흑색종에서의 I-131표지 혈관내피세포성장인자 수용체2항체를 이용한 방사면역치료 평가 Evaluation of the Radioimmunotherapy Using I-131 labeled Vascular Endothelial Growth Factor Receptor2 Antibody in Melanoma Xenograft Murine Model원문보기
목적: 혈관내피성장인자(VEGF)와 그 수용체는 종양의 성장과 전이에 매우 중요한 역할을 한다 3개의 수용체가 알려져 있는데 그 중에서도 VEGFR2 (Flk-1/KDR)가 종양 angiogenesis에 매우 밀접하게 관련한 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 마우스 Flk-1 항체로 알려진 DC101에 I-131을 표지하여 매우 공격적인 종양으로 알려진 흑색 종의 치료 정도를 확인해 보고자 하였다. 방법: 하이브리도마 세포에서 Flk-1 항체인 DC101을 분리하여 western blot, ELISA, maldi-tof 방법을 이용하여 순도를 확인하고 항체 에 chloramin T를 이용하여 I-131을 표지하였다. 누드마우스에 B16F10세포를 주사하여 흑색종 모델을 만들고 평균 $200-250\;mm^3$으로 키워 $^{131}I$-DC101을 주사하여 영상과 시간별 장기섭취율(%ID/g)을 비교하고, 종양내 Flk-1 발현을 확인하기 위하여 면역염색 등을 시행하였다. 흑색종 동물모델을 5개 군으로 나누어 각각 치료를 시행하였다. 1군은 PBS만을, 2군은 $^{131}I$-DC101 $50\;{\mu}g(200\;{\mu}Ci)$을, 3군은 DC101 $50\;{\mu}g$을, 4군은 $^{131}I$-DC101 $30\;{\mu}g(200\;{\mu}Ci)$을, 5군은 $^{131}I$-DC101 $15\;{\mu}g(200\;{\mu}Ci)$을 각각 매 3일 ${\sim}$ 4일마다 주사하고 전체 5회를 주사하였고 종양볼륨을 측정하였다. 결과: $^{131}I$-DC101을 흑색종 모델에 정맥주사하고 78시간까지 영상을 얻은 결과 시간에 따라 종양섭취가 증가 하는 영상을 보였다. 시간대별 장기섭취를 정확히 확인하기 위하여 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간 장기섭취율을 비교한 결과 시간에 따라 혈액내 방사능치가 서서히 감소하였고 다른 장기의 섭취도 시간에 따라 감소하였고 종양의 섭취는 48시간까지 증가하였다가 그 이후는 감소하였다. 흑색종 동물모델에 $^{131}I$-DC101 치료를 시행한 결과 3번째 주사까지는 각군간의 유의한 차이를 보이지 않다가 4번째 주사를 시행한 때부터 1군과 2군, 또는 1군과 4군간의 유의한 차이를 보이기 시작했다. 또한 5번째 주사 이후에는 5군에서도 유의한 차이를 보여 I-131 에 의한 효과가 뚜렷해짐을 확인하였다. 결론 마우스 Flk-1 항체로 알려진 DC101을 흑색종 모델에 정맥내 주사하였을 때, 종양성장억제 효과를 보이지 않는 항체양에서도 I-131을 표지하여 치료를 시행했을 경우에는 효율적인 종양성장억제 효과를 보였다.
목적: 혈관내피성장인자(VEGF)와 그 수용체는 종양의 성장과 전이에 매우 중요한 역할을 한다 3개의 수용체가 알려져 있는데 그 중에서도 VEGFR2 (Flk-1/KDR)가 종양 angiogenesis에 매우 밀접하게 관련한 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 마우스 Flk-1 항체로 알려진 DC101에 I-131을 표지하여 매우 공격적인 종양으로 알려진 흑색 종의 치료 정도를 확인해 보고자 하였다. 방법: 하이브리도마 세포에서 Flk-1 항체인 DC101을 분리하여 western blot, ELISA, maldi-tof 방법을 이용하여 순도를 확인하고 항체 에 chloramin T를 이용하여 I-131을 표지하였다. 누드마우스에 B16F10세포를 주사하여 흑색종 모델을 만들고 평균 $200-250\;mm^3$으로 키워 $^{131}I$-DC101을 주사하여 영상과 시간별 장기섭취율(%ID/g)을 비교하고, 종양내 Flk-1 발현을 확인하기 위하여 면역염색 등을 시행하였다. 흑색종 동물모델을 5개 군으로 나누어 각각 치료를 시행하였다. 1군은 PBS만을, 2군은 $^{131}I$-DC101 $50\;{\mu}g(200\;{\mu}Ci)$을, 3군은 DC101 $50\;{\mu}g$을, 4군은 $^{131}I$-DC101 $30\;{\mu}g(200\;{\mu}Ci)$을, 5군은 $^{131}I$-DC101 $15\;{\mu}g(200\;{\mu}Ci)$을 각각 매 3일 ${\sim}$ 4일마다 주사하고 전체 5회를 주사하였고 종양볼륨을 측정하였다. 결과: $^{131}I$-DC101을 흑색종 모델에 정맥주사하고 78시간까지 영상을 얻은 결과 시간에 따라 종양섭취가 증가 하는 영상을 보였다. 시간대별 장기섭취를 정확히 확인하기 위하여 1시간, 6시간, 24시간, 48시간, 72시간 장기섭취율을 비교한 결과 시간에 따라 혈액내 방사능치가 서서히 감소하였고 다른 장기의 섭취도 시간에 따라 감소하였고 종양의 섭취는 48시간까지 증가하였다가 그 이후는 감소하였다. 흑색종 동물모델에 $^{131}I$-DC101 치료를 시행한 결과 3번째 주사까지는 각군간의 유의한 차이를 보이지 않다가 4번째 주사를 시행한 때부터 1군과 2군, 또는 1군과 4군간의 유의한 차이를 보이기 시작했다. 또한 5번째 주사 이후에는 5군에서도 유의한 차이를 보여 I-131 에 의한 효과가 뚜렷해짐을 확인하였다. 결론 마우스 Flk-1 항체로 알려진 DC101을 흑색종 모델에 정맥내 주사하였을 때, 종양성장억제 효과를 보이지 않는 항체양에서도 I-131을 표지하여 치료를 시행했을 경우에는 효율적인 종양성장억제 효과를 보였다.
Purpose: Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor, fetal liver kinase 1 (Flk-1), play an important role in vascular permeability and tumor angiogenesis. The aim of this study is to evaluate the therapeutic efficacy of $^{131}I$ labeled anti-Flk-1 monoclonal antibody (DC1...
Purpose: Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor, fetal liver kinase 1 (Flk-1), play an important role in vascular permeability and tumor angiogenesis. The aim of this study is to evaluate the therapeutic efficacy of $^{131}I$ labeled anti-Flk-1 monoclonal antibody (DC101) on the growth of melanoma tumor, which is known to be very aggressive in vivo. Materials and Methods: Balb/c nude mice were injected subcutaneously with melanoma cells in the right flank. Tumors were allowed to grow up to $200-250\;mm^3$ in volume. Gamma camera imaging and biodistribution studies were performed to identify an uptake of $^{131}I$-DC101 in various organs. Mice with tumor were randomly divided into five groups (10 mice per group) and injected intravenously; control PBS (group 1), $^{131}I$-DC101 $50\;{\mu}g/mouse$ (group 2), non-labeled DC101 $50\;{\mu}g/mouse$ (group 3), $^{131}I$-DC101 $30\;{\mu}g/mouse$ (group 4) and $15\;{\mu}g/mouse$ (group 5) every 3 or 4 days for 20 days. Tumor volume was measured with caliper twice a week. Results: In gamma camera images, the uptake of $^{131}I$-DC101 into tumor and thyroid was increased with time. Biodistribution results showed that the radioactivity of blood and other major organ was gradually decreased with time whereas tumor uptake was increased up to 48 hr and then decreased. After 4th injection of $^{131}I$-DC101, tumor volume of group 2 and 4 was significantly smaller than that group 1. After 5th injection, the tumor volume of group 5 also significantly reduced. Conclusion: These results indicated that delivery of $^{131}I$ to tumor using FlK-1 antibody, DC101, effectively blocks tumor growth in aggressive melanoma xenograft model.
Purpose: Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor, fetal liver kinase 1 (Flk-1), play an important role in vascular permeability and tumor angiogenesis. The aim of this study is to evaluate the therapeutic efficacy of $^{131}I$ labeled anti-Flk-1 monoclonal antibody (DC101) on the growth of melanoma tumor, which is known to be very aggressive in vivo. Materials and Methods: Balb/c nude mice were injected subcutaneously with melanoma cells in the right flank. Tumors were allowed to grow up to $200-250\;mm^3$ in volume. Gamma camera imaging and biodistribution studies were performed to identify an uptake of $^{131}I$-DC101 in various organs. Mice with tumor were randomly divided into five groups (10 mice per group) and injected intravenously; control PBS (group 1), $^{131}I$-DC101 $50\;{\mu}g/mouse$ (group 2), non-labeled DC101 $50\;{\mu}g/mouse$ (group 3), $^{131}I$-DC101 $30\;{\mu}g/mouse$ (group 4) and $15\;{\mu}g/mouse$ (group 5) every 3 or 4 days for 20 days. Tumor volume was measured with caliper twice a week. Results: In gamma camera images, the uptake of $^{131}I$-DC101 into tumor and thyroid was increased with time. Biodistribution results showed that the radioactivity of blood and other major organ was gradually decreased with time whereas tumor uptake was increased up to 48 hr and then decreased. After 4th injection of $^{131}I$-DC101, tumor volume of group 2 and 4 was significantly smaller than that group 1. After 5th injection, the tumor volume of group 5 also significantly reduced. Conclusion: These results indicated that delivery of $^{131}I$ to tumor using FlK-1 antibody, DC101, effectively blocks tumor growth in aggressive melanoma xenograft model.
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문제 정의
1 소프트웨어 (Oak Rigde Associated University)의 Nodule Module을 이용하여 얻었다.10) 종양 마우스 모델에서 계산된 S-value와 residence time으로부터 종양에 방사능이 30 Gy조사되기 위한 131I-DC101의 I-131 의 양을 계산하고 항체의 양에 따른 치료효과를 알아보고자 하였다.
3개의 수용체가 알려져 있는데 그 중에서도 VEGFR2 (Flk-1/KDR)가 종양 angiogenesis에 매우 밀접하게 관련한 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 마우스 Flk-1 항체로 알려진 DC101 에 I-131 을 표지하여 매우 공격적인 종양으로 알려진 흑색종의 치료 정도를 확인해 보고자 하였다. 방법 : 하이브리도마 세포에서 Flk-1 항체인 DC101 을 분리하여 western blot, ELISA, maldi-tof 방법을 이용하여 순도를 확인하고 항체 에 chloramin T를 이용하여 I-131 을 표지하였다.
치료효과가 있는 정맥주사량의 결정을 위해 시행한 예비실험결과에서는 흑색종에서 DC101 50 μg의 정맥주사로는 치료효과를 유도할 수 없을 것으로 판단하였다. 이러한 예비실험결과를 바탕으로 본 연구에서는 정맥 내 주사량을 DC101 50 μg 이하로 결정하여 I-131에 의한 치료효과 여부를 확인하여 보기로 하였다. 본 연구에서도 예비실험결과와 마찬가지로 I-131 이 표지되지 않은 DC101 50 μg의 농도로는 역시 유의한 치료효과를 보이지 않았다(Fig.
이번 연구에서는 Flk-1의 항체인 DC101에 I-131을 표지하여 항체의 표적성, 표지된 방사성핵종의 베타입자의 치료능 그리고 주변세포에 대한 방관자효과(bystander effect)에 의해 흑색종의 성장이 억제되는지를 확인하고자 하였다.
8,9)치료에 적당한 베타입자를 방출하는 방사성핵종 중에서도 I-131은 항체 표지법이 잘 정립된 방사성핵종일 뿐 아니라 구하기도 쉽고 치료뿐 아니라 영상도 얻을 수 있는 장점이 있어 널리 사용되고 있다. 저자들은 이번 연구에서 anti-Flk-1 항체인 DC101 에 H31 을 표지하여 매우 공격적인 마우스 흑색종에서 면역치료의 효능이 뚜렷하지 않는 정도의 항체양을 이용하여 방사면역치료를 시행하였을 때 흑색종의 성장억제 효과가 있는지를 알아보고자 하였다.
제안 방법
우선 131I-DC101의 생 체내 분포를 확인하기 위하여 주사 후 1시간, 6시간. 24시간, 48시간, 72시간에 5마리씩 희생시켜 전체 조직의 %ID/g을 구하였다. 또한 131I-DC101의 종양섭취를 확인하기 위하여 감마카메라 영상을 78시간까지 획득하였다.
을 각각 꼬리정맥으로 투여하였다. 3일 간격으로 5회 걸쳐 투여를 하였고, 각군당 마우스는 10마리를 시행하였다. 종양의 크기는 calipers를 이용하여 한 주에 2번씩 확인하였고, 종양 볼륨은 π/6×(large diameter)2× (small diameter) 의 식을 이용하여 계산하였다.
1군은 PBS만을, 2군은 131I-DC101 50 μg(200 μCi) 을, 3군은 DC101 50 μg을, 4군은 131I-DC101 30 μg(200 μCi) 을. 5군은 131I-DC101 15 μg(200 μCi)을 각각 매 3일 ~ 4일마다 주사하고 전체 5회를 주사하였고 종양볼륨을 측정하였다. 결과: 131I-DC101 을 흑색종 모델에 정맥주사하고 78시간까지 영상을 얻은 결과 시간에 따라 종양섭취가 증가하는 영상을 보였다.
1 M)로 씻어낸 후 농도는 280 run UV spectrometer를 이용하여 즉정하였고 western blotting을 이용하여 항체순도를 확인하였으며 Maldi-Tof 장비(KBSI, Jeonju, Korea)를 이용하여 분자량을 확인하였다. 96 well에 Flk-1 (recombinant mouse/Fc chimera, R&D systems)를 4℃ 에서 16시간 이상 코팅하고 3번 씻어낸 후 DC101 을 농도별로 각각 처리하여 binding assay 를 시행하였다. HRP가 결합된 2차 항체 (Rabbit polyclonal antibody to mouse, conjugated HRP, Nobus)를 처리 후 TMB kit (Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 발색시킨 뒤 520 nm에서 측정하였다.
DC101 항체 15 μg, 30 μg, 50 μg 에 Na131I 200 μCi 를 표지하고 실온에서 생리식염수를 이동상으로 사용하여 표지 안정성을 평가하였다. 24시간까지 확인한 결과 90% 이상의 표지 효율을 보였다(Fig.
HRP가 결합된 2차 항체 (Rabbit polyclonal antibody to mouse, conjugated HRP, Nobus)를 처리 후 TMB kit (Pierce, Rockford, IL)를 이용하여 발색시킨 뒤 520 nm에서 측정하였다. Inhibition assay를 하기 위하여 Flk-1 을 코팅하고 여기에 DC101과 VEGF165를 (PeptroTech, Rocky Hill, NJ) 각각 농도별로 처리하여 결합 억제 정도를 확인하였다. DC1CI1에 chloramine-T 법을 이용하여 방사성옥소(I-131)를 표지하였다.
Figure 5. Treatment with 131I-DC101 Inhibits growth of melanama Groups of nude mice bearing B16 tumors were treated intravenously with PBS, DC101 50 μg, or 131I-DC101 (15 μg, 30 μg, and 50 μg) every 3 or 4 days for 20 days. Administration of DC 101 50 ㎍ did not affect tumor growth.
그런 다음 Tris 완충용액으로 씻어내고 streptavidin-biotin conjugate 용액에 10분간 반응시켰다. Tris 완충용액으로 씻어내고 chromogen substrate를 이용하여 발색하였고, 헤마톡실린으로 대조염색하고 봉입한 후 광학현미경으로 관찰하였다.
27 nM임 과 3%ID/g의 종양표적성을 갖는 결과를 가지고 추정하였을 때 복강내에 800 Hg 정도를 주사하여야 함을 계산을 통해 알 수 있었고, 이는 기존의 생체적용 연구결과들에서 실제 효과를 나타낸 항체량과 비슷한 정도였다. 그러나 이러한 양은 앞에서도 언급하였듯이 많은 양의 항체이고 주사경로에도 제한점이 있었기 때문에 흑색종에서의 복강주사량과 정맥주사량과의 관계를 정립하기 위해 예비실험으로 흑색종을 4개 군으로 나누어서 각각 PBS, DC101 50 μg, DC101 100 μg, DC101 150 μg을 정맥 주사하여 치료효과를 확인하였다. 사전실험 방법을 간단히 언급하면, 전체 5회 항체를 주사하였고 9 회 걸쳐 종양체적을 측정하였으며 각 군의 개체수는 5마리씩 이었다.
방법 : 하이브리도마 세포에서 Flk-1 항체인 DC101 을 분리하여 western blot, ELISA, maldi-tof 방법을 이용하여 순도를 확인하고 항체 에 chloramin T를 이용하여 I-131 을 표지하였다. 누드 마우스에 B16F10 세포를 주사하여 흑색종 모델을 만들고 평균 200-250 mm3 으로 키워 131DC101을 주사하여 영상과 시간별 장기섭취율(%ID/g)을 비교하고, 종양내 Flk-1 발현을 확인하기 위하여 면역염색 등을 시행하였다. 흑색종 동물모델을 5개 군으로 나누어 각각 치료를 시행하였다.
24시간, 48시간, 72시간에 5마리씩 희생시켜 전체 조직의 %ID/g을 구하였다. 또한 131I-DC101의 종양섭취를 확인하기 위하여 감마카메라 영상을 78시간까지 획득하였다. 항체에 표지하여 주사할 I-131의 방사능량을 결정하기 위해 생체 내 분포의 종양 섭취 정도를 참고하였다.
본 연구에서는 마우스 Flk-1 항체로 알려진 DC101 에 I-131 을 표지하여 매우 공격적인 종양으로 알려진 흑색종의 치료 정도를 확인해 보고자 하였다. 방법 : 하이브리도마 세포에서 Flk-1 항체인 DC101 을 분리하여 western blot, ELISA, maldi-tof 방법을 이용하여 순도를 확인하고 항체 에 chloramin T를 이용하여 I-131 을 표지하였다. 누드 마우스에 B16F10 세포를 주사하여 흑색종 모델을 만들고 평균 200-250 mm3 으로 키워 131DC101을 주사하여 영상과 시간별 장기섭취율(%ID/g)을 비교하고, 종양내 Flk-1 발현을 확인하기 위하여 면역염색 등을 시행하였다.
분리한 항체는 ultracentrifugal filter (Millipore, Billerica, MA)를이용하여 PBS (pH 7.4, 0.1 M)로 씻어낸 후 농도는 280 run UV spectrometer를 이용하여 즉정하였고 western blotting을 이용하여 항체순도를 확인하였으며 Maldi-Tof 장비(KBSI, Jeonju, Korea)를 이용하여 분자량을 확인하였다. 96 well에 Flk-1 (recombinant mouse/Fc chimera, R&D systems)를 4℃ 에서 16시간 이상 코팅하고 3번 씻어낸 후 DC101 을 농도별로 각각 처리하여 binding assay 를 시행하였다.
그러나 이러한 양은 앞에서도 언급하였듯이 많은 양의 항체이고 주사경로에도 제한점이 있었기 때문에 흑색종에서의 복강주사량과 정맥주사량과의 관계를 정립하기 위해 예비실험으로 흑색종을 4개 군으로 나누어서 각각 PBS, DC101 50 μg, DC101 100 μg, DC101 150 μg을 정맥 주사하여 치료효과를 확인하였다. 사전실험 방법을 간단히 언급하면, 전체 5회 항체를 주사하였고 9 회 걸쳐 종양체적을 측정하였으며 각 군의 개체수는 5마리씩 이었다. 전체 치료 일수는 17일 이었다.
0) 에 슬라이드를 담근 후 전자레 인지를 이용하여 98℃에서 10분간 끓였다. 실온에서 20분간 식힌 후 Tris 완충 용액에 세척하고 조직 절편에 있는 내인성 과산화효소의 활성을 억제시키기 위해 3% 과산화수소를 이용하여 10분간 처리하였다. Tris 완충용액에 세척하고, 비특이 항원을 제거하기 위해 차단 항체를 실온에서 10분간 반응시킨 후 여분의 용액을 제거하였다.
200-250 mm3가 되게 키웠다. 우선 131I-DC101의 생 체내 분포를 확인하기 위하여 주사 후 1시간, 6시간. 24시간, 48시간, 72시간에 5마리씩 희생시켜 전체 조직의 %ID/g을 구하였다.
3일 간격으로 5회 걸쳐 투여를 하였고, 각군당 마우스는 10마리를 시행하였다. 종양의 크기는 calipers를 이용하여 한 주에 2번씩 확인하였고, 종양 볼륨은 π/6×(large diameter)2× (small diameter) 의 식을 이용하여 계산하였다.
치료효과를 평가하기 위하여 200-250 mm3 크기의 종양 마우스를 5개 군으로 나누어 1군은 PBS를, 2군은 131I-DC101 50 μg (200 uCi), 3군은 DC101 50 μg, 4군은 131I-DC101 30 μg (200 uCi), 5군은 131I-DC101 15 ug (200 uCi) 을 각각 꼬리정맥으로 투여하였다. 3일 간격으로 5회 걸쳐 투여를 하였고, 각군당 마우스는 10마리를 시행하였다.
DC1CI1에 chloramine-T 법을 이용하여 방사성옥소(I-131)를 표지하였다. 표지효율은 실온에서 생리식염수를 이용하여 24시간까지 확인하였다.
또한 131I-DC101의 종양섭취를 확인하기 위하여 감마카메라 영상을 78시간까지 획득하였다. 항체에 표지하여 주사할 I-131의 방사능량을 결정하기 위해 생체 내 분포의 종양 섭취 정도를 참고하였다. Residence timee 반감기/In 2, 131I-DClOl의 종양에 대한 S-value는 MIRDOSE 3.
누드 마우스에 B16F10 세포를 주사하여 흑색종 모델을 만들고 평균 200-250 mm3 으로 키워 131DC101을 주사하여 영상과 시간별 장기섭취율(%ID/g)을 비교하고, 종양내 Flk-1 발현을 확인하기 위하여 면역염색 등을 시행하였다. 흑색종 동물모델을 5개 군으로 나누어 각각 치료를 시행하였다. 1군은 PBS만을, 2군은 131I-DC101 50 μg(200 μCi) 을, 3군은 DC101 50 μg을, 4군은 131I-DC101 30 μg(200 μCi) 을.
대상 데이터
사용하였다. RPMI-1640, fetal bovine serum, penicillin- streptomycin등 세포 배양용 시약들은 GIBCO BRL (Grand Island. USA)에서 구입하였다. 동물실험은 생후 5 주령, 체중 20 gm 암컷 누드 마우스 (Orient-Bio, Seoul, Korea)를 사용하였다.
실험에 사용된 마우스 흑색종인 B16F10 세포주와 마우스 혈관내피세포성장인자 수용체2(Flk-1)의 단일클론항체를(DC101) 분비하는 하이브리도마를 American Type Culture Collection (HB-11534, Rockville, MA)에서 구입하여 사용하였다. RPMI-1640, fetal bovine serum, penicillin- streptomycin등 세포 배양용 시약들은 GIBCO BRL (Grand Island.
데이터처리
SPSS 11.0의 One-way ANOVA 방법을 이용하여 각 실험군 간에 유의한 차이가 있는지 검정하였다. 통계값은 mean±SD로 표시하였다 P 값 0.
이론/모형
Inhibition assay를 하기 위하여 Flk-1 을 코팅하고 여기에 DC101과 VEGF165를 (PeptroTech, Rocky Hill, NJ) 각각 농도별로 처리하여 결합 억제 정도를 확인하였다. DC1CI1에 chloramine-T 법을 이용하여 방사성옥소(I-131)를 표지하였다. 표지효율은 실온에서 생리식염수를 이용하여 24시간까지 확인하였다.
성능/효과
6시간. 24시간, 48시간, 72시간 장기섭취율을 비교한 결과 시간에 따라 혈액내 방사능치가 서서히 감소하였고 다른 장기의 섭취도 시간에 따라 감소하였고 종양의 섭취는 48시간까지 증가하였다가 그 이후는 감소하였다. 흑색종 동물모델에 131I-DC101 치료를 시행한 결과 3 번째 주사까지는 각군간의 유의한 차이를 보이지 않다가 4번째 주사를 시행한 때부터 1군과 2군, 또는 1군과 4군 간의 유의한 차이를 보이기 시작했다.
평가하였다. 24시간까지 확인한 결과 90% 이상의 표지 효율을 보였다(Fig. 2).
전체 치료 일수는 17일 이었다. 4회 주사 후 2일째 측정한 결과 식염수를 주사한 군과 100 μg, 150 μg 주사한 군에서 각각 유의한 차이를 보였으나(*P=0.036, **P= 0.032), 5회 주사 후에는 어느군에서도 유의한 차이를 보이지 않았다. 치료효과가 있는 정맥주사량의 결정을 위해 시행한 예비실험결과에서는 흑색종에서 DC101 50 μg의 정맥주사로는 치료효과를 유도할 수 없을 것으로 판단하였다.
011 이었다. 5번째 주사한 후 종양체적증가 억제는 PBS를 주사한 군과 비교하여 2군과 4군, 5군에서 의의 있는 억제효과를 보였다. 5번째 주사 후 대조군에 비해 2군과 4군, 5군에서 각각 0.
5군은 131I-DC101 15 μg(200 μCi)을 각각 매 3일 ~ 4일마다 주사하고 전체 5회를 주사하였고 종양볼륨을 측정하였다. 결과: 131I-DC101 을 흑색종 모델에 정맥주사하고 78시간까지 영상을 얻은 결과 시간에 따라 종양섭취가 증가하는 영상을 보였다. 시간대별 장기섭취를 정확히 확인하기 위하여 1시간.
또한 5번째 주사 이후에는 5군에서도 유의한 차이를 보여 I-131에 의한 효과가 뚜렷해 짐을 확인하였다. 결론 : 마우스 Flk-1 항체로 알려진 DC101 을 흑색종 모델에 정맥내 주사 하였을 때, 종양성장억제 효과를 보이지 않는 항체양에서도 I-131 을 표지하여 치료를 시행했을 경우에는 효율적인 종양성장억제 효과를 보였다.
본 연구결과는 경우에따라서 개체별로 충분한 양의 항체가 전달되지 않더라고 방사면역치료를 시행하는 경우에는 치료효과를 충분히 볼 수 있다고 증명하였다는데 그 의의가 있을 것이라 사료된다. 결론적으로, anti-Flk-1 항체에 I-131 을 이용한 방사면역치료는 신생혈관형성을 억제하는 항체 자체 효과가 나타나지 않는 정도의 항체 양에서도 항체에 의해 신생혈관 및 종양세포에 I-131 이 축적되게 됨으로써 방사능에 의한 치료 효과가 발생하게 됨을 확인할 수 있었다.
27 nM 이었다. 누드 마우스에 키운 흑색종 종양조직과 흑색종 세포를 각각 western blot 분석을 한 결과 약 170 kDa에 해당된 부위에서 밴드가 관찰되어 종양조직과 세포에 Flk-1 가 발현되어 있음을 확인하였다(Fig. 1B). 조직에서 발현이 좀더 낮아 보이는 이유는 종양세포 외에 종양조직을 구성하는 다른 단백질들의 존재로 세포에서 보여지는 발현정도 보다는 낮게 관찰된 것으로 해석된다.
이는 I-131 DC101을 이용하여 흑색종 종양 모델에서 방사면역치료를 시도하였을 때 유의한 치료 효과가 없는 항체 양임에도 불구하고 I-131 을 이용한 방사면역치료의 경우 종양성장이 대조군에 비해 유의미하게 억제됨을 알 수 있었다. 또한 5회 투여 후에는 DC101 15 μg에 I-131 을 표지한 군에서도 유의한 차이를 보이기 시작해서 I-131 에 의한 효과가 확실해 짐을 확인할 수 있다.
이러한 예비실험결과를 바탕으로 본 연구에서는 정맥 내 주사량을 DC101 50 μg 이하로 결정하여 I-131에 의한 치료효과 여부를 확인하여 보기로 하였다. 본 연구에서도 예비실험결과와 마찬가지로 I-131 이 표지되지 않은 DC101 50 μg의 농도로는 역시 유의한 치료효과를 보이지 않았다(Fig. 5). 그러나 DC101 30 ng과 50 μg에 I-131 을 표지한 군에서는 4회 투여부터는 유의한 차이를 보이기 시작했다.
그러나 아직까지 항체의 복강주사량에 의한 효과를 보고한 예는 많지만 이와 정맥주사량의 관계에 대한 연구를 찾아보기는 힘들었다. 본 연구자들은 흑색종 종양세포에서 주사한 항체가 복강을 통해 혈액내로 모두 흡수된다는 것을 전제로 IC50값이 9.27 nM임 과 3%ID/g의 종양표적성을 갖는 결과를 가지고 추정하였을 때 복강내에 800 Hg 정도를 주사하여야 함을 계산을 통해 알 수 있었고, 이는 기존의 생체적용 연구결과들에서 실제 효과를 나타낸 항체량과 비슷한 정도였다. 그러나 이러한 양은 앞에서도 언급하였듯이 많은 양의 항체이고 주사경로에도 제한점이 있었기 때문에 흑색종에서의 복강주사량과 정맥주사량과의 관계를 정립하기 위해 예비실험으로 흑색종을 4개 군으로 나누어서 각각 PBS, DC101 50 μg, DC101 100 μg, DC101 150 μg을 정맥 주사하여 치료효과를 확인하였다.
3). 생체내 분포를 확인한 결과 혈액내 방사능치는 시간에 따라 점점 감소하였고 다른 장기들도 비슷한 양상을 보였다. 종양 섭취는 48시간째에는 2.
1A). 억제 실험(Inhibition study)을 시행한 결과 VEGF 농도에 따라 DC101 이 Flk-1에 결합되는 정도가 감소되는 것을 확인할 수 있었다. IC50 값은 9.
그러나 DC101 30 ng과 50 μg에 I-131 을 표지한 군에서는 4회 투여부터는 유의한 차이를 보이기 시작했다. 이는 I-131 DC101을 이용하여 흑색종 종양 모델에서 방사면역치료를 시도하였을 때 유의한 치료 효과가 없는 항체 양임에도 불구하고 I-131 을 이용한 방사면역치료의 경우 종양성장이 대조군에 비해 유의미하게 억제됨을 알 수 있었다. 또한 5회 투여 후에는 DC101 15 μg에 I-131 을 표지한 군에서도 유의한 차이를 보이기 시작해서 I-131 에 의한 효과가 확실해 짐을 확인할 수 있다.
저자들은 이번 실험에서 Figure 3에서와 같이 항체에 H31 을 표지하여 종양 표적성 여부 및 표적 지속시간대를 먼저 파악하였는데 3일 이상 지속적으로 표적성이 유지되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 I-131 표지 항체에 의해 충분한 양의 방사능이 전달되면 방사능치료 효과가 예상되는 결과라고 생각할 수 있다.
이는 I-131 표지 항체에 의해 충분한 양의 방사능이 전달되면 방사능치료 효과가 예상되는 결과라고 생각할 수 있다. 정확한 종양 표적성은 생체 내 분포 실험을 진행하여 Table 1과 Figure 4에 정리된 결과와 같이 DC101 을 정맥주사하였을 때 흑색종 종양 모델에서 약 3%ID/g의 종양 표적성이 있음을 파악하였다. 그러나 아직까지 항체의 복강주사량에 의한 효과를 보고한 예는 많지만 이와 정맥주사량의 관계에 대한 연구를 찾아보기는 힘들었다.
032), 5회 주사 후에는 어느군에서도 유의한 차이를 보이지 않았다. 치료효과가 있는 정맥주사량의 결정을 위해 시행한 예비실험결과에서는 흑색종에서 DC101 50 μg의 정맥주사로는 치료효과를 유도할 수 없을 것으로 판단하였다. 이러한 예비실험결과를 바탕으로 본 연구에서는 정맥 내 주사량을 DC101 50 μg 이하로 결정하여 I-131에 의한 치료효과 여부를 확인하여 보기로 하였다.
항체를 분리하여 분자량분석을 시행한 결과 147,650 Da 이었고, ELISA binding affinity 분석결과 Kd 값은 3.05 pM 이였다(Fig. 1A). 억제 실험(Inhibition study)을 시행한 결과 VEGF 농도에 따라 DC101 이 Flk-1에 결합되는 정도가 감소되는 것을 확인할 수 있었다.
참고문헌 (10)
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