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문제 정의
- 뿐만 아니라 원형질체 융합에 있어 초기 조건확 립은 다른 조직배양과 마찬가지로 아주 중요함에도 불구하고 전 세계적으로 배추의 원형질체 배양에 관한 기초연구는 거의 없는 실정이다. 본 연구에서는 원형질체 융합기술을 통한 질적 형질을 개선하는 종간 잡종식물체 육성을 위한 원형질체 분리, 배양조건 및 callus 형성과 기관분화에 미치는 조건들을 밝히고자 실시하였다.
제안 방법
- 종자들은 70% 에탄올에 1분간 소독한 후, 멸균수로 3번 세척하고, 50% 락스로 (물 : 유한락스 = 1:1) 20분간 표면살균하였다. 멸균수 로 세 번 세척하여 3% sucrose가 포함된 MS 기본배지 (Murashige and Skoog 1962)에 치상하였다. 하배축과 자엽 및 어린잎조직을 원형질체 분리재료로 이용하였으며 식물체는 MS 배지에 2~3주마다 한 번씩 계대배양하여 유지시켰다.
- 본 실험에서 배추의 자엽과 하배축, 어린잎을 사용하여 원 형질체 분리 및 배양에 적합한 조건들을 밝혔으며 원형질체 배양을 통하여 캘러스를 형성시켰다. 비록 캘러스에서 신초가 형성되지 않고 뿌리만 형성되었지만 본 실험의 결과를 기초 자료로 하여 B.
- 8)으로 세포들을 현탁시켜 원심분리 튜브에 담아 800 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 순수한 원형질체들은 세포 찌꺼기들과 분리되어 원심분리 튜브 윗면에 띠 모양으로 나타나는데 이 부분을 pasteur pipette로 조심스럽게 취하여 새 원심분리 튜브에 옮긴 다음 원형질체 세척용액 W5 (18.4 g/L CaCl2 . 2H2O, 9 g/L NaCl, 1.0 g/L glucose, 0.8 g/L KC1, pH 5.6~5.8)로 2회 세척한 후 상층액을 버리고 침전물을 1 mL의 W5용액으로 다시 현탁하여 0.02 mm의 Sperm counter (Hausser 3900, 1/400-mm square)를 이용하여 원형 질체수를 조사하였다.
- 효율적인 배추 원형질체 분리와 많은 양의 원형질체를 얻기 위하여 세포벽 분해효소인 Cellulysin과 Macerozyme의 농도, 원형질체 분리온도, 효소 처리시간, 진탕시간, 진탕속도를 다르게 하여 원형질체 분리를 시도하였다. 원형질체 분리는 1 g 정도의 기내에서 생장한 배추의 자엽과 하배축 및 어린잎을 멸균된 petridish위에 놓은 다음 전처리 용액 TVL 용액(54.6 g/L sorbitol, 7.4 g/L CaCl2 . 2H2O pH 5.6~5.8)을 넣고 날카로운 해부칼날을 사용하여 식물체를 사방 1~0.5 mm 정도의 크기로 작게 자른 후, 암 상태에서 1시간 preplasmolyse를 시켰다. 그 후 pasteur pipette을 사용하여 TVL 용액을 제거하였고 10 mL 가량의 여과소독한 enzyme 용액을 첨가하였다.
- 2%의 agarose가 첨가된 반고체배지에 고정시켜 배양하였다. 이때 사용하는 배지는 K3 (Kao and Michcharyluk 1975) 배지를 기본으로 하였으며, 당 농도는 초기배지보다 낮은 0.1M sucrose를 사용하였고 식물생장조절제로는 0.5 mg/L 2, 4-D, 0.025 mg/L NAA와 0.025 mg/L BAP< 첨가하여 배양하였다. 형성된 calli들은 식물체 재분화를 유기시키기 위하여 MS 기본배지에 zeatin, BAP, NAA, IAA를 첨가하여 배양하였다.
- 5x104-5x104 proto- plasts/mL의 빈도수가 되도록 희석하여 지름이 6 mm 인 petridish에 배양하였다. 이때 사용한 배지는 수정된 K8p (Glimelius et al. 1986) 배지에 2, 4-D와 kinetin을 조합하여 첨가하였다. 초기배양 7~10일 후 원형질체가 분열하기 시작하면 0.
- 실험에 사용된 식물재료들은 중앙종묘에서 분양받은 배추 inbred line들인 KW2, KW9, KW23, KW24이다. 종자들은 70% 에탄올에 1분간 소독한 후, 멸균수로 3번 세척하고, 50% 락스로 (물 : 유한락스 = 1:1) 20분간 표면살균하였다. 멸균수 로 세 번 세척하여 3% sucrose가 포함된 MS 기본배지 (Murashige and Skoog 1962)에 치상하였다.
- 멸균수 로 세 번 세척하여 3% sucrose가 포함된 MS 기본배지 (Murashige and Skoog 1962)에 치상하였다. 하배축과 자엽 및 어린잎조직을 원형질체 분리재료로 이용하였으며 식물체는 MS 배지에 2~3주마다 한 번씩 계대배양하여 유지시켰다. 배양은 25±1℃로 조절되는 배양실에서 16시간 광주기 조건에서 배양하였다.
- 025 mg/L BAP< 첨가하여 배양하였다. 형성된 calli들은 식물체 재분화를 유기시키기 위하여 MS 기본배지에 zeatin, BAP, NAA, IAA를 첨가하여 배양하였다.
- 그 후 pasteur pipette을 사용하여 TVL 용액을 제거하였고 10 mL 가량의 여과소독한 enzyme 용액을 첨가하였다. 효소는 Cellulysin을 0.5, 1% 농도로, Macerozymee 0.1, 0.5, 1% 농도로 조합하였다.
- 효율적인 배추 원형질체 분리와 많은 양의 원형질체를 얻기 위하여 세포벽 분해효소인 Cellulysin과 Macerozyme의 농도, 원형질체 분리온도, 효소 처리시간, 진탕시간, 진탕속도를 다르게 하여 원형질체 분리를 시도하였다. 원형질체 분리는 1 g 정도의 기내에서 생장한 배추의 자엽과 하배축 및 어린잎을 멸균된 petridish위에 놓은 다음 전처리 용액 TVL 용액(54.
대상 데이터
- B. Campeses에서도 원형질체 배양에 관한 연구결과들이 보고되었지 만 (Hegazi et al. 1992; Zhao et al. 1994) 단지 캘러스만을 얻었거나 재분화가 되었다고 하더라도 재분화율이 아주 저조했고, 사용된 재료도 재분화가 상대적으로 용이한 F1 시판품종을 사용하였다. 선진국들은 원형질체 배양에 의한 재분화 연구뿐만 아니라 원형질체 융합에 의한 세포질 웅성 불임 특성 및 병저항성과 같은 유용형질들을 도입하는 연구들을 활발하게 진행시켜 오고 있다.
- 실험에 사용된 식물재료들은 중앙종묘에서 분양받은 배추 inbred line들인 KW2, KW9, KW23, KW24이다. 종자들은 70% 에탄올에 1분간 소독한 후, 멸균수로 3번 세척하고, 50% 락스로 (물 : 유한락스 = 1:1) 20분간 표면살균하였다.
성능/효과
- 배추에 가장 적합한 원형질체 분리조건들을 알아보기 위하여 배추의 자엽, 하배축 및 어린잎을 이용하여 효소농도, 배양 은도, 진탕속도를 다르게 하여 실험을 수행하였는데 l%Cel- lulysin과 0.5% Macerozyme의 조합이 배추 원형질체 분리에 가장 적합하며 어린잎에서 7.6X10, protoplasts/g의 가장 닿은 양의 원형질체를 얻었을 수 있었다 (Table 1). 효소처리 -r enzyme의 활성이 좋은 23~24℃에서 12~16시간 배양 "1 킨 후 30-40 rpm 정도의 회전 진탕속도로 1 ~2시간 분리하거나, 27~28℃의 항온상태에서 30 rpm 정도의 회전 진탕시키면서 반응시켰다.
- 원형질체 배양에서 세포벽의 재생, 세포분열 및 식물체재 분화는 배지 내에 접종된 세포의 밀도와 식물생장 조절물질의 영향을 받는다 (Eriksson 1986). 분리된 원형질체는 수정된 K8p 배지에 식물생장 2, 4-D와 kinetin을 조합하여 배양하였는데 2, 4-D가 5 mg/L 그리고 kinetin이 2 mg/L의 조합에 세포분열이 가장 활발한 것을 관찰할 수 있었다. 2, 4-D 5 mg/L과 kinetin 2 mg/L을 첨가한 배지조합에서 세포분열이 활발하였지만 (Figure ID) 캘러스들을 sucrose가 2% 함유된 MS 기본배지에 2 mg/L zeatin, 0.
- 이러한 현상들은 Glimelius (1984)와 Zhao 등(1994)의 연구에서도 관찰된 바가 있는데 이것은 더디게 생장하는 십자화과속의 세포들에서 독성물질들을 분비하여 세포의 생장을 저해하여 나타나는 것으로 알려졌다. 이러한 현상들은 세포가 분열하여 8~ 10세포 단계에서 가장 민감하게 나타나는데 이때 분열하는 세포들을 agarose 반고체 배지 (semi-solid medium)에 고정시켜 배양하면 효과적으로 방지할 수 있었다.
- 하배축, 자엽 및 어린잎에서 분리된 원형질체를 배양할 때 하배축과 자엽에서 분리된 원형질체는 배양 2일 후 세포분열 을 시작하여 배양배지에 떠있는 것을 관찰할 수 있었으나 잎 에서 분리된 원형질체는 petridish 바닥에 가라앉은 상태로 있을 뿐 분열하지 않았으며 시간이 지남에 따라 세포가 갈변 하면서 천천히 죽었다. 이러한 현상들은 Glimelius (1984)와 Zhao 등(1994)의 연구에서도 관찰된 바가 있는데 이것은 더디게 생장하는 십자화과속의 세포들에서 독성물질들을 분비하여 세포의 생장을 저해하여 나타나는 것으로 알려졌다.
후속연구
- oleracea 간의 체세포 잡종 식물체를 생산하는데 성공하였다 (Lian and Lim 2001a). 또한 B.juncea를 사용한 조직배양과 원형질체 배양에 의한 식물체 재분화 체계가 확립되었기에 (Lian and Lim 2001b) 배 추 원형질체 초기배양과 캘러스 배양에서 기관분화에 영향주는 요인들을 조절하고 기존의 배양방법을 더 체계화시킨다면 순계계통의 배추 원형질체 배양에서도 완전한 식물체재 분화를 가능하게 하는 기초자료를 제공하게 될 것이다.
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