피부에서 엘라스틴(elastin)은 중요한 탄력섬유의 구성성분 중의 하나이다. 피부주름(skin wrinkle) 형성은 콜라겐(collagen)의 합성과 분해가 중요한 요인으로 작용한다고 알려져 있지만, 최근 많은 연구에서 엘라스틴의 재형성과 분해 또한 주름형성 기전에서 중요한 작용을 하는 것으로 보고되고 있다. 엘라스타제(elastase)는 엘라스틴을 분해하는 일종의 메탈로프로테이나제(metalloproteinase)이며, 자외선 B (ultraviolet B, UVB) 조사 후에 활성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서 증가된 엘라스타제의 활성은 피부의 탄력성 감소와 주름 형성의 주요한 원인이 될 것이다. 본 연구에서는 항산화 효과가 있으며, 각종 견과류나 과일에 함유된 폴리페놀(polyphenol)성분인 탄닌산(tannic acid)을 사람의 섬유아세포(CCD-25Sk fibroblasts)에 처리하여 엘라스타제 활성과 트로포엘라스틴 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 탄닌산은 농도의존적으로 사람의 섬유아세포 엘라스타제 활성을 유의성 있게 억제시켰다. 그러나 트로포엘라스틴 합성이나 발현증가에는 유의성 있는 효과를 보이지 않았다. 이러한 결과들로부터 탄닌산은 엘라스타제의 활성을 억제시켜 엘라스틴의 3차원적 구조를 유지하는데 기여하는 것으로 사료된다. 따라서 탄닌산은 주름생성을 억제하는 물질로 개발 가능할 것으로 기대된다.
피부에서 엘라스틴(elastin)은 중요한 탄력섬유의 구성성분 중의 하나이다. 피부주름(skin wrinkle) 형성은 콜라겐(collagen)의 합성과 분해가 중요한 요인으로 작용한다고 알려져 있지만, 최근 많은 연구에서 엘라스틴의 재형성과 분해 또한 주름형성 기전에서 중요한 작용을 하는 것으로 보고되고 있다. 엘라스타제(elastase)는 엘라스틴을 분해하는 일종의 메탈로프로테이나제(metalloproteinase)이며, 자외선 B (ultraviolet B, UVB) 조사 후에 활성이 증가하는 것으로 알려져 있다. 따라서 증가된 엘라스타제의 활성은 피부의 탄력성 감소와 주름 형성의 주요한 원인이 될 것이다. 본 연구에서는 항산화 효과가 있으며, 각종 견과류나 과일에 함유된 폴리페놀(polyphenol)성분인 탄닌산(tannic acid)을 사람의 섬유아세포(CCD-25Sk fibroblasts)에 처리하여 엘라스타제 활성과 트로포엘라스틴 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 탄닌산은 농도의존적으로 사람의 섬유아세포 엘라스타제 활성을 유의성 있게 억제시켰다. 그러나 트로포엘라스틴 합성이나 발현증가에는 유의성 있는 효과를 보이지 않았다. 이러한 결과들로부터 탄닌산은 엘라스타제의 활성을 억제시켜 엘라스틴의 3차원적 구조를 유지하는데 기여하는 것으로 사료된다. 따라서 탄닌산은 주름생성을 억제하는 물질로 개발 가능할 것으로 기대된다.
Elastin is an important component of elastic fibers in the skin. Recently, many studies have reported that elastin is also involved In inhibiting or repairing wrinkle formation, although collagen is a major factor in the skin wrinkle formation. Elastase is a metalloproteinase which acts on degradati...
Elastin is an important component of elastic fibers in the skin. Recently, many studies have reported that elastin is also involved In inhibiting or repairing wrinkle formation, although collagen is a major factor in the skin wrinkle formation. Elastase is a metalloproteinase which acts on degradation of elastin. It is known that elastase activity is increased by ultraviolet (UV) B radiation. Thus, Increased elastase activity could be the major reason for skin elasticity reduction and winkle formation. Tannic acid is a polyphenol found in various fruits and nuts. This molecule has a potent ability to eliminate reactive oxygen species and reactive nitrogen species. In the present study, we investigated whether tannic acid has effects on elastase activity and tropoelastin synthesis. Our results showed that tannic acid reduced elastase activity significantly in a dose-dependent manner. However, the expression of tropoelastin protein and mRNA was not significantly affected by tannic acid. From these results, we suggest that tannic acid may contribute to block tortuosity of elastic fibers by inhibiting elastase. Thus, tannic acid might be developed for a possible agent to Inhibit skin aging.
Elastin is an important component of elastic fibers in the skin. Recently, many studies have reported that elastin is also involved In inhibiting or repairing wrinkle formation, although collagen is a major factor in the skin wrinkle formation. Elastase is a metalloproteinase which acts on degradation of elastin. It is known that elastase activity is increased by ultraviolet (UV) B radiation. Thus, Increased elastase activity could be the major reason for skin elasticity reduction and winkle formation. Tannic acid is a polyphenol found in various fruits and nuts. This molecule has a potent ability to eliminate reactive oxygen species and reactive nitrogen species. In the present study, we investigated whether tannic acid has effects on elastase activity and tropoelastin synthesis. Our results showed that tannic acid reduced elastase activity significantly in a dose-dependent manner. However, the expression of tropoelastin protein and mRNA was not significantly affected by tannic acid. From these results, we suggest that tannic acid may contribute to block tortuosity of elastic fibers by inhibiting elastase. Thus, tannic acid might be developed for a possible agent to Inhibit skin aging.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 각종 과일과 견과류의 주요성분이며, 항산화 효과가 있는 폴리페놀(polyphe-nol)로 알려진 탄닌산을 이용하여 사람의 섬유아세포(CCD-25Sk human fibrobla-sts)에서 엘라스타제 활성 억제와 엘라스틴 발현에 대한 탄닌산의 영향을 확인하고자 하였다.
탄닌산이 엘라스타제의 활성을 직접적으로 억제하고, 이러한 효과가 세포상에서도 유효한 것으로 확인됨에 따라 이번에는 주름형성에 관련이 있는 엘라스틴의 발현과 생성에도 작용을 하는지 알아보기 위해 우선, 엘라스틴의 전구체로 알려진 트로포엘라스틴의 mRNA의 수준의 변화를 관찰하였다. 그 결과 탄닌산은 트로포엘라스틴의 mRNA 발현에는 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 RT-PCR을 통해 확인할 수 있었다(Figure 4).
RNA 분석을 위해 세포 내의 total RNA를 섬유아세포 배양으로부터 RNeasy mini kit (Valencia, USA)을 사용하여 추출하였다. RNA의 순도와 무결성은 A26o nm / A280 nm 비율 측정을 통해 확인하였고, RNA 수득률은 260 nm에서 흡광도로 측정하였고, 사용전까지 -70℃ 에서 보관하였다
Primary antibody 는 1 : 500 에서 1 : 1000으로 희석하였고, horseradish conjugated secondary antibody를 사용하여 super-signal west pico chemiluminescent kit (Thermo scientific, USA)으로 발색하였다. 결과는 luminescent image analyzer LAS-1000 (Fujifilm, Canada)으로 분석하였다.
0 * 104 cells를 분주한 후 5 %의 CO2, 37℃ 하에서 24 h 동안 배양하여 세포가 배양 용기 바닥에 부착할 수 있도록 한다. 다음날 태아 소혈청을 제거한 배지로 교환한 다음 다시 24 h 동안 배양한 후, 독성 시험할 탄닌산을 농도별로 처리하고 다시 24 h 동안 배양하여 crystal violet assay로 세포독성을 즉정하였다.
선택적인 억제제의 사용은 합성 자체가 용이하지 않을 뿐만 아니라, 임상적으로 직접 사용하기까지는 많은 연구 과정을 거쳐야 하고 안정성 확인도 필요하다는 단점을 가지고 있다. 따라서, 본 연구에서는 일반적으로 항산화 기능이 있으며, 피부세포 독성 억제 효과가 있고, 많은 견과류나 과일에서 발견되는 폴리페놀인 탄닌산을 이용하여 사람의 피부 섬유아세포주의 엘라스타제 활성 억제 효과를 확인하였다. 탄닌산은 불용 해성의 소와 돼지의 엘라스틴에 부착되어 특히, 돼지의 췌장 엘라스타제에 의한 엘라스틴의 변성을 억제한다고 알려져 있다[4〕.
1 ~ 20 μM)로 탄닌산을처리하여 실험하였다. 또한 섬유아세포에 탄닌산을 직접 동일 농도로 처리하고, 48 h 동안 배양한 후, 섬유아세포 균질액에서 엘라스타제 활성의 변화의 차이가 있는지 확인하였다.
섬유아세포 균질액은 배양된 섬유아세포에 0.1 % Triton X-100이 함유된 0.2 M Tris-HCl(pH 8.0)을 첨가한 후 초음파 분쇄기를 통하여 녹인 다음 3,000 rpm에서 20 min 동안 원심 분리하여 엘라스타제가 들어 있는 상층액을 취한 후, 이를 정량하여 총 단백질 양으로 효소의 활성을 측정하였다.
따라서 탄닌산은 효소에 직접적으로 작용하여 효소의 작용을 억제시키는 것으로 판단되었다. 엘라스타제 활성 억제의 효과를 비교하기 위하여 엘라스타제의 특이적인 억제제로 알려진 phosphoramidon 을 양성대조군으로 이용하여 측정하였다(Figure 2).
엘라스타제 활성의 측정을 위하여 엘라스타제는 섬유아세포 균질액에 다양한 농도(0.1 ~ 20 μM)로 탄닌산을처리하여 실험하였다. 또한 섬유아세포에 탄닌산을 직접 동일 농도로 처리하고, 48 h 동안 배양한 후, 섬유아세포 균질액에서 엘라스타제 활성의 변화의 차이가 있는지 확인하였다.
2 M Tris-HCl 완충액을 넣어 반응 조건을 만든 다음, 탄닌산을 다양한 농도로 1 μL씩 각 well에 넣어 효소 활성 반응을 준비한다. 여기에 엘라스타제의 특이적인 기질인 STANA (50 mM)를 각 well 마다 3 μL씩 넣어준다 37 ℃에서 배양하면서 매 30 min마다 405 nm에서 흡광도를 즉정하여 시험할 물질을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하여 상대적인 엘라스타제 활성도를 계산하였다. 양성대조군으로 섬유아세포 생성 엘라스타제의 특이적 억제제인 phosphoramidon을 사용하였다.
탄닌산이 다량의 폴리페놀을 함유하고 있고 항산화 효과가 있는 것으로 알려져 있지만, 직접적인 사람의 섬유아세포주에 처리시 세포 생존에 탄닌산이 어떠한 작용을 하는지 알 수 없었기 때문에 우선 다양한 농도의 탄닌산을 처리하여 세포독성이 있는지 확인하고 세포 생존율을 측정하였다. 그 결과 탄닌산은 0.
탄닌산이 엘라스타제를 직접 억제한다는 사실로부터 세 포상에서는 엘라스타제의 활성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 위 실험에서와 같은 농도로 탄닌산을 세포에 처리하고 48 h 동안 배양한 후, 엘라스타제의 '활성에 미치는 영향을 비교해 보았다. 그 결과 1 에서 20 까지 의 농도에서 모두 탄닌산에 의해 엘라스타제의 활성이 대조군과 비교해 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 3).
탄닌산이 엘라스타제의 활성에 미치는 직접적인 영향이 있는지를 확인하기 위하여 섬유아세포를 lysis buffer로 용해시킨 후, 추출한 엘라스타제에 농도별로 탄닌산을 처리하여 보았다. 그 결과, 10 μM 이상의 농도에서 탄닌산이대조군과 비교해 유의적으로 엘라스타제의 활성을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
대상 데이터
Inc.(Japan)에서 구입하였다. RT-PCR에 사용한 primer 는 바이오니아(Korea) , Western blot에 사용한 항체는 Elastin products Comp-any Inc.
사람의 섬유아세포(CCD-25Sk human fibroblasts)는 Amer-ican Type Culture Collection (ATCC, Rockville, USA)에서 구입하였으며, 이 섬유아세포를 37℃, 5%의 COZ, 10%의 태아소혈청(FBS), 50μ/mL의 스트렙토마이신 및 50 U/mL의 페니실린을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Korea)에서 배양하였다
여기에 엘라스타제의 특이적인 기질인 STANA (50 mM)를 각 well 마다 3 μL씩 넣어준다 37 ℃에서 배양하면서 매 30 min마다 405 nm에서 흡광도를 즉정하여 시험할 물질을 처리하지 않은 군을 대조군으로 하여 상대적인 엘라스타제 활성도를 계산하였다. 양성대조군으로 섬유아세포 생성 엘라스타제의 특이적 억제제인 phosphoramidon을 사용하였다.
데이터처리
실험은 3회 이상 반복하여 평균값과 표준오차를 구하고 Student's t-test에 의하여 p-value가 0.05 미만인 경우 통계적으로 유의성 있는 것으로 간주하였다
성능/효과
'활성에 미치는 영향을 비교해 보았다. 그 결과 1 에서 20 까지 의 농도에서 모두 탄닌산에 의해 엘라스타제의 활성이 대조군과 비교해 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Figure 3). 특히 탄닌산 20 에서는 양성 대조군으로 사용한 phosphoramidon과 비슷한 정도로 엘라스타제의 활성을 억제하였다.
관찰하였다. 그 결과 탄닌산은 트로포엘라스틴의 mRNA 발현에는 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 RT-PCR을 통해 확인할 수 있었다(Figure 4).
보았다. 그 결과, 10 μM 이상의 농도에서 탄닌산이대조군과 비교해 유의적으로 엘라스타제의 활성을 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 탄닌산은 효소에 직접적으로 작용하여 효소의 작용을 억제시키는 것으로 판단되었다.
사람의 피부조직을 생검(skin biopsy)하여 10일 동안 탄닌산을 처리한 배지에서 elastogenic effect가 강화된다[19]는 보고를 참고해 보면 섬유아세포에서 탄닌산의 역할은 직접적으로 엘라스타제의 활성을 억제하여 탄력섬유의 성분인 엘라스틴의 3차원적 구조가 변성되는 것을 방지하여 궁극적으로 엘라스틴을 보호하는 역할을 하는 것으로 보인다. 그리고 본 실험에서 이러한 과정은 UV조사 없이 직접적인 탄닌산의 처리에서도 효과가 있는 것으로 확인이 되었다. 이러한 결과는 탄닌산이 UV와 같은 외부 환경적인 자극에 의한 주름 형성 방지뿐만 아니라, 각종 내인성 요인에 의한 피부탄력 섬유의 퇴화나 엘라스틴 변성에 효과적으로 이용할 수 있는 물질이라는 것을 제시한다.
그리고 본 실험에서 이러한 과정은 UV조사 없이 직접적인 탄닌산의 처리에서도 효과가 있는 것으로 확인이 되었다. 이러한 결과는 탄닌산이 UV와 같은 외부 환경적인 자극에 의한 주름 형성 방지뿐만 아니라, 각종 내인성 요인에 의한 피부탄력 섬유의 퇴화나 엘라스틴 변성에 효과적으로 이용할 수 있는 물질이라는 것을 제시한다.
참고문헌 (19)
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