초록

식물 발현 벡터에 EPO, BMP, TPA, BGH 등의 의료용 단백질 유전자를 클로닝하여 담배와 이끼 등 식물체에 형질전환하여 그 발현 정도와 기내 활성도를 관찰하였다. 유전자 도입에 따른 식물 형태적 특성의 변화를 관찰하였으며, 이끼 유용 단백질인 physcomitrin을 2-D 기법으로 확인하였고 hemolytic 특성과 스트레스 관련성을 규명하였다.

Abstract ▼

In this project, we cloned the useful genes coding pharmaceutical proteins, transformed those cloned genes into tobacco and a moss, Physcomitrella patens, and characterized their expression in those overexpressed lines and their morphological alterations affected by the overexpression of the introdu

In this project, we cloned the useful genes coding pharmaceutical proteins, transformed those cloned genes into tobacco and a moss, Physcomitrella patens, and characterized their expression in those overexpressed lines and their morphological alterations affected by the overexpression of the introduced gene. Using the previously established mass culture system for the moss, we isolated the proteins expressed by those plants, and characterized the in vitro activity of recombinant proteins. For these purposes, we used erythropoietin (EPO), tissue-type plasminogen activator (TPA), bone morphogenetic protein (BMP), bovine growth hormone (BGH), and major histocompatibility complex I (MHC I) genes. The presense of introduced genes were identified by genomic PCR and Southern analysis. Foreign gene expression within transgenic plants were examined by Northern analyses or RT-PCR. Several morphological alterations were observed in those overexpressed lines of tobacco and the moss. We also could isolated a cytolytic protein, physcomitrin, by the 2-D proteomic study, and identified its hemolytic activity and biotic and abiotic defense-related effect. Four articles were published in the international journals, and five domestic patents were registered. Recently, plant biotechnology combined with plant tissue culture techniques has been rapidly developed to engineer crop plants. Furthermore, plants are very attractive biological systems for the production of pharmaceutical recombinant proteins owing to many advantages, such as mass production with relatively low costs, extremely stable storage of proteins in tissues, similarity of translational modification machinery with animal, and safety from animal virus contamination. Therefore, it is worthy of trying to produce pharmaceutical proteins through nuclear and plastid transformation in mass scale with a view of industrialization. Transgenic plants from this project will be distributed to other institutes for further application. In addition, P. patens is going to be supplied as a model plant system and a bioreactor for the production of pharmaceuticals.

목차 Contents

• 표지...1
• 제출문...2
• 요약문...3
• SUMMARY...4
• CONTENTS...5
• 목차...8
• 제 1 장 서론...11
• 제 1 절 연구 개발의 목적...11
• 제 2 절 연구 개발의 필요성...12
• 1. 기술적 측면...12
• 2. 경제, 산업적 측면...13
• 3. 사회, 문화적 측면...13
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황...15
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과...18
• 제 1 절 연구 재료 및 방법...18
• 1. 유용 유전자 식물발현 벡터 제작...18
• 2 이끼 P. patens의 재배...18
• 3. 이끼의 형질전환...19
• 4. 담배의 재배와 형질전환...19
• 5. 도입된 유전자의 확인...20
• 6. Southern 분석...20
• 7. Northern 분석...20
• 8. RT-PCR...21
• 9. Immunoblot analysis...21
• 10. 2D electrophoresis...22
• 11. 대장균 E. coli 에서의 재조합 physcomitrin 단백질의 생산...22
• 12. Polyclonal antibody 생산...23
• 13. Enzyme linked immuno-sorbent assay (ELISA)...23
• 14. Hemolytic assay...23
• 15. MTT assay...23
• 16. 대량배양...24
• 제 2 절 유용 재조합 단백질 유전자의 cloning...24
• 1. Erythropoietin (EPO) 유전자의 cloning...24
• 2. Tissue-type plasminogen activator (TPA) 유전자의 cloning...27
• 3. Bone morphogenetic protein (BMP)의 cloning...29
• 4. Bovine growth hormone (BGH) 유전자의 cloning...31
• 5. Major histocompatibility complex (MHC I) 유전자의 cloning...32
• 제 3 절 유전자의 식물체 도입 및 발현 확인...34
• 1. EPO 형질전환체의 확인...34
• 가. 담배 형질전환체...34
• 나. 이끼 형질전환체...35
• 2. BMP 도입 이끼 형질전환체의 확인...37
• 3. BGH 도입 이끼 형질전환체의 확인...39
• 4. MHC 도입 형질전환체의 확인...41
• 제 4 절 형질전환체의 형태적 특성...41
• 1. EPO 형질전환 담배의 형태적 특성...41
• 2. EPO 형질전환 이끼의 형태적 특성...44
• 3. BMP 형질전환 이끼의 형태적 특성...45
• 4. BGH 형질전환 담배의 형태적 특성...47
• 5. BGH 형질전환 이끼의 형태적 특성...48
• 6. MHC 형질전환 이끼의 형태적 특성...49
• 제 5 절 이끼 유용 단백질 확인을 위한 proteome 실험...49
• 1. 2-DE와 MALDI-TOF 분석...49
• 2. EST 데이터베이스를 이용한 단백질의 확인...51
• 3. Gametophore proteome의 특징...55
• 4. Protonema와 gametophore의 비교분석...56
• 제 6 절 단백질의 분리 및 특성 분석...57
• 제 7 절 Physcomitrin 단백질의 특성 분석...59
• 1. Physcomitrin 의 추출 분리...59
• 2. Physcomitrin 유전자 분석...60
• 3. Gametophore 특이적인 유전자 발현...61
• 4. E. coli에서 Physcomitrin 단백질 생산...62
• 5. Physcomitrin의 hemolytic activity...63
• 6. Physcomitirn overexpression line의 제조...64
• 7. RNAi line의 확보...65
• 8. 각종 호르몬 및 환경 처리에 대한 Physcomitrin의 유전자 발현...65
• 제 4 장 연구개발목표 달성도 및 대외기여도...72
• 제 1 절 세부과제별 목표 대비 달성도...72
• 제 2 절 정량적 성과...72
• 1. 전문학술지 논문 게재...73
• 2. 특허 출원/등록...73
• 3. 학술발표...73
• 4. 기타(유용유전자, 형질전환체, 품종 등 실적)...73
• 제 5 장 연구개발 결과의 활용 및 발전 계획...74
• 제 6 장 기타 중요 변동사항...75
• 제 7 장 참고문헌...76