멜라닌 생성 억제 작용 기전에 대해서 알아보고자 하였다.
- 앞서의 실험에서 제니스테인은 tyrosinase 발현 이후의 과정을 저해할 가능성이 높았으므로, 본 실험에서는 a-이u- cosidase의 활성 억제 효과가 있는지 확인 하였다. 제니스테인과 효모의 a-glucosidase에 pNP glycoside를 넣고 10분 동안 효소반응을 시킨 결과는 Fig.
- 제니스테인의 tyrosinase 활성 억제 효과는 전술한 바와 같이 mushroom tyrosinase를 이용한 연구결과는 있으나[11] 활성이 약하였으며, mushroom tyrosinase를 사용했을 때와 세포를 사용했을 때의 결과가 다른 경우가 있으그로[10] 본 실험에서는 제니스테인이 melan-a 세포의 tyrosinase에 직접 작용하여 활성을 억제하는지 혹은 세포수준에서 억제하는지를 측정해 보고자 하였다. Fig.
- 한편, 제니스테인이 세포수준에서는 tyrosinase 활성을 억제하는지 알아보았다. Melan-a를 키우면서 , 세포 배지에 제니스테인을 0.
제안 방법
- 5주간 제니스테인을 도포한 인공색소반을 8 mm biopsy punch를 이용흐}여 생검하고 그 조직을 10% neutral buffered formalin solution으로 고정하여 파라핀에 포매하였다. 포매된 조직을 5 μM 두께로 section한 다음, 일반적인 피부조직을 관찰하기 위하여 Hematoxylin-Eosin(H-E) 염색을, 멜라닌의 생성 변화를 관찰하기 위해 Fontana-Masson(F-M) 염색을 수행하였다.
- Membrane을 3% BSA로 1시간 동안 blocking한 뒤 tyrosinase, actin 등의 primary antibody 로 3-4시간 동안 처리하고, horseradish peroxidase가 결합된 secondary antibody 및 LumiGlo를 이용하여 발색된 밴드의 강도(band intensity)를 확인하였다. Actine 각각의 시료에 동량의 단백질이 들어있는지 확인하기 위한 대조군으로 사용하였다.
- 관찰하였다. Melan-a 세포에 제니스테인은 5, 50 uM, 양성대조군인 DNJ 는 10 uM의 농도로 3일간 처리한 후, Endo H로 12시간 처리하고 western blot을 실시하였다. Fig.
- 효과를 측정하고자 하였다. Melan-a 세포에 제니스테인을 0.5, 5 및 50 nM로 3일간 처리 후 세포 생존율과 멜라닌 생성량을 측정한 결과는 Fig. 1과 같았다. Fig.
- Cell lysate를 18, 000xg, 10분간 원심분리하여 얻은 상층액으로부터 일정량의 단백질(20-40)을 취하여 10% polyacrylamide gel을 사용하여 전기영동한 다음, PVDF membrane에 전기적으로 transfer시켰다. Membrane을 3% BSA로 1시간 동안 blocking한 뒤 tyrosinase, actin 등의 primary antibody 로 3-4시간 동안 처리하고, horseradish peroxidase가 결합된 secondary antibody 및 LumiGlo를 이용하여 발색된 밴드의 강도(band intensity)를 확인하였다. Actine 각각의 시료에 동량의 단백질이 들어있는지 확인하기 위한 대조군으로 사용하였다.
- Tyrosinase 활성은 3H-tyrosine이 효소반응에 의해 DOPA 로 전환되면서 유리되는 3H2Oe 방사능량을 측정함으로써 정량하였다[15]. Tyrosinase는 이 효소를 함유한 melan-a 세포의 추출물을 이용하였다.
- a-Glucosidase 가 p-nitrophenyl(pNP) glycoside의 glycoside 부분을 기질로 인식하여, pNP와 glycoside# 효소 반응으로 끊어주고, 여기에서 끊어져 나온 pNP의 양을 405 nm에서 흡광도를 측정하여 이것으로 a-glucosidase activity를 간접적으로 측정하였다[4]. 50 mM phosphate buffer(pH 6.
- 대조군에는 제니스테인과 DNJ을 녹이기 위해 사용했던 DMSO가 들어있는 배지를 처리하였다. 그리고 3일이 지난 후 세포를 trypsin/EDTA로 처리하여 바닥에서 떨어뜨린 다음 모았다. 이렇게 모은 세포에 lysis buffer (2% CHAPS in 50 mM Hepes and 200 mM NaCl, pH 7.
- 이렇게 배양한 세포를 각 75 cm2 티슈 플라스크에 3 X 13개를 주입하고 12시간 정치하여 세포를 기벽에 부착시킨 후, 배지를 제니스테인 및 DNJ가 들어있는 새 배지로 갈아주었다. 대조군에는 제니스테인과 DNJ을 녹이기 위해 사용했던 DMSO가 들어있는 배지를 처리하였다. 그리고 3일이 지난 후 세포를 trypsin/EDTA로 처리하여 바닥에서 떨어뜨린 다음 모았다.
- 변화를 측정하였다. 동일 부위에 대해서 3회 반복 측정하여 그 평균값을 구하여 비교하였다.
- 8)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 0.2% BSA 250 μL와 10% trichloroacetic acid(TCA) 500 μL를 가하여 반응을 정지시키고 원심분리하여 단백질을 침전시키고 상층액에 500 μL charcoal(l:l in PBS)을넣고 상온에서 1시간 흡착시킨 후 원심분리하여 침전물을 제거하고, 그 상층액을 취하여 liquid scintillation counter (Beckman LS5000, Ramsey, MN, USA)로 방사능량을 측정하였다. 이때, 3H2O의 방사능량이 적을수록 tyrosinase 활성 억제 효과가 큰 것으로 판정하였다.
- 색차계 (Chromameter CM2002, Minolta, Japan)를 이용하여, 제니스테인의 도포 전과 도포 후의 L* 값(brightness parameter변화를 측정하였다. 동일 부위에 대해서 3회 반복 측정하여 그 평균값을 구하여 비교하였다.
- 제니스테인은 DMSO에 원하는 농도대로 녹여 사용하고 대조군은 DMSO를 처리한 세포를 이용하였다. 위와 같은 방법으로 제니스테인과 DMSO를 3일간 처리한 후 4일째 세포의 viability는 crystal violet를 이용한 염색으로, melanin의 양은 1 N NaOHS- cell을 녹여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 부위의 털을 제거한 다음 피부에 직경 1 cn?의 원형 창문이 뚫린 알루미늄 호일을 접착시킨 후 Waldmann UV 800(Herbert Waldmann GmbH & Co, Philips TL/12 lamp emitting 280-305 nm)로 자외선을 조사하였다. 1회 조사량은 500 mJ/cm2로 하였으며 주 1회, 3주간 연속 조사하여 총조사량이 1,500 mJ/cnF이 되게 흐]였다[12].
- Melan-a 세포를 FBS가 10% 들어간 RPMI-1640 배지에 넣어 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. 이렇게 배양한 세포를 각 75 cm2 티슈 플라스크에 3 X 13개를 주입하고 12시간 정치하여 세포를 기벽에 부착시킨 후, 배지를 제니스테인 및 DNJ가 들어있는 새 배지로 갈아주었다. 대조군에는 제니스테인과 DNJ을 녹이기 위해 사용했던 DMSO가 들어있는 배지를 처리하였다.
- 이후 in vivo 실험을 통해 미백 효능을 나타내는지 알아보았다.
- 자외선 조사에 의해 형성된 인공색소반에 미백 물질을 도포하는 시점은 햇볕에 의한 색소침착의 방지 효과 그리고 이미 형성된 색소침착의 조기 개선 효과를 알아보기 위하여 마지막으로 자외선을 조사한 다음날부터 vehicle(water:ethanol: propylene 이ycol = 5:2:3)에 1%, 2% 농도로 용해시킨 제니스테인을 1일 2회, 5주간 면봉으로 도포하였다.
- 미백 물질의 in vivo 효과 측정은 brown guinea pig 을 사용하였다. 제니스테인을 1, 2%의 농도로 실험 방법에서 전술한 vehicle에 녹여 인공색소반 부위에 매일 2희씩 총 5주간 도포하였다. 시료 도포 시점부터 매주 색차계를 이용하여 L* 값을 측정한 결과는 Fig.
- 포매된 조직을 5 μM 두께로 section한 다음, 일반적인 피부조직을 관찰하기 위하여 Hematoxylin-Eosin(H-E) 염색을, 멜라닌의 생성 변화를 관찰하기 위해 Fontana-Masson(F-M) 염색을 수행하였다.
- 여기에 endo H 10 ]1L(1 |1U in 200 μL) 와 protease inhibitors 를 넣어 37℃에서 12시간 동안 효소반응을 시켰다. 효소 반응 후 반응액에 sample buffer(125 mM Tris pH 6.8, 4% SDS, 10% glycerol, 0.006% bromophenol blue, 1.8% |3- mercaptoethanol)를 넣고 5분간 끊인 다음 western blot을 실시하였다.
대상 데이터
- C57BL/6 mouse에서 유래한 immortalized cell line인 melan-a 세포는 [6] Dr. Bennett(Cancer Research Center, London, England)로부터 분양 받아 사용하였다. Melan-a 세포는 FBS가 10%, 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate?]- 200 mM, streptomycin6] 100 mg/L, penicillin6] 100, 000 U/L, Cholera toxin이 0.
- Tyrosinase는 이 효소를 함유한 melan-a 세포의 추출물을 이용하였다. 배양액을 제거한 melan-a 세포를 PBS로 세척한 뒤 tyrosinase buffer(80 mM phosphate buffer, 1.
- 실험에 사용된 penicillin, streptomycin, 0.25% trypsin- EDTA, RPMI-1640^ Gibco BRL(Grand Island, NY, USA) 에서, FBS는 Hyclone(Logan, UT, USA)에서, 3H-tyrosine, LumiGloe NEN Biolabs(Beverly, MA, USA)에서, DMSO, Endo H, a-glucosidase, genistein, pNP glycoside, lectin, DNJ는 Sigma(St. Louis, MO, USA)에서, tyrosinase 및 actin 항체는 Cell Signaling(Danvers, MA, USA)에서 각각 구매하였다. 그 외에 사용된 시약은 따로 언급이 없는 한 시판 중인 특급 시약을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 자료는 mean士S.E로 나타내었고 One-way ANOVA 를 사용하여 통계 처리한 후 p<0.05 유의수준에서 검증하였다.
이론/모형
- 미백 물질의 in vivo 효과 측정은 brown guinea pig 을 사용하였다. 제니스테인을 1, 2%의 농도로 실험 방법에서 전술한 vehicle에 녹여 인공색소반 부위에 매일 2희씩 총 5주간 도포하였다.
성능/효과
- , in vivo 실험에서도 제니스테인 1. 2% 농도 모두 brown guinea pig의 피부에서 UVB에 대한 미백 효과를 뚜렷이 보이는 것을 알 수 있었다. 또한 조직손상, 염증, 표피와 진피 변화 등을 보는 H-E 염색에서는 제니스테인에 의해 피부조직의 변화를 발견할 수 없었으나 멜라닌 색소에 대한 F-M 염색에서는 제니스테인 2%를 도포한 부위의 멜라닌 생성 이대 조 군에 비해 상당히 감소하였음을 확인할 수 있었다.
- 6의 결과에서 제니스테인 도포 전과 도포 5 주 후의 brown guinea pig의 피부흑화 정도의 사진이다. Fig. 7에서와 같이 제니스테인 1, 2%를 5주 도포한 처리 군은 비처리군이나 대조군에 비해 육안으로도 피부의 미백 효과에 뚜렷한 차이가 보이는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 Fig.
- 알아보았다. Melan-a를 키우면서 , 세포 배지에 제니스테인을 0.5, 5, 50 μM 농도로 24시간 처리한 후 in situ tyrosinase 활성을 측정한 결과는 Fig. 2의 (B)에서 같이 0.5, 5, 50 |1M에서 농도 의존적으로 tyrosinase 활성이 각각 5%, 41%, 62% 저해되었다. 이 결과에서 제니스테인의 멜라닌 합성 억제 효과는 제니스테인이 melan-a 세포에 작용하여 tyrosinase의 활성을 억제하는 것에 기인하는 것을 알 수 있었다.
- 따라서 제니스테인이 tyrosinase 활성을 억제하여 멜라닌생성을 억제하는 것은 tyrosinase 발현을 억제하는 것이 아니고 tyrosinase의 glycosylation을 저해하여 나타는 결과이며 , in vivo 실험에서도 제니스테인 1. 2% 농도 모두 brown guinea pig의 피부에서 UVB에 대한 미백 효과를 뚜렷이 보이는 것을 알 수 있었다.
- 밝혔다. 따라서 지금까지의 실험결과에서 제니스테인은 tyrosinase 활성을 억제하여 멜라닌 생성을 억제흐}는데 이것은 tyrosinase 발현을 억제하는 것이 아니고 tyrosinase의 이ycosylation을 저해하여 나타나는 결과이다. 그러므로 제니스테인 처리에 의해 tyrosinase의 활성이 저하되는 것은 세포 내에서 비정상적인 tyrosinase가 만들어져 멜라 노 좀으로의 이동이 줄어드는데 기인하는 것으로 판단되었다.
- 2% 농도 모두 brown guinea pig의 피부에서 UVB에 대한 미백 효과를 뚜렷이 보이는 것을 알 수 있었다. 또한 조직손상, 염증, 표피와 진피 변화 등을 보는 H-E 염색에서는 제니스테인에 의해 피부조직의 변화를 발견할 수 없었으나 멜라닌 색소에 대한 F-M 염색에서는 제니스테인 2%를 도포한 부위의 멜라닌 생성 이대 조 군에 비해 상당히 감소하였음을 확인할 수 있었다. 이와 같이 제니스테인은 in vitro와 in vivo 모두에서 미백 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
- 8에서 H-E 염색 결과를 살펴보면, 대조군과 제니스테인 2% 처리군 모두 별다른 차이를 발견할 수 없었다. 반면, 멜라닌 색소에 대한 F-M 염색 결과를 살펴보면, 제니스테인 2%를 도포한 부위의 멜라닌 생성 이 대조군에 비해 상당히 감소하였음을 확인할 수 있었다. 이와 같이 Fig.
- 본 결과에서 제니스테인은 tyrosinase의 직접적인 저해 효과는 없으나 세포수준에서 tyrosinase 활성을 농도 의존적으로 억제하였고 그 정도는 멜라닌 생성 억제율과 상관성이 매우 높았다. 이런 결과로 보아 제니스테인은 tyrosinase의 발현의 전사 단계에 관련하거나 흑은 단백질의 번역 후 변형 (post-translation modification) 단계에 관여하여 미백 효과를 나타내는 것으로 추정해 볼 수 있다.
- 본 결과에서는 비암세포에 가까운 melan-a 세포에서 제니스테인에 의한 멜라닌 생성 억제 효과는 50 [1M에서 약 50%를 상회하는 수준이므로 피부미백 효과를 가질 것으로 생각되었다. 이후 in vivo 실험을 통해 미백 효능을 나타내는지 알아보았다.
- 앞서의 결과들에서 제니스테인은 세포수준에서 멜라닌 생성을 저해하는 것으로 확인되었으며 그 기전은 a-glucosidase 활성 저해를 통한 tyrosinase의 glycosylation을 저해하는 것으로 나타났다. 그러나 실제로 in vM에서의 명확한 효능에 대해서 보고된 바가 없었으므로 본 실험에서 제니스테인의 in vivo 효능에 대해 확인하였다.
- 이 결과에서 제니스테인의 멜라닌 합성 억제 효과는 제니스테인이 melan-a 세포에 작용하여 tyrosinase의 활성을 억제하는 것에 기인하는 것을 알 수 있었다. 앞서의 멜라닌 생성 억제율(Fig. 1)과 비교시 농도에 따른 저해율과 tyrosinase 활성 억제율이 멜라닌 생성 억제율과 매우 유사하여 높은 상관도를 보였다. 이 2가지의 결과에서 제니스테인이 tyrosinase에 직접 작용하여 활성을 저해하지 않으나, 세포내에서 tyrosinase가 작용하는 단계의 전이나 후, 어떤 과정에 영향을 미쳐 활성을 억제하는 것이라고 추정할 수 있었다.
- 앞의 결과에서 제니스테인은 tyrosinase 활성의 전이나 후단계에서 작용하여 melan-a 세포에서 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내며, 세포의 tyrosinase 활성을 저해하는 것으로 나타났다. 본 실험에서는 제니스테인이 tyrosinase의 발현에 미치는 영향을 관찰함으로써 제니스테인이 tyrosinase의 발현을 저해하여 미백 활성을 나타내는지 확인하고, 또 어떤 단계에서 작용하는지 확인하고자 하였다.
- 1)과 비교시 농도에 따른 저해율과 tyrosinase 활성 억제율이 멜라닌 생성 억제율과 매우 유사하여 높은 상관도를 보였다. 이 2가지의 결과에서 제니스테인이 tyrosinase에 직접 작용하여 활성을 저해하지 않으나, 세포내에서 tyrosinase가 작용하는 단계의 전이나 후, 어떤 과정에 영향을 미쳐 활성을 억제하는 것이라고 추정할 수 있었다. Hwang 등[18]에 의해 보고된 cinnamate 유도체 (3, 4, 5-trimethoxy cinnamate thymol ester, TCTE)도 in Wtm에서 tyrosinase를 직접 저해하지는 않으나, 세포수준에서 tyrosinasee] 활성을 저해하였다.
- 5, 5, 50 |1M에서 농도 의존적으로 tyrosinase 활성이 각각 5%, 41%, 62% 저해되었다. 이 결과에서 제니스테인의 멜라닌 합성 억제 효과는 제니스테인이 melan-a 세포에 작용하여 tyrosinase의 활성을 억제하는 것에 기인하는 것을 알 수 있었다. 앞서의 멜라닌 생성 억제율(Fig.
- 그리고 Mishima 등[25]이 보고한 glucosamine과 tunicamycin 외에도 Choi 등[13}은 최근 cc-glucosidase 저해제인 DNJ와 ot-mannosidase 의 저해 제인 deoxymannojirimycin(DMJ) 이 tyrosinase의 glycosylation을 차단하여 멜라노좀으로의 이동을 억제하며, 이 2가지 물질을 동시에 사용하였을 때 효과가 상승 적으로 나타난다는 것을 보고하였다. 이와 같이 본 실험에서도 제니스테인이 효모의 oc-glucosidase 활성을 저해하였으며 저해 효과는 농도 의존적으로 나타났다. 지금까지의 실험 결과에서 보면 제니스테인은 tyrosinase의 활성을 억제하여 멜라닌생성을 억제하는데 이것은 tyrosinase의 발현을 억제하는 것이 아니고 효모의 a-이ucosidase 활성을 농도 의존적으로 저해한 것으로 나타났으므로 제니스테인이 tyrosinase의 glycosylaiton> 억제할 가능성이 있는 것으로 판단되었다,
- 0인 대조군과는 14 값의 차이를 보였다. 이와 같이 제니스테인 1% 도포에서는 대조군과 비교하여 3주째까지는 거의 차이가 없다가 4, 5주에서 미백 효과가 크게 나타났으며, 제니스테인 2% 도포 군에서는 대조군과 비교하여 2주째부터 큰 차이를 보여 색차계를 이용한 in vivo 피부도포 실험에서도 제니스테인의 미백효과를 확인할 수 있었다.
- 또한 조직손상, 염증, 표피와 진피 변화 등을 보는 H-E 염색에서는 제니스테인에 의해 피부조직의 변화를 발견할 수 없었으나 멜라닌 색소에 대한 F-M 염색에서는 제니스테인 2%를 도포한 부위의 멜라닌 생성 이대 조 군에 비해 상당히 감소하였음을 확인할 수 있었다. 이와 같이 제니스테인은 in vitro와 in vivo 모두에서 미백 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다.
- 05). 제니스테인 1% 도포군은 3주 차까지는 대조군과 유사한 흑화 정도를 보였으나, 4주차부터 대조군과 비교하여 유의적으로 미백 효과가 나타났다(p<0.05). 5주차에 제니스테인 2% 처리군의 L* 값은 -0.
- 그러나 제니스테인 처리군에서는 색소 침착되는 정도가 대조군에 비하여 낮은 수준이었다. 제니스테인 2% 도포군에서는 2주차부터 대조군과 유의적인 차이가 나기 시작하여 실험 종료시점인 5주차까지 유의적으로 미백효과가 나타났다(p<0.05). 제니스테인 1% 도포군은 3주 차까지는 대조군과 유사한 흑화 정도를 보였으나, 4주차부터 대조군과 비교하여 유의적으로 미백 효과가 나타났다(p<0.
- 이는 tyrosinase의 glycosylation이 완전하지 못하여 Endo H에 의해 가수분해된 것으로 보인다. 제니스테인 처리군은 5 uM (lane 2)과 비교하여 50 uM(lane 3) 처리군에서 glycosylation 된 64 kD 밴드가 없는 것으로 보아 고농도에서 더욱 효과적으로 glycosylation이 저해되며 농도 의존적임을 보여 주었다. 양성대조군으로 사용한 DNJQane 4)도 64 kD의 tyrosinase가 Endo H에 의해 거의 사라졌음을 볼 수 있었다.
- 그러나 멜라닌 생성은 농도 의존적으로 억제되었다. 즉, 멜라닌 생성 억제율은 0.5, 5, 50 μM에서 각 9, 38, 55% 이었다.
- 이와 같이 본 실험에서도 제니스테인이 효모의 oc-glucosidase 활성을 저해하였으며 저해 효과는 농도 의존적으로 나타났다. 지금까지의 실험 결과에서 보면 제니스테인은 tyrosinase의 활성을 억제하여 멜라닌생성을 억제하는데 이것은 tyrosinase의 발현을 억제하는 것이 아니고 효모의 a-이ucosidase 활성을 농도 의존적으로 저해한 것으로 나타났으므로 제니스테인이 tyrosinase의 glycosylaiton> 억제할 가능성이 있는 것으로 판단되었다,
후속연구
- 본 결과에서 제니스테인은 tyrosinase를 직접 저해하지도 않으며, 발현이나 분해와도 관련되지 않고 세포 수준에서는 tyrosinase 활성을 저해하였으므로, 이ucosamine과 tunicamycine[25}과 같이 단백질의 post-translational modification 단계에서 작용하는지의 여부를 확인해 볼 필요가 있다고 사료되었다.
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