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문제 정의
- 알아보고. Lactobacillus plantarum P23과 Bacillus subtillis TP6의 발효 추출물이 항산화 및 항노화 화장품 소재로서의 활성과 효능을 더욱 증가시키는지 알아보기 위하여 항산화 (free radical 소거활성), 항염 (TNF-a, IL-6 생성 억제), MTT (자외선에 의한 세포 손상에 회복), 신생 콜라겐합성, MMPs 발현 억제 효과에 대해 알아보고자 진행되었다. 항산화 효과를 측정 하기 위한 free radical 소거활성 에서 스피루리나 추출물은 FSCso에서 183.
- 개발 보고 예는 아직까지 없다. 따라서 본 연구에서는 스피루리나 추출물에 대한 항산화 및 항노화 기능성 화장품 소재로서의 활성과 효능을 확인하고[12-14], Lactobacillus plantarum F23과 Bacillus subtillis TP6의 발효 추출물이 항산화 및 항노화 화장품 소재로서의 활성과 효능을 더욱 증가시키는지 알아보고자 하였다.
- 본 연구는 스피루리나 추출물이 항산화 및 항노화 화장품 소재로서의 활성과 효능을 갖는지 알아보고. Lactobacillus plantarum P23과 Bacillus subtillis TP6의 발효 추출물이 항산화 및 항노화 화장품 소재로서의 활성과 효능을 더욱 증가시키는지 알아보기 위하여 항산화 (free radical 소거활성), 항염 (TNF-a, IL-6 생성 억제), MTT (자외선에 의한 세포 손상에 회복), 신생 콜라겐합성, MMPs 발현 억제 효과에 대해 알아보고자 진행되었다.
제안 방법
- MMPs (matrix metalloproteases) 중 type IV 과 fyg VII collagen's 분해하는 MMP-2 (gelatinase A)와 MMP-9 (# B)의 발현을 조사하기 위해 1 % gelatin이 포함된 10 % SDS-PAGE gel에 회수한 배양액과 zymogram sample buffer와 1 : 1.의 비율로 전기 영동 하였다 SDS를 제거하기 위해 2.5 % Triton-X-lOOe 30 min 세척한 후 incubation buffer를 이용하여 over night incubation 하였다,
- 주줄 물의 싱등액에 Lactobacillus plantarum P23과 Bacillus subtillis TP6를 각각 1 v/v% 접종 후 Lactobacillus plantarum P23은 30 ℃ incubator, Bacillus subtillis TP6는 37 ℃ shaking incubator에서 24 h 동안 배양하였다. 멸균에 의한 항산화력의 손실을 줄이기 위해 Lactobacillus의 경 우무살균 발효를 진행하였다. 발효 후 원심분리 하여 cell을 제거한 발효물을 실험에 사용하였다.
- 투여한 후 48 h 동안 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 0.33 g/L 인 MTT 용액을 각 2 mL/well씩 넣어 90 min 동안 배양한 후 MTT 용액을 제거하고 isopropanol 1 mL을 이용해 20 min 동안 실온에서 shaking 한 후 상등액을 회수하여 12,000 rpm에서 5 min 동안 원심분리 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 세포 생존률을 비교하였다.
- 신생 콜라겐 생합성을 알아보기 위해 NHDF에 자외선을 조사한 시료를 각 농도별로 투여한 후 48 h 동안 배양하여 콜라겐 생합성량을 측정하였다. 실험결과 자외선처리 후 세 가지 시료는 각 농도별로 투여한 모든 범위에서 자외선 처리로 감소한 콜라겐 합성량을 자외선 처리전 个준.
- 5 mL을첨가하여 섞어주고 암실에서 20 min 동안 반응 시킨 후 UV-spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 즉정하였다. 오차를 줄이기 위하여 시료 자체의 흡광도를 측정하여 보정하였으며. 대조군으로는 기존의 항산화제로써널리 사용되고 있는 L-ascorbic acid와 Trolox를 사용하였다
- 유지하였다. 용해된 cell 추출액으로부터 신생 콜라겐을 정랑^하기 위해 Sircol collagen assay kit를 이용하였다. Dye reagent와 cell을 반응시 킨 후 15,000 rpm에서 15 min 동안 원심분리하여 상등액을 제거한 후 형성된펠렛을 알칼리 reagent를 넣어 녹인 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 신생 콜라겐을 정량 하였다.
- 이를 이용하여 배양액으로 분비된 TNF-tf 와 IL-6를 ELISA kit를 이용하여 측정하였다
- 자외선에 의한 세포 손상 회복 효과를 알아보기 위해자외선 조사 후 세포 생존율을 측정하였다. 스피루리나추출물 및 발효 추출물 모두가 UV 조사에 의한 세포사멸을 방지하였다.
- 주줄 물의 싱등액에 Lactobacillus plantarum P23과 Bacillus subtillis TP6를 각각 1 v/v% 접종 후 Lactobacillus plantarum P23은 30 ℃ incubator, Bacillus subtillis TP6는 37 ℃ shaking incubator에서 24 h 동안 배양하였다. 멸균에 의한 항산화력의 손실을 줄이기 위해 Lactobacillus의 경 우무살균 발효를 진행하였다.
- 피부 조직에서 분리한 normal-keratinocyte는 DMEM 과 Ham's F-12 media를 3 : 1의 비율로 조성하여 10 % FBS와 1 % AA (Anti-biotic/Anti-mycotic solution)를첨가하여 37 ℃, 5 % CO2 incubator에서 배양하였고, 피부조직에서 분리한 normal human dermal fibroblasts (NHDF)는 10 % FBS와 1 % AA가 포함된 DMEM media, 37 ℃, 5 % COz incubator에서 배양하였다.
- 피부의 basement membrane (BM) 과 dermal epidermal junction (DEJ) 에서 type IV과 type VII collagen을 분해하는 MMP-2 (gelatinase A) 와 MMP-9 (gelatinase B) 의 발현을 알아보기 위해 normal-keratinocyte에 자외선을 조사한 후 시료를 농도별로 처리하고 48 h 배양 후 배양 상등액을 회수하여 zymography를 실행하였다. 스피루리 나 주줄물과 Lactobacillus plantarum P23을 이용하여 발효한 시료에서는 MMPs의 발현이 크게 줄어들지 않았으나.
대상 데이터
- UV/Vis spectrophotometer (DU730, Beckman Coulter, USA) 의 제품을 사용하였다. 표준 항산화제로 6-hydroxy- 2, 5, 7, 8-tetra-methylchroman-2-carboxylic acid (Trolox), L-ascrobic acid를 사용하였고, free radical 소거활성즉정에 사용된 1, 1 -diphenyl-2-picryIhydrazyl (DPPH) radi- cale Sigma Chemical Co.
- 오차를 줄이기 위하여 시료 자체의 흡광도를 측정하여 보정하였으며. 대조군으로는 기존의 항산화제로써널리 사용되고 있는 L-ascorbic acid와 Trolox를 사용하였다
- 멸균에 의한 항산화력의 손실을 줄이기 위해 Lactobacillus의 경 우무살균 발효를 진행하였다. 발효 후 원심분리 하여 cell을 제거한 발효물을 실험에 사용하였다.
- (USA) 제품을 사용흐)였다. 배양 세포는 normal keratinocyte 와 normal hunam dermal fibroblasts를 사용하였으며 배양 배지는 GIBCO (USA) 제품을 사용하였다. Sircol assay kit는 Bio-color (USA) 제품을 사용하였으며 TNF-a, IL-6 측정을 위한 ELISA kit는 BIO-SOURCE (USA) 제품을 사용하였다.
이론/모형
- Free radical 소거 활성 물질을 확인하기 위하여 Soler- Rivas ef 成[10]의 방법에 의해 측정하였다 점적까지의과정은 모두 HPTLC에 의해 자동으로 진행하였다. HPTLC용 silica gel plate에 sample 5 씩 점 적 하였다.
- 배양 세포는 normal keratinocyte 와 normal hunam dermal fibroblasts를 사용하였으며 배양 배지는 GIBCO (USA) 제품을 사용하였다. Sircol assay kit는 Bio-color (USA) 제품을 사용하였으며 TNF-a, IL-6 측정을 위한 ELISA kit는 BIO-SOURCE (USA) 제품을 사용하였다.
- 특히 피부 노화의 원인 물질이다. 활성산소를 제거해주는 항산화 실험은 Molyneux[10]의방법에 의해 측정하였다. 에탄올에 용해시킨 0.
성능/효과
- 각각의 노란색 band는 항산화력을 가지는 물질을 나타낸다. HPTLC 결과 추줄물에 비해 Lactobacillus plantarum P23 발효물은 Figure 1에서 solid arrow band가 48 % 늘어나고 dotted arrow band가 소멸되는 것을 보였다 Bacillus subtillis TP6 발효물은 solid arrow band 가새로 생성되는 것을 확인하였다. 이와 같은 변화가 각각의 발효물의 항산화력 증가와 구체적으로 어떤 연관성이있는지에 대한 추가적인 연구가 필요하다.
- Normal-keratinocyte에 자외선을 조사한 후 시료를 농도별로 처리하고 48 h 동안 배양 후 배양 상등액을 회수하여 염증성 사이토카인을 측정한 결과 세 가지 시료의모든 농도에서 자외선 처리 하지 않은 상태보다 TNF-ff 생성을 50 % 이상 억제함을 볼 수 있다(Figure 2). 자외선 처리 후 처리 전보다 3배 이상 IL-6 분비량을 증가시켰고.
- 실험결과 자외선처리 후 세 가지 시료는 각 농도별로 투여한 모든 범위에서 자외선 처리로 감소한 콜라겐 합성량을 자외선 처리전 个준.。루 회복시킬 뿐만 아니라 최대 3배 이상의 신생 콜라겐 합성량을 증가시키는 것을 확인하였다. 스피루리 나 주줄물과 Lactobacillus plantarum P23으로 발효한 경우 신생 콜라겐 합성량이 농도가 증가함에 따라 감소하는 경향을 보였지만 Bacillus subtillis TP6를 이용한 스피루리나 발효물은 농도 의존적으로 콜라겐 생합 성량을 증가시킴을 확인 하였다(Figure 5).
- 7배 증가됨을 통해 발효를 통한 스피루리나 추줄물이 세포 손상 회복 효과를 증가시키는 것을 확인하였다. 또한 각 농도별로 투여 한 모든 범위 에서 자외선 처리로 감소한 콜라겐 합성량을 자외선 처리 전 수준으로회복시키고 최대 3배 이상의 신생 콜라겐 합성량을 증가시켰으며 MMPs의 발현을 감소시켰다. 특히, Bacillus subtillis TP6를 이용한 발효물은 신생콜라겐 합성량을농도 의존적으로 증가 시킬 뿐 아니라 MMPs의 발현을현저히 줄여 주었고 발효를 통해 그 효능이 증가됨을 확인하였다.
- 또한, Lactobacillus plantarum P23, Bacillus subtillis TP6 enzyme activity 에 의한 콜라겐 합성증가, MMPs 발현감소, antioxidant activity의 증가 등 발효에 의한 생리활성이 증가하는 것을 보았다. 그러므로 스피루리나발효물은 항산화, 항노화 효과를 가진 화장품 기능성 소재로써 응용가능성이 기대된다.
- 또한. 발효물은 추출물(183.3 ± 12.4 mg/mL)에 비해 유산균(P23) 발효 시 약 24.1 % (138.8 ± 6.5 pg/mL), 고초균(TP6) 발효 시 18.6 % (150.2 ± 9.2 #/mL) 정도의 항산화력 증진효과를 나타내었다 (Ta# 1).
- 그러므로 스피루리나발효물은 항산화, 항노화 효과를 가진 화장품 기능성 소재로써 응용가능성이 기대된다. 본 연구결과에서도 나타났듯이 Lactobacillus plantarum P23과 Bacillus subtillis TP6 발효 후 스피루리나 항산화 성분의 변화 양상이 다르게 관찰되었으며, 콜라겐 및 MMP-2에 대한 영향도 차이가 있었다. 또한 자외선 조사 후 나타나는 세포 손상회복 정도에서도 뚜렷한 차이가 관찰되었다 향후의 연구에서는 이러한 차이가 어느 특정성분의 변화에서 기인하는지를 규명하고자 한다.
- 스피루리나추출물 및 발효 추출물 모두가 UV 조사에 의한 세포사멸을 방지하였다. 스피루리나 시료를 처리한 경우 처리하지 않은 대조군보다 대략 40 % 이상의 생존율을 증가시켜 강한 세포 손상 회복 효과가 있음을 보였다. 특히 Lactobacillus plantarum P23으로 발효한 경우 고농도(1 %)에서 세포 생존율이 대조군에 의해 1.
- 항염 효과 측정에서 스피루리나 추출물 및 발효주줄물은 UV-induced pro-inflammatory cytokines인 TNF-a는 50 % 이상 줄여주었고, IL-6의 경우는 70 % 이상 줄여 주어 항염증에 효능이 있음을 보였다. 스피루리나 추출물 및 발효물은 자외선에 의한 세포 손상에 대해 강력한 회복 효과가 있음을 보였다. 특히 Lactobacillus plantarum P23으로 발효한 .
- 이상의 결과들은 스피루리나 추출물의 효과와 더불어 발효에 의한 항산화 및 항노화 효과의 증진을 확인하였다. 또한, Lactobacillus plantarum P23, Bacillus subtillis TP6 enzyme activity 에 의한 콜라겐 합성증가, MMPs 발현감소, antioxidant activity의 증가 등 발효에 의한 생리활성이 증가하는 것을 보았다.
- 자외선 처리 후 시료를 각 농도별로 처리한 경우각 시료의 최소농도에서 이미 최대의 항염증 효능을 나타내고 있어 우수한 항염증 효능을 가지고 있다고 판단된다(Figure 3). 즉, 스피루리나 주줄물과 발효 주줄물이자외선에 의해 증가된 염증유발 사이토카인인 TNF-a 와 IL-6를 모두 자외선 무처리 대조군 수준 이 하로 낮추는 효능이 있음을 확인하였으나 발효 과정에 의해 추가적인 항염증 효능의 증가는 관찰되지 않았다.
- 또한 각 농도별로 투여 한 모든 범위 에서 자외선 처리로 감소한 콜라겐 합성량을 자외선 처리 전 수준으로회복시키고 최대 3배 이상의 신생 콜라겐 합성량을 증가시켰으며 MMPs의 발현을 감소시켰다. 특히, Bacillus subtillis TP6를 이용한 발효물은 신생콜라겐 합성량을농도 의존적으로 증가 시킬 뿐 아니라 MMPs의 발현을현저히 줄여 주었고 발효를 통해 그 효능이 증가됨을 확인하였다.
- Lactobacillus plantarum P23과 Bacillus subtillis TP6의 발효 추출물이 항산화 및 항노화 화장품 소재로서의 활성과 효능을 더욱 증가시키는지 알아보기 위하여 항산화 (free radical 소거활성), 항염 (TNF-a, IL-6 생성 억제), MTT (자외선에 의한 세포 손상에 회복), 신생 콜라겐합성, MMPs 발현 억제 효과에 대해 알아보고자 진행되었다. 항산화 효과를 측정 하기 위한 free radical 소거활성 에서 스피루리나 추출물은 FSCso에서 183.3 ± 12.4 #/mL의 radical 소거 활성을 보였으며 Lactobacillus plantarum P23 발효 시 24.1 %, Bacillus subtillis TP6 발효 시 18.6 %의 항산화활성의 증진효과를 나타내었다 HPTLC 분석 결과 Lactobacillus plantarum P23 발효의 경우 스피루리나의 항산화 물질 활성을 증가시켰고, Bacillus subtillis TP6의 경우 새로운 항산화 물질을 생성하는 결과를보였다. 균마다 다른 enzyme activity의해 항산화 활성 및 피부생리활성 물질의 생성과 증진이 예상된다.
- 각물질에 대한 정성, 정량 분석은 추후 실험으로 확인할 예정이다. 항염 효과 측정에서 스피루리나 추출물 및 발효주줄물은 UV-induced pro-inflammatory cytokines인 TNF-a는 50 % 이상 줄여주었고, IL-6의 경우는 70 % 이상 줄여 주어 항염증에 효능이 있음을 보였다. 스피루리나 추출물 및 발효물은 자외선에 의한 세포 손상에 대해 강력한 회복 효과가 있음을 보였다.
후속연구
- 균마다 다른 enzyme activity의해 항산화 활성 및 피부생리활성 물질의 생성과 증진이 예상된다. 각물질에 대한 정성, 정량 분석은 추후 실험으로 확인할 예정이다. 항염 효과 측정에서 스피루리나 추출물 및 발효주줄물은 UV-induced pro-inflammatory cytokines인 TNF-a는 50 % 이상 줄여주었고, IL-6의 경우는 70 % 이상 줄여 주어 항염증에 효능이 있음을 보였다.
- 또한, Lactobacillus plantarum P23, Bacillus subtillis TP6 enzyme activity 에 의한 콜라겐 합성증가, MMPs 발현감소, antioxidant activity의 증가 등 발효에 의한 생리활성이 증가하는 것을 보았다. 그러므로 스피루리나발효물은 항산화, 항노화 효과를 가진 화장품 기능성 소재로써 응용가능성이 기대된다. 본 연구결과에서도 나타났듯이 Lactobacillus plantarum P23과 Bacillus subtillis TP6 발효 후 스피루리나 항산화 성분의 변화 양상이 다르게 관찰되었으며, 콜라겐 및 MMP-2에 대한 영향도 차이가 있었다.
- 본 연구결과에서도 나타났듯이 Lactobacillus plantarum P23과 Bacillus subtillis TP6 발효 후 스피루리나 항산화 성분의 변화 양상이 다르게 관찰되었으며, 콜라겐 및 MMP-2에 대한 영향도 차이가 있었다. 또한 자외선 조사 후 나타나는 세포 손상회복 정도에서도 뚜렷한 차이가 관찰되었다 향후의 연구에서는 이러한 차이가 어느 특정성분의 변화에서 기인하는지를 규명하고자 한다.
- 즉 발효를 통하여 MMPs의 발현이 감소함을 확인하였다(Figure 6). 이와 같은 결과는 콜라겐 생합성 측정의 결과와도 일치하는 것으로 노화현상에서 나타나는콜라겐을 비롯한 dermal matrix 구성 성분의 감소를 억 제하는 효능이 Bacillus subtillis TP6t 이용한 스피루리나발효 추출물에 존재하는 것으로 보인다 향후의 연구는 어느 특정성분이 이러한 효능과 관련이 있는지를 규명하는데 초점을 맞추어 수행하고자 한다
- HPTLC 결과 추줄물에 비해 Lactobacillus plantarum P23 발효물은 Figure 1에서 solid arrow band가 48 % 늘어나고 dotted arrow band가 소멸되는 것을 보였다 Bacillus subtillis TP6 발효물은 solid arrow band 가새로 생성되는 것을 확인하였다. 이와 같은 변화가 각각의 발효물의 항산화력 증가와 구체적으로 어떤 연관성이있는지에 대한 추가적인 연구가 필요하다.
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