Amyloid $\beta$peptide($A{\beta}$)은 지방산화 및 free radical의 생산에 의해 신경세포의 apoptosis를 유도하거나 산화적 스트레스를 증가시키는 원인이 되는 물질로 알려져 있으며, 알츠하이머와 같은 신경계 질환은 뇌에 아밀로이드베타 단백질들의 축적에 의해서 일어난다. 따라서 본 연구에서는 수분 활성도 0.813인 분말 녹차를 저장기간별로 저장한 후 $70^{\circ}C$에서 5분간 추출한 분말 녹차 열수추출물을 이용하여 아밀로이드 베타단백질에 의해 유도된 신경세포 보호효과를 측정하였다. 아밀로이드 베타 단백질에 의해 유도된 PC 12 신경세포에 대한 보호효과를 MTT방법으로 측정한 결과 저장하지 않은 시료와 1주일 동안 저장한 분말 녹차 열수추 출물에서 가장 높은 보호효과를 보였다. 저장기간에 따른 분말 녹차 열수추출물의 산화적 스트레스에 의한 세포막 보호효과를 LDH 및 trypan blue exclusion 방법으로 측정한 결과 모든 시료에서 $20{\sim}25%$의 LDH release 보호효과를 보였으며, 또한 trypan blue exclusion 실험에서 positive control로 사용한 $91.0{\pm}1.6%$의 vitamin C 보다 분말 녹차 열수추출물에서 $96.3{\pm}1.8{\sim}96.2{\pm}2.4%$로 더 높은 세포막 보호효과를 보였다.
Amyloid $\beta$ peptide($A{\beta}$)은 지방산화 및 free radical의 생산에 의해 신경세포의 apoptosis를 유도하거나 산화적 스트레스를 증가시키는 원인이 되는 물질로 알려져 있으며, 알츠하이머와 같은 신경계 질환은 뇌에 아밀로이드베타 단백질들의 축적에 의해서 일어난다. 따라서 본 연구에서는 수분 활성도 0.813인 분말 녹차를 저장기간별로 저장한 후 $70^{\circ}C$에서 5분간 추출한 분말 녹차 열수추출물을 이용하여 아밀로이드 베타단백질에 의해 유도된 신경세포 보호효과를 측정하였다. 아밀로이드 베타 단백질에 의해 유도된 PC 12 신경세포에 대한 보호효과를 MTT방법으로 측정한 결과 저장하지 않은 시료와 1주일 동안 저장한 분말 녹차 열수추 출물에서 가장 높은 보호효과를 보였다. 저장기간에 따른 분말 녹차 열수추출물의 산화적 스트레스에 의한 세포막 보호효과를 LDH 및 trypan blue exclusion 방법으로 측정한 결과 모든 시료에서 $20{\sim}25%$의 LDH release 보호효과를 보였으며, 또한 trypan blue exclusion 실험에서 positive control로 사용한 $91.0{\pm}1.6%$의 vitamin C 보다 분말 녹차 열수추출물에서 $96.3{\pm}1.8{\sim}96.2{\pm}2.4%$로 더 높은 세포막 보호효과를 보였다.
Amyloid $\beta$ peptide ($A{\beta}$) is known to increase oxidative stress in nerve cells, leading to apoptosis that is characterized by free radical formation and lipid peroxidation. Neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) are characterized by large deposit...
Amyloid $\beta$ peptide ($A{\beta}$) is known to increase oxidative stress in nerve cells, leading to apoptosis that is characterized by free radical formation and lipid peroxidation. Neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) are characterized by large deposits of $A{\beta}$ in the brain. In our study, neuronal protective effects of green tea, along with water activity (0.813), and leaf storage periods (fresh leaf, or leaf stored for up to 4 weeks) were investigated. We measured protective effects against $A{\beta}$-induced cytotoxicity in neuron-like PC12 cells. Powdered green tea was extracted with distilled water at $70^{\circ}C$ for 5 min, and this extract was freeze-dried and stored at $-20^{\circ}C$ until use. In cell viability assays using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), the fresh extract, and that obtained after 1 week of leaf storage, showed the best protective effects against $A{\beta}$-induced neurotoxicity. As oxidative stress causes membrane breakdown, the protective effect of green tea extracts was investigated using lactate dehydrogenase (LDH) and trypan blue exclusion assays. LDH release into the medium was inhibited (by 20-25%) in all tests. In addition, all green tea extracts (fresh, or stored before extraction for up to 4 weeks) showed better cell protective effects ($93.3{\pm}1.8-96.2{\pm}2.4$) than did vitamin C ($91.0{\pm}1.6$), used as a positive control. The results suggest that effectiveness of green tea extracts falls with prolonged leaf storage.
Amyloid $\beta$ peptide ($A{\beta}$) is known to increase oxidative stress in nerve cells, leading to apoptosis that is characterized by free radical formation and lipid peroxidation. Neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease (AD) are characterized by large deposits of $A{\beta}$ in the brain. In our study, neuronal protective effects of green tea, along with water activity (0.813), and leaf storage periods (fresh leaf, or leaf stored for up to 4 weeks) were investigated. We measured protective effects against $A{\beta}$-induced cytotoxicity in neuron-like PC12 cells. Powdered green tea was extracted with distilled water at $70^{\circ}C$ for 5 min, and this extract was freeze-dried and stored at $-20^{\circ}C$ until use. In cell viability assays using 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), the fresh extract, and that obtained after 1 week of leaf storage, showed the best protective effects against $A{\beta}$-induced neurotoxicity. As oxidative stress causes membrane breakdown, the protective effect of green tea extracts was investigated using lactate dehydrogenase (LDH) and trypan blue exclusion assays. LDH release into the medium was inhibited (by 20-25%) in all tests. In addition, all green tea extracts (fresh, or stored before extraction for up to 4 weeks) showed better cell protective effects ($93.3{\pm}1.8-96.2{\pm}2.4$) than did vitamin C ($91.0{\pm}1.6$), used as a positive control. The results suggest that effectiveness of green tea extracts falls with prolonged leaf storage.
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문제 정의
특히 수분활성도 및 저장기간에 따라 녹차를 저장하면서 그 열수추출물을 이용하여 신경세포보호 효과에 관한 연구는 매우 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 수분활성도 0.813의 조건에서 4주간 저장하면서 저장기간에 따라 녹차 열수추출물의 신경세포보호 효과 변화에 관하여 조사하였다.
Aβ 처리에 대한 분말 녹차 열수추출물의 신경세포 보호 효과를 측정한 결과 분말 녹차 열수추출물은 저장기간이 짧은 시료 즉, 저장 전의 시료와 1주일 저장한 시료에서 상대적으로 우수한 보호효과를 갖는 것으로 나타났다. 또한 신경세포의 경우 상대적으로 많은 lipid 성분을 함유하고 있고 이는 산화적인 스트레스에 매우 취약한 구조적 특성이므로 상기의 신경세포 보호효과와 신경세포막과의 관계를 알아보고자 다음의 연구를 진행하였다. Aβ 처리에 의해 PC12 세포막 파괴로 인한 LDH release는 control group 대비 20% (membrane destruction)가 높게 나타났고, Aβ처리에 의한 세포막 손상은 vitamin C에 의해 control group 수준으로 낮아짐으로서 신경세포막 보호효과를 보여주었다(Fig.
제안 방법
LDH assay를 통해 분말 녹차 열수추출물의 세포막 보호 효과를 확인하기 위해 trypan blue dye exclusion assay를 추가로 수행하였다. 저장기간별 (fresh～4 weeks group) 녹차 열수추출물은 100 μg/mL의 농도로 PC12 cell line에 48시간동안 pre-incubation 하였고, 그 후 Aβ는 10 μM의 농도로 24시간 incubation하였다.
Trypan blue 분석실험은 죽은 세포를 제외한 살아있는 세포에 의해 측정되는 것으로 살아있는 세포는 세포막을 통하여 trypan blue 색소가 들어올 수 없기 때문에 사멸세포의 수를 측정함과 동시에 사멸세포의 세포막에 푸른색으로 염색이 됨으로해서 세포막의 손상 정도를 알 수 있는 것이다. PC12 cell에 0.4% trypan blue를 첨가한 후 5분 후 hemocytometer 및 염색정도를 측정하였고, 살아있는 세포수를 총 세포수의 백분율로 나타내었다. Aβ-induced neurotoxicity에 대한 세포막 보호 효과는 LDH (Lactate dehydrogenase) assay로 측정하였다(23).
PC12 세포를 2000×g에서 2분간 원심분리하여 침전시키고, 50 μL의 상등액을 새로운 well로 옮긴 후 세포막 손상효과 측정은 LDH assay kit로 측정하였다(23).
본 실험에서 사용한 PC12 세포(ATCC CRL-1721)는 신경세포의 특성을 나타내는 세포로 쥐의 pheochromocytoma로부터 유도된 것을 사용하였다. PC12세포를 10% heat-inactivated horse serum(GIBCO, USA), 5% fetal bovine serum(GIBCO, USA), 50 units/mL penicillin 및 100 mg/mL streptomycin이 포함된 RPMI 1640배지에 접종하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
대조구 (positive control)는 vitamin C (100 μM)를 사용하였고, cell viability는 control에 대한 % concentration으로 나타냈다.
813의 조건에서 분말 녹차를 0∼4주 동안 20℃ incubator(IB-21, JEIO TECH, Korea)에서 저장하여 본 실험에 사용하였다. 또한 분말 녹차 열수추출물의 제조는 분말 녹차 1.5 g에 70℃ 증류수 100 mL를 첨가하여 5분간 추출한 후 No. 2 여과지(Adventec, Tokyo, Japan)로여과한 다음 농축하여 산화적 스트레스에 의한 신경세포 PC12의 세포사멸과 세포막 손상 보호효과에 대하여 조사하였다.
저장기간별 (fresh～4 weeks group) 녹차 열수추출물은 100 μg/mL의 농도로 PC12 cell line에 48시간동안 pre-incubation 하였고, 그 후 Aβ는 10 μM의 농도로 24시간 incubation하였다. 배양 후 이 상태의 PC12 cell과 0.4% trypan blue dye를 동량으로 하여 10분간 incubation하고, 이를 optical microscope를 통해 viable cell수를 측정하였다. 양성대조구 (positive control)는 역시 동일하게 vitamin C (100 μM)를 사용하였다.
양성대조구 (positive control)는 vitamin C (100 μM)를 사용하였고, cell viability는 control에 대한 % concentration으로 나타냈다.
저장기간별 (1～4주) 분말 녹차 추출물은 100 μg/mL의 농도로 PC12 cell line에 48시간동안 pre-incubation 하였고, 그 후 Aβ는 10 μM의 농도로 증류수에 녹여 첨가한 후 24시간 incubation하였다.
저장기간별 (fresh～4 weeks group) 녹차 열수추출물은 100 μg/mL의 농도로 PC12 cell line에 48시간동안 pre-incubation 하였고, 그 후 Aβ는 10 μM의 농도로 24시간 incubation하였다.
본 실험에 사용한 RPMI 1640 medium, fetal bovine serum, horse serum, penicillin 및 streptomycin은 Gibco BRL(Grand Island, N.Y., U.S.A)에서 구입하였으며, amyloid β protein (1-42 fragment) 및 나머지 시약은 Sigma (St. Louis Mo., U.S.A) 제품을 구입하여 사용하였고, 분말 녹차는 경남 하동군 악양면 소재 (주)햇차원에서 제조한 녹차잎을 분쇄하여 100 mesh sieve를 통과시켜 제조하였다.
본 실험에서 사용한 PC12 세포(ATCC CRL-1721)는 신경세포의 특성을 나타내는 세포로 쥐의 pheochromocytoma로부터 유도된 것을 사용하였다. PC12세포를 10% heat-inactivated horse serum(GIBCO, USA), 5% fetal bovine serum(GIBCO, USA), 50 units/mL penicillin 및 100 mg/mL streptomycin이 포함된 RPMI 1640배지에 접종하여 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
포화 ammonium sulfate용액을 제조하여 desicator에 충진시킨 후 수분활성도가 0.813의 조건에서 분말 녹차를 0∼4주 동안 20℃ incubator(IB-21, JEIO TECH, Korea)에서 저장하여 본 실험에 사용하였다.
데이터처리
실험은 3회 이상 실시하여 그 평균값을 mean±S.D.로 표시하였으며, 실험결과는 SAS package program을 이용하여 일원배치분산분석 후, 유의성 검정은 P<0.05에서 Duncan's rage test로 분석하였다.
이론/모형
Aβ-induced neurotoxicity에 대한 세포막 보호 효과는 LDH (Lactate dehydrogenase) assay로 측정하였다(23).
Aβ에 의해 유도된 PC12 세포에 대한 보호 효과는 MTT 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) reduction assay로 측정하였다(23).
일반성분 분석
분말 녹차의 수분함량은 105℃ 건조 후 항량을 측정하여 산출하였고, 조단백질은 Auto-kjeldahl법, 조지방은 Soxhlet 추출장치로 추출하여 측정하였고, 조섬유는 1.25% H2SO4및 NaOH 분해법으로, 조회분은 550℃ 직접회화법으로 측정하였으며, 그 외 나머지 성분들은 가용성 무질소물로 나타내었다(22).
성능/효과
Aβ 처리에 대한 분말 녹차 열수추출물의 신경세포 보호 효과를 측정한 결과 분말 녹차 열수추출물은 저장기간이 짧은 시료 즉, 저장 전의 시료와 1주일 저장한 시료에서 상대적으로 우수한 보호효과를 갖는 것으로 나타났다.
결국 Aβ 처리에 의해 PC12 세포막 파괴로 인한 trypan blue dye staining cell은 그렇지 못한 cell에 비해 사멸된 것으로 판단하였다. Control group은 전체 세포 중 90%정도가 viable cell로 나타났고 전체 중 10%만이 실험 기간 중 자연 사멸되는 결과를 보여주었다. 반면 Aβ를 처리한 group은 control group 대비 13%의 신경 세포사멸을 유발하였고, Aβ처리에 의한 세포막 손상은 vitamin C 처리에 의해(91%) control group 수준으로 회복됨으로서 신경세포막 보호효과를 보여주었다(Table 2).
PC12 cell viability는 Aβ를 처리한 처리구에서는 control group 100% 대비 78%의 생존률을 나타냈고 Aβ와 vitamin C를 동시에 처리한 처리구에서는 89%로 약 11% 정도의 신경세포 보호 효과를 보였다(Fig. 1).
그러나 이는 신경세포 독성에 대한 신경세포 보호의 결과와는 다소 상반되는 것으로 단지 MTT assay와 LDH assay의 실험적인 특징에 의해 나타나는 결과인지 아니면 내부 구성물로서의 phenolic compounds에 의한 원인인지는 분명하지 않다. 또한 분말 녹차 열수추출물이 저장기간에 크게 관계없이 vitamin C보다도 높은 신경세포막 활성 (PC12 cell 외부로의 LDH release 저해능력)을 보여주었다.
또한 저장 전의 fresh group과 저장 일주일이 경과한 시료에서는 각각 98%와 102%의 신경 세포 보호효과를 나타내어 분말 녹차 열수추출물이 vitamin C보다 약 9∼11% 높은 신경 세포 보호 효과(9∼11%)를 나타내었고, 그 신경 세포 보호효과는 control group과 유사한 결과를 보였다.
반면 Aβ를 처리한 group은 control group 대비 13%의 신경 세포사멸을 유발하였고, Aβ처리에 의한 세포막 손상은 vitamin C 처리에 의해(91%) control group 수준으로 회복됨으로서 신경세포막 보호효과를 보여주었다(Table 2).
반면 저장기간이 2∼4주된 시료에서는 Aβ에 의해 유도된 신경세포 보호효과는 저장 전 시료와 저장 1주일이 경과한 시료에 비하여 78∼82%로 상대적으로 신경세포 보호효과가 감소되는 결과를 보였다.
본 실험에 사용된 분말 녹차의 일반성분을 분석한 결과는 Table 1와 같이 수분 4.72±0.14%, 조단백질 19.46±0.28%, 조지방 1.21±0.10%, 가용성 무질소물 68.45± 2.06%, 조섬유 2.38±0.05% 및 회분 3.78±0.06%였다.
반면 Aβ를 처리한 group은 control group 대비 13%의 신경 세포사멸을 유발하였고, Aβ처리에 의한 세포막 손상은 vitamin C 처리에 의해(91%) control group 수준으로 회복됨으로서 신경세포막 보호효과를 보여주었다(Table 2). 저장기간별 녹차 열수추출물 (fres h～4 weeks groups)에 의한 신경세포막 보호효과도 관찰되었는데, 그 효과는 vitamin C의 효과와 전체적으로 유사하게 나타났으며, 신경세포막 보호효과의 정도도 비교적 고르게 나타나는 특징을 보여주었다. Hong 등(27)은 허혈성 뇌손상에 미치는 녹차추출물이 효과를 조사한 결과 허혈 및 재관류시 생성되는 산소유리기 생성 및 염증매개물의 생성과 유리를 억제시킴으로써 세포사를 방지하고 그 결과로 허혈성 뇌손상을 억제하는 것으로 보고하였다.
특히 저장기간별 녹차 추출물 (fresh∼4 weeks groups)에 의한 신경세포막 보호효과도 관찰되었는데, 그 정도는 비교적 고르게 나타났다. 특히 저장기간 3 및 4주된 분말 녹차 열수추출물에서 가장 높은 세포막 보호 활성을 보여주었다. 그러나 이는 신경세포 독성에 대한 신경세포 보호의 결과와는 다소 상반되는 것으로 단지 MTT assay와 LDH assay의 실험적인 특징에 의해 나타나는 결과인지 아니면 내부 구성물로서의 phenolic compounds에 의한 원인인지는 분명하지 않다.
특히 저장기간별 녹차 추출물 (fresh∼4 weeks groups)에 의한 신경세포막 보호효과도 관찰되었는데, 그 정도는 비교적 고르게 나타났다.
후속연구
저장 2∼4주 경과한 시료에서 Aβ 처리에 의해 신경세포에 대한 보호효과를 거의 보이지 못한 이유는 녹차에 함유되어 있는 대표적인 생리활성 성분인 catechin류의 함량변화 보다는 저장기간 중 그 활성이 낮아진 것으로 생각된다. 그러므로 정확한 결과를 도출하기 위해서는 녹차에 함유된 catechin류 중 약 60% 정도 함유된 것으로 알려진 epigallocatechin gallate(25)를 동정하여 저장기간에 따른 함량변화, 신경세포 보호효과 및 항산화 활성 등의 추가적인 연구가 수행되어야 할 것으로 판단된다. Lim(26)은 알츠하이머 유발 생쥐의 뇌를 적출하여 CD14 positive 세포를 분리한 후 세포내 염색법으로 염증유발 cytokine인 IL-1β와 TNF-α의 생산량을 flow cytometry로 관찰한 결과 녹차 열수추출물 투여군이 대조군에 비하여 IL-1β와 TNF-α의 생산량을 현저히 억제하는 것으로 나타났으며, 마이크로글리아 세포가 염증유발 cytokine을 과잉생산하여 초래되는 신경세포 사멸을 녹차에 의하여 예방할 수 있을 것으로 보고하여 본 논문의 결과와 유사한 경향을 보였다.
특히 신경세포 사멸에 대한 보호효과를 나타내는 MTT assay의 경우, 분말 녹차 추출물은 저장기간이 짧은 것 (fresh, 1 week group)이 상대적으로 높은 보호효과를 나타내었다. 이 결과가 단순히 추출 효율에 의한 원인인지 아니면 active-catechin류의 함량변화 및 활성 능력 변화 등에 의한 것인지는 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
노인성 치매는 어떤 손실을 주는 특징을 갖고 있는가?
퇴행성 신경질환의 대부분을 차지하는 노인성 치매(Alzheimer's disease; AD)는 기억과 인지에 손실을 주는 특징을 가지고 있다. 많은 연구에서 AD 환자의 뇌에서 free radicals 손상으로 인한 산화적 스트레스가 증가된 상태에 있는 것이 밝혀져 있고 그에 의한 세포들의 기능장애가 AD의 신경퇴행에 책임이 있다고 알려져 있다(1).
In vitro상에서 산화적 스트레스를 유발시키는 물질로 광범위하게 사용되고 있는 주요 원인물질은 무엇인가?
예를 들어 H2O2는 여러 다양한 세포들의 세포사멸을 유도하고(4), 비타민 C와 같은 항산화제를 첨가함으로써 세포사멸을 억제시킬 수 있다(5). In vitro상에서 산화적 스트레스를 유발시키는 물질로 광범위하게 사용되고 있는 주요 원인물질은 ROS 및 H2O2로서 천연 항산화제는 ROS 및 H2O2와 같은 free radicals에 의해 생성된 산화적 스트레스를 막아주는 중요한 역할을 한다고 보고되어 왔다(6). 항산화 비타민과 phenolic phytochemicals과 같은 천연물 및 식품유래 성분들은 안전하면서도 “의약품”과 같이 산화적 손상에 대한 방지효과가 있어 최근 들어 큰 각광을 받고 있다.
녹차의 항산화성을 나타내는 polyphenol성 화합물들은 어떤 생리활성을 갖는다고 보고되었는가?
녹차의 주성분인 catechin은 flavonol의 유도체로서 건조된 녹차의 8~15% 정도 함유되어 있으며, 녹차 잎을 끓이면 용출되는데 이것은 항산화성을 나타내는 polyphenol성 화합물(11)로서 epicatechin, epigallocatechin, epicatechingallate 및 epigallocatechin gallate로 나뉘어진다(12). 이 성분들은 콜레스테롤 저하(13), 고혈압 및 동맥경화예방(14), 항암(15), 항산화(16), 항균(17), 중금속제거(18), 혈압강화 효과 (19) 등 여러 가지 생리활성을 나타낸다고 보고되고 있다. 특히 non- gallte화합물인 epicatechin 및 epigallocatechin보다 gallate가 결합된 epicatechin- gallate와 epigallocatechin gallate가 강한 생리활성을 나타낸다고 보고되고 있다(20, 21).
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