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문제 정의
- 몇가지 알려진 연부조직 육종에 대한 면역 조직화학적 예후인자 들이 있지만 상반된 연구도 있고 G1/S phase관계되는 인자에 대한 연구는 거의 없는 상태이다. 따라서 저자는 Tissue microarray technique 와 면역조직염색을 이용하여 연부조직 육종의 재발 및 전이와 관계된 G1/S phase 세포조절주기 단백의 면역화학적 예후인자를 알아보고자 하였다.
- 따라서 조직 검사시 이들 표식자들의 적절한 사용이 환자의 예후를 예측하고 치료의 범위와 추가적인 치료 방법를 결정하는데 중요한 도움을 줄 수 있을 것이다. 특히 연부조직 육종에서 Cyclin E 와 E2F-1같은 G1/S주기 단백에 대한 보고는 매우 드물어서 본 연구를 통해 Cyclin E와 E2F1의 연부조직육종의 발생과정에서의 역할과 예후인자로서의 가능성을 제시하고자 한다.
제안 방법
- 2장의 조직 미세배열 슬라이드를 각각 4 μm 두께의 절편을 얻어 xylene으로 탈파라핀한 후 여러 농도로 희석한 알코올로 함수과정을 거친 후 0.01 M citrate buffer (pH 6.0)에 넣고 가압증기멸균기(autoclave)에서 120℃로 15분간 가열하여 항원성을 증가시켰다.
- 단, p16INK 4a의 경우 세포질에 염색이 동반된 경우도 함께 양성으로 판정하였다. Cyclin D1, Cyclin E, CDK4, CDK2, E2F-1, p53은 종양세포의 양성율이 10% 이상인 경우를 양성인 것으로 분류하였다. Rb, p16INK4a, p27은 종양세포의 10% 미만으로 염색되는 경우를 음성, 10~49%인 경우 불균질 양상, 50%이상은 양성으로 판정하였는데, 음성 또는 불균질 양상인 경우 발현 감소군으로 하였다.
- 각 항체에 대한 양성 대조군으로 Cyclin D1은 유방암종 조직, Cyclin E는 태반 조직, CD4는 정상 피부조직, p16INK4a와 p53은 대장암종 조직, CDK2, Rb, E2F-1, Ki-67은 편도 조직을 각각 이용하였고, 음성 대조군으로는 일차 항체 대신 PBS를 사용하였다.
- 괴사나 출혈이 없고 조직의 보존이 양호한 부위를 슬라이드에 표시하여 해당 부위를 다시 블록에 표시한 후 채취하였는데, Beecher instrument (Silver Springs, MD, USA)를 이용하였으며, 1.5 mm 직경의 펀치로 모두 2장의 조직배열 블록을 제작하였다. 블록의 표면을 고르게 하고, 코어 조직과 공여 블록사이의 파라핀 결합이 충분히 되도록 하기 위해 45℃에서 1시간 둔 후 뒤집어 약간의 무게를 주면서 다시 10분 incubation한 다음 4℃에 두어 파라핀이 잘 응고될 수 있도록 하였다.
- 총 43예의 대표적인 파라핀 포매괴를 선택하여 조직 미세배열(tissue microarray) 슬라이드를 제작하였고 G1/S 세포주기 조절단백에 관한 면역조직화학염색을 실시하여 평가하였다. 그리고, 추적 관찰이 가능한 39예를 대상으로 이들 단백 발현 유무와 재발 및 전이와의 상관관계를 분석하였다.
- 본 연구에서 G1/S 세포 주기 조절단백들의 발현에 관한 결과는 다음과 같고(Table 1, 2), 이들 단백들간의 상관관계를 분석하였다(Table 3). 그리고, 추적 관찰이 가능했던 39예에서 종양의 재발 또는 전이와 이들 단백들간의 상관관계를 분석하였다(Table 4).
- 면역조직화학염색은 avidin-biotin peroxidase 방법인 Vectastain ABC elite kit (Vector laboratories, Burlingame, CA, USA)를 사용하였다. 먼저 5% 정상 염소혈청으로 비특이적인 항원항체반응을 억제시킨 후, 일차항체인 Cyclin D1(Lab Vision, USA), CyclinE (Lab Vision, USA), CDK4 (Santa Cruz, CA), CDK (Lab Vision, USA), p16 (Lab Vision, USA), p27 (Lab Vision, USA), Rb (Dako, USA), E2F-1(Santa Cruz, CA), p53 (Dako, USA), Ki-67(Dako, USA)를 1:100으로 희석하여 사용하였다. 발색은 Diaminobenzidine (DAB)로 하였으며 대조염색은 Mayer hematoxylin을이용하였다.
- 술 전 항암 치료를 시행한 례는 없었으며, 술 후 항암 치료를 시행한 모든 례에서 방사선 치료를 병행하였다. 모든 조직은 광학 현미경 하에서 재검경하여 병리 진단을 확인하였고, FNCLCC 체계에 의하여 조직학적 등급을 결정하였으며, 환자의 임상 기록을 검토하여 재발, 전이 및 생존 여부를 추적 조사하였다. 추적 조사가 가능한 예는 총 39예였고, 최소 18개월부터 98개월 동안의 경과 관찰 중 국소 재발이 8예, 전이가 16예에서 관찰되었으며, 국소 재발과 전이가 모두 일어난 경우가 2예 있었다.
- 5%)였다. 본 연구에서 G1/S 세포 주기 조절단백들의 발현에 관한 결과는 다음과 같고(Table 1, 2), 이들 단백들간의 상관관계를 분석하였다(Table 3). 그리고, 추적 관찰이 가능했던 39예에서 종양의 재발 또는 전이와 이들 단백들간의 상관관계를 분석하였다(Table 4).
- 앞서 언급한 연부조직육종의 예후 인자 외에도 술 후 시행되는 항암치료 및 방사선 치료는 환자의 예 후에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 22례의 환자에서 술 후 항암 치료와 방사선 치료를, 40례의 환자에서 술 후 방사선 치료를 시행하였다. 하지만 술 후 국소 재발이나 전이의 빈도에 있어 방사선치료나 항암 치료의 영향은 없었다.
- 블록의 표면을 고르게 하고, 코어 조직과 공여 블록사이의 파라핀 결합이 충분히 되도록 하기 위해 45℃에서 1시간 둔 후 뒤집어 약간의 무게를 주면서 다시 10분 incubation한 다음 4℃에 두어 파라핀이 잘 응고될 수 있도록 하였다. 블록 제작 후 1장의 H-E 슬라이드를 만들어 공여 조직과 비교하였다.
- 5 mm 직경의 펀치로 모두 2장의 조직배열 블록을 제작하였다. 블록의 표면을 고르게 하고, 코어 조직과 공여 블록사이의 파라핀 결합이 충분히 되도록 하기 위해 45℃에서 1시간 둔 후 뒤집어 약간의 무게를 주면서 다시 10분 incubation한 다음 4℃에 두어 파라핀이 잘 응고될 수 있도록 하였다. 블록 제작 후 1장의 H-E 슬라이드를 만들어 공여 조직과 비교하였다.
- 증례는 지방육종 15예, 악성 섬유성조직구증 13예, 횡문근육종 5예, 활막육종 5예, 평활근육종 3예, 섬유육종 2예였다. 수술 전에 방사선 요법이나 화학 요법을 받은 예는 연구 대상에 포함하지 않았으며, 모든 환자들은 수술 전 조직 검사상 악성으로 진단되어 광범위 절제술을 시행하였다. 술 후 항암 치료를 시행한 례는 22례, 술 후 방사선 치료만 시행한 례는 18례 였다.
- 술 후 항암 치료를 시행한 례는 22례, 술 후 방사선 치료만 시행한 례는 18례 였다. 술 전 항암 치료를 시행한 례는 없었으며, 술 후 항암 치료를 시행한 모든 례에서 방사선 치료를 병행하였다. 모든 조직은 광학 현미경 하에서 재검경하여 병리 진단을 확인하였고, FNCLCC 체계에 의하여 조직학적 등급을 결정하였으며, 환자의 임상 기록을 검토하여 재발, 전이 및 생존 여부를 추적 조사하였다.
- 종양세포의 핵에 갈색으로 염색될 때 양성으로 판정하였고, 각 증례들에서 양성으로 염색된 세포와 전체 종양 세포의 비율을 관찰하였다. 단, p16INK 4a의 경우 세포질에 염색이 동반된 경우도 함께 양성으로 판정하였다.
- 추적 조사가 가능한 예는 총 39예였고, 최소 18개월부터 98개월 동안의 경과 관찰 중 국소 재발이 8예, 전이가 16예에서 관찰되었으며, 국소 재발과 전이가 모두 일어난 경우가 2예 있었다. 총 43예의 대표적인 파라핀 포매괴를 선택하여 조직 미세배열(tissue microarray) 슬라이드를 제작하였고 G1/S 세포주기 조절단백에 관한 면역조직화학염색을 실시하여 평가하였다. 그리고, 추적 관찰이 가능한 39예를 대상으로 이들 단백 발현 유무와 재발 및 전이와의 상관관계를 분석하였다.
대상 데이터
- 1998년 1월부터 2005년 12월까지 수술로써 절제된 연부조직 육종 중 파라핀 블록의 보존상태가 양호한 43예를 대상으로 하였다. 증례는 지방육종 15예, 악성 섬유성조직구증 13예, 횡문근육종 5예, 활막육종 5예, 평활근육종 3예, 섬유육종 2예였다.
- 먼저 5% 정상 염소혈청으로 비특이적인 항원항체반응을 억제시킨 후, 일차항체인 Cyclin D1(Lab Vision, USA), CyclinE (Lab Vision, USA), CDK4 (Santa Cruz, CA), CDK (Lab Vision, USA), p16 (Lab Vision, USA), p27 (Lab Vision, USA), Rb (Dako, USA), E2F-1(Santa Cruz, CA), p53 (Dako, USA), Ki-67(Dako, USA)를 1:100으로 희석하여 사용하였다. 발색은 Diaminobenzidine (DAB)로 하였으며 대조염색은 Mayer hematoxylin을이용하였다.
- 연부 조직 육종으로 진단된 43례 중에서 술 후 항암치료와 방사선 치료 모두를 시행한 예는 22례, 방사선 치료만을 시행한 예는 18례였다. 3례를 제외하고는 모든 예에서 술 후 방사선 치료를 시행하였고 방사선 치료를 받지 않은 3례에서는 재발이나 전이가 없었다.
- 1998년 1월부터 2005년 12월까지 수술로써 절제된 연부조직 육종 중 파라핀 블록의 보존상태가 양호한 43예를 대상으로 하였다. 증례는 지방육종 15예, 악성 섬유성조직구증 13예, 횡문근육종 5예, 활막육종 5예, 평활근육종 3예, 섬유육종 2예였다. 수술 전에 방사선 요법이나 화학 요법을 받은 예는 연구 대상에 포함하지 않았으며, 모든 환자들은 수술 전 조직 검사상 악성으로 진단되어 광범위 절제술을 시행하였다.
- 총 43예의 연령 분포는 5~81세(평균 53.5세)였고, 남자는 20예이고 여자는 23예였다. 모든 종양을 종양 분화도, 괴사, 유사분열 수에 따라 조직학적 등급을 나누었을 때 1등급이 9예(20.
데이터처리
- 통계학적 처리는 SPSS version 10.0(SPSS Inc., Chicago, USA) 통계프로그램을 이용하여 Pearson Chi-square 검정과 일원배치 분산분석을 이용하였고, Pearson 상관분석을 통하여 변수들의 상관관계를 평가(correlation coefficient, γ)하였다.
이론/모형
- 내인성 peroxidase의 작용 방지를 위해 3% 과산화수소수를 이용하여 30분간 처리하였다. 면역조직화학염색은 avidin-biotin peroxidase 방법인 Vectastain ABC elite kit (Vector laboratories, Burlingame, CA, USA)를 사용하였다. 먼저 5% 정상 염소혈청으로 비특이적인 항원항체반응을 억제시킨 후, 일차항체인 Cyclin D1(Lab Vision, USA), CyclinE (Lab Vision, USA), CDK4 (Santa Cruz, CA), CDK (Lab Vision, USA), p16 (Lab Vision, USA), p27 (Lab Vision, USA), Rb (Dako, USA), E2F-1(Santa Cruz, CA), p53 (Dako, USA), Ki-67(Dako, USA)를 1:100으로 희석하여 사용하였다.
성능/효과
- CDK2의 발현은 총 43예 중 33예(76.7%)에서 양성을 보여 가장 높은 양성율을 보였다. 종양의 유형별로 살펴보면, 지방육종 14예(93.
- Cyclin D1의 발현은 총 43예 중 25예(58.1%)에서 양성이었고, 이 중 지방육종 6예(40.0%), 악성 섬유 조직구증 9예(69.2%), 횡문근육종 3예(60.0%), 활막육종 4예(80.0%), 평활근육종 1예(33.3%), 그리고 섬유육종 2예(100%)였다. 종양의 종류에 따른 양성율의 차이는 없었다(chi-square test, p=0.
- Cyclin E은 18예(41.9%)에서 양성이었고, 이 중 지방육종 9예(60.0%), 악성 섬유조직구증 6예(46.2%), 횡문근육종 1예(20.0%), 활막육종 0예(0%), 평활근육종 2예(66.7%), 그리고 섬유육종 0예(0%)였다. 종양의 종류에 따른 양성율의 차이는 없었다(chi-square test, p=0.
- 666). E2F-1 단백은 종양이 재발한 경우 6예(75.0%)에서 양성을 보였고 재발하지 않은 경우 11예(35.56%)에서 양성을 보였으며, 종양이 재발한 6예 중 술 후 항암치료와 방사선 치료를 받은 경우가 3예, 술 후 방사선 치료만 받은 경우가 3예였고, E2F-1 단백의 발현과 종양의 재발은 유의한 상관성을 보였다(p=0.046). 종양이 전이한 경우 7예(43.
- Cyclin D1, Cyclin E, CDK4, CDK2, E2F-1, p53은 종양세포의 양성율이 10% 이상인 경우를 양성인 것으로 분류하였다. Rb, p16INK4a, p27은 종양세포의 10% 미만으로 염색되는 경우를 음성, 10~49%인 경우 불균질 양상, 50%이상은 양성으로 판정하였는데, 음성 또는 불균질 양상인 경우 발현 감소군으로 하였다. Ki67은 양성세포의 백분율을 계산하여 Ki-67 표지지수(Ki-67 labeling index, LI)로 하였다.
- 많은 연구에서 높은 Ki-67 수치는 나쁜 예후와 연관이 있어왔다3,13,15-17,34). 그러나 cut-off level이 10%에서 30%까지 다르게 사용되어 졌고 해석된 것이 평균인지 최대값인지 또는 채취된 지역이 증식지역인지 바깥지역인 지에 따라 다르게 해석되었다. 본 연구에서는 Ki-67은 종양의 등급과는 연관이 있었으나 국소재발이나 전이에 따른 예후에는 영향이 없었다.
- 그러나, 종양이 전이한 경우 7예(43.8%)에서 양성을 보이는 반면 종양이 전이하지 않은 경우 3예(13.0%)에서만 양성을 보였으며, 종양이 전이한 7예 중 술 후 항암치료와 방사선 치료를 받은 경우가 4예, 방사선 치료만 받은 군이 3예였고, 종양의 전이와 CDK4 단백 발현은 통계학적으로 의미있게 증가하였다(p=0.031).
- 수술 전에 방사선 요법이나 화학 요법을 받은 예는 연구 대상에 포함하지 않았으며, 모든 환자들은 수술 전 조직 검사상 악성으로 진단되어 광범위 절제술을 시행하였다. 술 후 항암 치료를 시행한 례는 22례, 술 후 방사선 치료만 시행한 례는 18례 였다. 술 전 항암 치료를 시행한 례는 없었으며, 술 후 항암 치료를 시행한 모든 례에서 방사선 치료를 병행하였다.
- 조직학적 등급 간 비교에서 1등급은 2예(22.2%), 2등급은 4예(28.6%), 3등급은 12예(60.0%)를 보여 종양의 조직학적 등급이 높을수록 양성율이 의미있게 증가하였다(Pearson relative correlation coefficient analysis, p=0.024, γ=0.362).
- 조직학적 등급과 CDK4 단백 발현을 비교하였을 때 1등급은 5예(55.6%), 2등급은 5예(35.7%), 3등급은 3예(15.0%)를 보여 종양의 조직학적 등급이 높을수록 양성율이 감소하는 경향을 보였으나, 통계학적 유의 성은 없었다(Pearson relative correlation coefficient analysis, p=0.115, γ=-0.257).
- 5%)에서 양성으로 발현되었다. 종양의 유형별로 살펴보면, 지방육종 6예(40.0%), 악성 섬유조직구증 6예(46.2%), 횡문근육종 1예(20.0%), 활막육종 4예(80.0%), 평활근육종 1예(33.3%), 그리고 섬유육종 2예(50.0%)에서 양성으로 발현되었다(chisquare test, p=0.209). 조직학적 등급과 E2F-1단백 발현간의 상관관계를 살펴보면, 1등급 4예(44.
- 1%)에서 발현이 저하되었다. 종양이 재발한 2예 모두 술 후 방사선 치료만 받은 경우였으며, 종양이 전이한 10예 중 술 후 항암치료와 방사선 치료를 받은 경우가 5예, 술 후 방사선 치료만 받은 경우가 5예 였다. 모두 통계학적 유의성이 없었다(p=0.
- 5%)에서 발현이 저하되었다. 종양이 재발한 5예 중 술 후 항암치료와 방사선 치료를 받은 경우가 2예, 술 후 방사선 치료만 받은 경우가 3예였으며, 종양이 전이한 8예 중 술 후 항암치료와 방사선 치료를 받은 경우가 4예, 술 후 방사선 치료만 받은 경우가 4예 였으며, 모두 통계학적 유의성이 없었다 (p=0.593, 0.697).
- 5%)에서 양성을 보였다. 종양이 재발한 6예 중술 후 항암 치료와 방사선 치료를 받은 경우는 4예, 방사선 치료만 받은 경우가 2예 였으며, 종양이 전이된 9예 중 술 후 항암 치료와 방사선 치료를 받은 경우는 4예, 방사선 치료만 받은 경우가 5예였다. 모두 통계학적 유의성은 없었다(p=0.
- 3%)에서 양성을 보였다. 종양이 재발한 8예 중 술 후 항암치료와 방사선 치료를 받은 경우가 4예, 술 후 방사선 치료만 받은 경우가 4예였으며, 종양이 전이한 13예 중 술 후 항암치료와 방사선 치료를 받은 경우가 8예, 술 후 방사선 치료만 받은 경우가 5예였고, 모두 통계학적 유의성은 없었다(p=0.113, 0.826).
- 257). 종양이 재발한 경우 1예(12.5%), 재발하지 않은 경우 9예(29.0%)에서 양성을 보였으며, 종양이 재발한 1예는 술 후 방사선 치료만 받은 경우였고, 종양의 재발과 CDK4 단백 발현간의 통계학적의 연관성은 없었다(p=0.353).
- 158). 종양이 재발한 경우 2예(25.0%), 재발 하지 않은 경우 13예(41.9%), 종양이 전이한 경우 8예(50.0%), 종양이 전이하지 않은 경우 7예(30.4%)에서 양성을 보였고, 종양이 재발한 2예 중 술 후 항암치료와 방사선 치료를 받은 경우가 1예, 술 후 항암치료와 방사선 치료를 받지 않은 경우가 1예였고, 종양이 전이한 8예 중 술 후 항암치료와 방사선 치료를 받은 경우가 4예, 술 후 방사선 치료만 받은 경우가 4예였으며, 모두 통계학적 유의성을 보이지 않았다(p=0.393, 0.227).
- 890). 종양이 재발한 경우 6예(75.0%), 재발하지 않은 경우에도 17예 (54.8%)에서 발현 저하를 보였고, 종양이 전이한 경우 10예(62.5%), 종양이 전이하지 않은 경우 13예 (56.5%)에서 발현이 저하되었다. 종양이 재발한 6예 중 술 후 항암치료와 방사선 치료를 받은 경우가 3예, 술 후 방사선치료만 받은 경우가 3예였으며, 종양이 전이한 10예 중 술 후 항암치료와 방사선 치료를 받은 경우가 6예, 술 후 방사선 치료만 받은 경우가 4예였다.
- 종양이 재발한 경우 6예(75.0%)에서 양성을 보이지만 재발하지 않은 경우 11예(35.5%)에서만 양성을 보였으며, 종양이 재발한 6예 중 술 후 항암치료와 방사선 치료를 받은 경우는 4예, 방사선 치료만 받은 경우는 2예였고, 종양의 재발과 cyclin E의 발현은 통계학적으로 의미있는 상관성을 보였다(Pearson relative correlation coefficient analysis, p=0.046, γ=0.322).
- 046). 종양이 전이한 경우 7예(43.8%), 종양이 전이하지 않은 경우 10예(43.5%)에서 양성을 보였으며, 종양이 전이한 7예 중 술 후 항암치료와 방사선 치료를 받은 경우가 3예, 술 후 방사선 치료만 받은 경우가 4예였고, E2F-1 단백의 발현과 종양의 전이는 유의한 상관성이 없었다(p=0.987).
- 모든 조직은 광학 현미경 하에서 재검경하여 병리 진단을 확인하였고, FNCLCC 체계에 의하여 조직학적 등급을 결정하였으며, 환자의 임상 기록을 검토하여 재발, 전이 및 생존 여부를 추적 조사하였다. 추적 조사가 가능한 예는 총 39예였고, 최소 18개월부터 98개월 동안의 경과 관찰 중 국소 재발이 8예, 전이가 16예에서 관찰되었으며, 국소 재발과 전이가 모두 일어난 경우가 2예 있었다. 총 43예의 대표적인 파라핀 포매괴를 선택하여 조직 미세배열(tissue microarray) 슬라이드를 제작하였고 G1/S 세포주기 조절단백에 관한 면역조직화학염색을 실시하여 평가하였다.
- 3례를 제외하고는 모든 예에서 술 후 방사선 치료를 시행하였고 방사선 치료를 받지 않은 3례에서는 재발이나 전이가 없었다. 항암치료를 시행 받은 군에서는 국소 재발이 4례, 전이가 9례였으며, 항암치료를 받지 않은 군에서는 국소 재발이 4례, 전이가 7례로 두 군 간에 유의한 통계학적 차이가 없었다.
후속연구
- 연부조직 육종의 면역조직화학염색법을 이용한 G1/S 세포주기 조절단백에 대한 연구 결과 Cyclin E와 E2F-1이 연부조직 육종의 국소 재발과 관련있는 인자였고, CDK4가 전이와 연관 있는 인자였다. 따라서 조직 검사시 이들 표식자들의 적절한 사용이 환자의 예후를 예측하고 치료의 범위와 추가적인 치료 방법를 결정하는데 중요한 도움을 줄 수 있을 것이다. 특히 연부조직 육종에서 Cyclin E 와 E2F-1같은 G1/S주기 단백에 대한 보고는 매우 드물어서 본 연구를 통해 Cyclin E와 E2F1의 연부조직육종의 발생과정에서의 역할과 예후인자로서의 가능성을 제시하고자 한다.
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