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문제 정의
- 본 연구는 이들 가운데 세포 밖으로 분비되어 세포 밖에서 생성되는 활성산소 제거 기능이 있는 것으로 알려진 사람의 SOD-3 단백질의 유전자를 배반엽 단계 수정란에 재조합 렌티바이러스(lentivirus)를 유전자 전달 운반체로 사용하여 계란의 난백에 사람의 SOD-3 단백질을 분비하는 형질 전환 닭을 생산하고자 하였다.
- 형질 전환 닭 생산 방법들 가운데 목적 유전자 운반에 탁월한 능력이 있는 것으로 알려진 렌티바이러스는 배반엽 단계 수정란을 이용한 형질 전환 닭 생산 연구에 활발하게 이용되고 있다. 본 연구는 재조합 렌티바이러스를 이용하여 사람의 SOD-3 단백질이 닭의 ovalbumin 프로모터에 의해서 유도되는 형질 전환 닭을 생산하고자 하였다. 사람의 SOD-3 단백질은 호흡 과정에서 체내에서 생성되는 활성산소를 중화시키는 탁월한 기능이 있는 것으로 알려져 있다.
제안 방법
- 3차 배양은 2차 배양이 끝난 후, 시험란의 무게보다 약 25 g 무거운 신선란을 선별하여 둔단부를 직경 4 cm로 잘라서 3차 배양용 대리난각을 준비하였고, 3차 배양용 대리난각으로 2차 배양이 완료된 수정란과 배양액 내용물을 모두 옮긴 후, 랩으로 밀봉하고, 온도 37.6 ℃, 습도 65～70%의 배양기에서 30분마다 30°씩 전란하면서 15일간 배양하였다.
- 그러므로 생산된 수컷들에서 정액을 채취, Genomic DNA purification kit(Promega)를 사용하여 genomic DNA 분리하여, OVP-F(5-ggt caa act tct gaa ggg aac ctg tg-3)와 hnSOD3-B(5-agc agg cag gaa cac agt agc g-3) primer들과 AccuPrime SuperMix II(Invitrogen)를 사용하여 94 ℃-2분, 94 ℃-45초, 62 ℃- 30초, 68 ℃-20초의 조건으로 PCR를 수행하여 정액에 목적 유전자를 가지는 개체를 선별하였다. PCR 반응으로 증폭된 DNA 단편은 pTOPO(Invitrogen)에 클로링하여 증폭된 DNA 단편의 염기 서열을 분석하였다.
- 8 kb 크기의 계란 특이적인 ovalbumin 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 영역이 결합된 OVP2800/hnSOD-3 lentiviral vector를 multigateway system(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 구축하였고, 최종적으로 염기 서열 분석 방법으로 구축한 vector를 재검증하였다. 구축한 lentiviral vector는 바이러스 packaging 세포인 293FT를 사용하여 제조사의 실험방법에 따라 재조합 렌티 바이러스를 생산하였다. 생산된 재조합 바이러스 titer는 HeLa 세포와 항생제인 blasticidin(Invitorgen)을 사용하여 아래의 순서로 검증하였다.
- 완전한 형태의 형질 전환 닭(G1) 생산은 생산된 후보 형질 전환 닭들(G0) 가운데 정액에 목적 유전자를 가지는 개체의 선발이 필수적이다. 그러므로 생산된 수컷들에서 정액을 채취, Genomic DNA purification kit(Promega)를 사용하여 genomic DNA 분리하여, OVP-F(5-ggt caa act tct gaa ggg aac ctg tg-3)와 hnSOD3-B(5-agc agg cag gaa cac agt agc g-3) primer들과 AccuPrime SuperMix II(Invitrogen)를 사용하여 94 ℃-2분, 94 ℃-45초, 62 ℃- 30초, 68 ℃-20초의 조건으로 PCR를 수행하여 정액에 목적 유전자를 가지는 개체를 선별하였다. PCR 반응으로 증폭된 DNA 단편은 pTOPO(Invitrogen)에 클로링하여 증폭된 DNA 단편의 염기 서열을 분석하였다.
- 그리고 미세 주입에 사용한 피펫은 puller와 grinder를 사용하여 피펫 끝의 외경(40×80 μm)과 피펫 말단의 각도(30°)가 되도록 가공하여 사용하였다.
- 그리고 배양 3일차에 10μg/mL 농도의 blasticidin 항생제를 포함하는 선별 배지로 교환하고, 배지는 3일에 한번 교환하였고, 대조구 세포군이 완전히 죽을 때까지 계속적으로 배지를 교환하였다.
- 먼저 바이러스 감염 전날에 1×105 HeLa 세포를 6-well plate(Promega, Madison, WI, USA)에 심고, 다음날 배양 배지에 10배씩 순차적으로 희석한 바이러스를 세포에 감염시키고, 더불어 바이러스 감염의 과정에 polybrene(Sigma, St. Louis, MO, USA)의 농도가 10μg/mL되게 첨가하였다.
- 먼저 바이러스의 감염을 도와주는 물질인 polybrene을 10μg/mL의 농도로 재조합 바이러스를 혼합하고, 1～5 μL 가량의 바이러스 혼합물을 배반엽 단계 수정란의 세포질에 미세 주입하고, 앞서 언급한 배반엽 단계 수정란 인공배양법을 이용하여 후보 병아리를 생산하였다.
- 배반엽 단계(Stage-X) 수정란을 제공하는 공여계는 일주일에 5개 이상의 계란을 낳는 암탉 100수를 선발하였고, 이들을 동종의 수탉 정액을 이용하여 매주 2회씩 정기적으로 인공수정하였다.
- 부화하여 일주일 이상 생존한 형질전환 후보 병아리(G0)는 암컷 23수와 수컷 47수 모두 70수였으며, 이들의 유전 분석을 위하여 모든 개체들에서 날개에서 채혈하여 genomic PCR을 수행하였다. 연구 결과에 나타내지 않았지만, 분석한 모든 개체들의 혈액에는 주입한 목적 유전자가 존재하지 않는 것으로 나타났다.
- 사람의 SOD-3 유전자와 닭의 2.8 kb 크기의 계란 특이적인 ovalbumin 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 영역이 결합된 OVP2800/hnSOD-3 lentiviral vector를 multigateway system(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 구축하였고, 최종적으로 염기 서열 분석 방법으로 구축한 vector를 재검증하였다. 구축한 lentiviral vector는 바이러스 packaging 세포인 293FT를 사용하여 제조사의 실험방법에 따라 재조합 렌티 바이러스를 생산하였다.
- 구축한 lentiviral vector는 바이러스 packaging 세포인 293FT를 사용하여 제조사의 실험방법에 따라 재조합 렌티 바이러스를 생산하였다. 생산된 재조합 바이러스 titer는 HeLa 세포와 항생제인 blasticidin(Invitorgen)을 사용하여 아래의 순서로 검증하였다. 먼저 바이러스 감염 전날에 1×105 HeLa 세포를 6-well plate(Promega, Madison, WI, USA)에 심고, 다음날 배양 배지에 10배씩 순차적으로 희석한 바이러스를 세포에 감염시키고, 더불어 바이러스 감염의 과정에 polybrene(Sigma, St.
- 후보 병아리의 생산은 앞서 언급한 유전자를 가지는 1×106 cfu/mL 재조합 렌티바이러스를 배반엽 단계 수정란의 미세 주입하고 대리난각 배양법을 이용하여 배양기에서 21일 동안 배양하는 방법으로 생산하였다. 유전자를 미세주입한 341개의 수정란에서 78수의 후보 형질 전환 병아리를 생산하였으며, 생산된 후보 형질 전환 병아리들의 유전 분석은 PCR 방법을 이용하여 검증하였다. 유전 분석 결과는 성 성숙에 이른 47수의 수컷들 가운데 2수의 정액에서 사람의 SOD-3 유전자가 존재함을 보였다.
- 재조합 렌티바이러스의 미세 주입은 Love 등(1994)이 제시한 방법을 약간 수정하여 수행하였다. 사용한 렌티바이러스는 사람의 SOD-3 유전자와 닭의 계란 특이적인 프로모터를 가지는 재조합 바이러스를 사용하였다.
- 특히 PCR 검증 방법은 주입한 재조합 바이러스의 사람 SOD-3 유전자와 닭의 ovalbumin 프로모터가 결합된 부분이 선택적으로 증폭될 수 있도록 디자인하였다. 재조합 바이러스의 생산은 바이러스 packaging 세포인 293FT을 사용하였고, 생산된 재조합 렌티바이러스의 titer 검증은 세포에 바이러스 감염과 항생제에 저항성을 가지는 세포군집의 수를 세는 방법으로 검증하였다. 그림 2는 생산된 OVP2800/hnSOD-3 재조합 렌티바이러스가 대략적으로 106 cfu/mL 정도의 바이러스 titer가 됨을 보여주고 있다.
- 1과 같다. 특히 PCR 검증 방법은 주입한 재조합 바이러스의 사람 SOD-3 유전자와 닭의 ovalbumin 프로모터가 결합된 부분이 선택적으로 증폭될 수 있도록 디자인하였다. 재조합 바이러스의 생산은 바이러스 packaging 세포인 293FT을 사용하였고, 생산된 재조합 렌티바이러스의 titer 검증은 세포에 바이러스 감염과 항생제에 저항성을 가지는 세포군집의 수를 세는 방법으로 검증하였다.
- 후보 병아리 생산은 배반엽 단계 수정란에 사람의 SOD-3 유전자와 계란 특이적인 프로모터를 가지는 재조합 렌티바이러스를 미세주입하고 대리난각을 이용한 인공배양을 실시하여 Table 1의 연구 결과를 얻었다. 배반엽 단계 수정란에 바이러스 미세주입의 과정 없이 단지 대리난각 인공배양을 수행한 대조군은 50%의 부화율을 보였다.
- 후보 병아리의 생산은 앞서 언급한 유전자를 가지는 1×106 cfu/mL 재조합 렌티바이러스를 배반엽 단계 수정란의 미세 주입하고 대리난각 배양법을 이용하여 배양기에서 21일 동안 배양하는 방법으로 생산하였다.
대상 데이터
- 재조합 렌티바이러스의 미세 주입은 Love 등(1994)이 제시한 방법을 약간 수정하여 수행하였다. 사용한 렌티바이러스는 사람의 SOD-3 유전자와 닭의 계란 특이적인 프로모터를 가지는 재조합 바이러스를 사용하였다. 그리고 미세 주입에 사용한 피펫은 puller와 grinder를 사용하여 피펫 끝의 외경(40×80 μm)과 피펫 말단의 각도(30°)가 되도록 가공하여 사용하였다.
- 연구에 사용한 실험동물과 수정란은 축산과학원에서 보유중인 갈색산란계(하이라인)와 동종이 산란한 수정란들을 사용하였다. 공시동물의 사육실은 16시간 고정 점등하였고, 물과 사료는 무제한 공급하면서 독립 케이지에서 사육하였다.
성능/효과
- 또한, 정액의 PCR 분석 결과 특이적으로 증폭된 DNA 단편의 염기 서열 분석 결과(Fig. 4)는 닭의 ovalbumin 프로모터, 사람의 SOD-3 유전자, 유전 분석에 사용하였던 primer들의 염기 서열 위치 그리고 EcoRI 제한 효소자리가 모두 존재함을 보여주고 있다.
- 후보 병아리 생산은 배반엽 단계 수정란에 사람의 SOD-3 유전자와 계란 특이적인 프로모터를 가지는 재조합 렌티바이러스를 미세주입하고 대리난각을 이용한 인공배양을 실시하여 Table 1의 연구 결과를 얻었다. 배반엽 단계 수정란에 바이러스 미세주입의 과정 없이 단지 대리난각 인공배양을 수행한 대조군은 50%의 부화율을 보였다. 대조군의 50% 부화율 연구 결과는 배반엽 단계 수정란과 대리난각 방법을 이용한 병아리 인공배양 연구 결과(Borwornpinyo et al.
- 배반엽 단계 수정란, 대리난각 인공배양법 그리고 재조합 렌티바이러스를 이용한 형질 전환 닭(G0) 생산 연구 결과를 종합하면 다음과 같다. 부화한 모든 후보 형질 전환 닭들의 혈액에는 주입한 목적 유전자가 없었지만, 정액에는 목적 유전자를 가지는 개체가 2수 존재함을 PCR 유전 분석으로 확인할 수 있었다. 이상의 연구 결과들은 배반엽 단계 수정란에서 재조합 렌티바이러스를 이용한 형질 전환 닭 생산의 가능성을 확인하였다.
- 수컷 후보 병아리 47수 정액의 PCR 분석은 성 성숙이 완료된 개체들에서 정액을 채취하고 혈액과 동일한 방법으로 genomic DNA를 분리와 유전 분석을 수행하여 그림 3의 연구 결과를 얻었다. 분석한 개체들 가운데 2마리의 정액에서 233bp 크기의 특이적인 DNA 단편이 증폭되었으며, 증폭된 DNA 단편은 EcoRI 제한 효소 처리 결과 positive control과 동일한 형태로 절단됨을 또한 보여주었다(Fig. 3의 1과 4번 후보 병아리).
- 연구 결과에 나타내지 않았지만, 분석한 모든 개체들의 혈액에는 주입한 목적 유전자가 존재하지 않는 것으로 나타났다. 수컷 후보 병아리 47수 정액의 PCR 분석은 성 성숙이 완료된 개체들에서 정액을 채취하고 혈액과 동일한 방법으로 genomic DNA를 분리와 유전 분석을 수행하여 그림 3의 연구 결과를 얻었다. 분석한 개체들 가운데 2마리의 정액에서 233bp 크기의 특이적인 DNA 단편이 증폭되었으며, 증폭된 DNA 단편은 EcoRI 제한 효소 처리 결과 positive control과 동일한 형태로 절단됨을 또한 보여주었다(Fig.
- 부화하여 일주일 이상 생존한 형질전환 후보 병아리(G0)는 암컷 23수와 수컷 47수 모두 70수였으며, 이들의 유전 분석을 위하여 모든 개체들에서 날개에서 채혈하여 genomic PCR을 수행하였다. 연구 결과에 나타내지 않았지만, 분석한 모든 개체들의 혈액에는 주입한 목적 유전자가 존재하지 않는 것으로 나타났다. 수컷 후보 병아리 47수 정액의 PCR 분석은 성 성숙이 완료된 개체들에서 정액을 채취하고 혈액과 동일한 방법으로 genomic DNA를 분리와 유전 분석을 수행하여 그림 3의 연구 결과를 얻었다.
- 유전자를 미세주입한 341개의 수정란에서 78수의 후보 형질 전환 병아리를 생산하였으며, 생산된 후보 형질 전환 병아리들의 유전 분석은 PCR 방법을 이용하여 검증하였다. 유전 분석 결과는 성 성숙에 이른 47수의 수컷들 가운데 2수의 정액에서 사람의 SOD-3 유전자가 존재함을 보였다. 이상의 연구 결과는 완전한 형태의 형질전환 닭 생산의 가능성을 보여주고 있다.
- 유전 분석 결과는 성 성숙에 이른 47수의 수컷들 가운데 2수의 정액에서 사람의 SOD-3 유전자가 존재함을 보였다. 이상의 연구 결과는 완전한 형태의 형질전환 닭 생산의 가능성을 보여주고 있다.
- 부화한 모든 후보 형질 전환 닭들의 혈액에는 주입한 목적 유전자가 없었지만, 정액에는 목적 유전자를 가지는 개체가 2수 존재함을 PCR 유전 분석으로 확인할 수 있었다. 이상의 연구 결과들은 배반엽 단계 수정란에서 재조합 렌티바이러스를 이용한 형질 전환 닭 생산의 가능성을 확인하였다.
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