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문제 정의
- 각 당귀 시료가 과산화수소 (H2O2) 에 의해 유도되는 BSA의 분해를 억제하는지 측정하였다. H2O2를 처리하지 않은 경우 BSA 가 모두 확인되나, H2O2 를 처리하면 분해되어 BSA 가 보이지않는다.
- 본 실험은 직접적으로 과산화수소가 시험관 내에서 BSA(Bovine serum albumin) 를 공격하는 것을 항산화물질이 방어하는 것을 측정하는 실험이다. 항산화물질을 처리하지 않은 경우는 과산화수소가 BSA를 공격하여 BSA가 분해되는데, 전기영동과 염색의 과정을 거쳐 확인할 수 있다.
- 이에 본 연구는 생산지와 기원을 알 수 있는 3종의 당귀를 사용하여 항산화, Apoptosis, NO 억제 등의 활성을 측정하여 그 결과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 측정하였다. BSA 를 농도별로 0, 1, 2, 4, 8, 16 #/#로 정한 후 96 well plate 에 20#씩 넣고, BCA 용액 100#를 첨가하여 20분간 37C 에서 방치한 다음 흡광도 540 nm 에서 측정하여 표준곡선을 작성하였다. 추출된 단백질 상충액 2#와 PBS 18#를 섞고, BCA 용액 100#을 혼합 후 20분간 37C 에서 방치한 후 540 nm 에서 측정하여 표준곡선을 이용하여 단백질농도를 계산하였다.
- 5 mM), CuSO4 5#(100 μM), 농도별 당귀추출물 10#를 넣고 최종 부피가 60#가 되게 PBS로 조정하였다. 그 후 2시간 동안 실온에 방치한 후 1.2% SDS-PAGE 를 실시하여 coomassie blue 로 염색과 탈염색 처리 후 젤을 스케닝 하였다.
- 과도한 NO 생성은 급만성염증에 관여하며 세포의 파괴와 염증조직의 상해를 초래하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 당귀에 의하여 이 NO 가 감소 될 수있는지 알아보기 위하여 당귀를 각각 0.078, 0.156, 0.313, 0.652, 1.25, 2.5, 5, 10 mg/# 농도로 RAW264.7에 LPS와 같이 처리 하였다. Fig.
- 단백질 정량은 Bicinchoninic Acid(BCA, Sigma, USA) 용액과 bovine serum albumin(BSA, Sigma, USA) 으로 표준 곡선으로 산출하여 측정하였다. BSA 를 농도별로 0, 1, 2, 4, 8, 16 #/#로 정한 후 96 well plate 에 20#씩 넣고, BCA 용액 100#를 첨가하여 20분간 37C 에서 방치한 다음 흡광도 540 nm 에서 측정하여 표준곡선을 작성하였다.
- 당귀 추출물이 처리된 SK-N-MC 세포에서 단백질을 추출하기 위하여 1x107 의 세포 당 lysis buffer(10 mM Tris-HCl, pH7.6, 150 mM NaCl, 1% SDS) 100 #로 현탁시켜 얼음 위에서 한 시간 동안 방치하여 완전히 lysis 시켜 단백질을 추출하였다. 12, 000 Xg 에서 15분간 원심분리하여 상충액을 새 튜브에 옮겨 다음 실험을 수행하였다.
- 대조군은 100 #의 PBS 를 사용하였다. 반응이 종료된 후 ELISA 측정기에서 540 nm로 흡광도를 측정한 후 0 mg/#에서의 값을 0%로하여 각 농도별 억제능을 계산하였다.
- 에서 배양하였다. 배양된 세포에 과산화수소 400 μ M 을 넣고, 각 종류별 당귀 추출물의 농도를 0.625와 2.5 mg/#으로 조정하여 10 #씩 처리한 후 24시간 경과 뒤 이하 실험을 진행하였다.
- 정선군 재배 참당귀를 사용하였다. 본 실험을 위하여 재배지역과 기원을 확인하여 준비한 당귀재료 100 g 을 각각 3시간 동안물과 함께 전탕 한 후 여과액을 동결건조시켜 시료를 얻었으며, 실험에 필요한 농도별로 PBS 에 희석하여 본 실험에 사용하였다.
- 라디칼 소거효과를 이용한다. 본 연구의 경우 각 종류의당귀 농도를 0.078, 0.156, 0.313, 0.652, 1.25, 2.5, 5, 10 mg/#까지 사용하였으며, 0 m/I 를 100%로 하여 각 농도별 DPPH 소거효과를 나타내었다.
- 원산지와 기원을 확인할 수 있는 3종의 당귀를 이용하여 항산화효과, Apoptosis 억제, NO 제거 등의 효과를 측정하였다. 항산화 효과의 경우 홍천산 참당귀, 홍천산 일당귀, 정선산 참당귀순으로 항산화능이 나타났다.
- 여러가지 세포외 인자에 의하여 세포사가 유발될 경우 결정적인 요소인 미토콘드리아 내막과 외막에 있는 세포사멸 유전자에 영향을 미쳐 Bax 와 Bcl-2에 의하여 cytochrome C 가 미토콘드리아에서 빠져 나와 Caspase-3 효소를 활성화하여 세포가 죽음에 이르게 된다. 이러한 세포사 모델을 이용하여 과산화수소로 유발시킨 후 시료가 세포사를 억제하는지 확인하였다.
- BSA 를 농도별로 0, 1, 2, 4, 8, 16 #/#로 정한 후 96 well plate 에 20#씩 넣고, BCA 용액 100#를 첨가하여 20분간 37C 에서 방치한 다음 흡광도 540 nm 에서 측정하여 표준곡선을 작성하였다. 추출된 단백질 상충액 2#와 PBS 18#를 섞고, BCA 용액 100#을 혼합 후 20분간 37C 에서 방치한 후 540 nm 에서 측정하여 표준곡선을 이용하여 단백질농도를 계산하였다.
- 추출한 단백질 50#을 이용하여 caspase-3, Bcl-2, Bax, cytochrome C, Actin 을 확인하기 위하여 12.5% SDS-polyacrylamide gel 에 전기영동하여 nitrocellulose membrane 으로 transfer 하였다. 이 Membrane 을 5% skimmilk 을 함유한 PBS-Tween(0.
대상 데이터
- NO를 측정하기 위하여 RAW264.7(KCBL 40071)세포를 사용하였다. RAW264.
- 7(KCBL 40071)세포를 사용하였다. RAW264.7은 DMEM(GibcoBRL, USA)에 5% FBS와 Fungizone 를 첨가하여 37C, 5% CO2 에서 배양하였다. 배양된 세포를 24 well plate에 well에 5x104 5cells/# 세포로 조정된 세포 1#을 분주한 후 배양하다가, LPS 16 # (200 ng/#)와 당귀를 농도별로 10 #씩 처리한 후 12시간 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 세포는 사람 신경세포주 SK-N-MC 세포를 DMEM(GibcoBRL, USA) 에 5% FBS 와 Fungizone 를 첨가하여 37℃, 5% CO2 에서 배양하였다. 배양된 세포에 과산화수소 400 μ M 을 넣고, 각 종류별 당귀 추출물의 농도를 0.
- 본 실험에 사용한 당귀는 홍천군 재배 참당귀, 홍천군 재배 일당귀, 정선군 재배 참당귀를 사용하였다. 본 실험을 위하여 재배지역과 기원을 확인하여 준비한 당귀재료 100 g 을 각각 3시간 동안물과 함께 전탕 한 후 여과액을 동결건조시켜 시료를 얻었으며, 실험에 필요한 농도별로 PBS 에 희석하여 본 실험에 사용하였다.
- 본 연구에 사용된 항산화 모델은 세포사(apoptosis)시 생체내에서 유발되는 활성산소종의 하나인 과산화수소 (H2O2) 를 이용하였다. 여러가지 세포외 인자에 의하여 세포사가 유발될 경우 결정적인 요소인 미토콘드리아 내막과 외막에 있는 세포사멸 유전자에 영향을 미쳐 Bax 와 Bcl-2에 의하여 cytochrome C 가 미토콘드리아에서 빠져 나와 Caspase-3 효소를 활성화하여 세포가 죽음에 이르게 된다.
- 이러한 세포사 모델을 이용하여 과산화수소로 유발시킨 후 당귀가 세포사를 막을 수 있음을 증명하였다. 사용된 과산화수소의 농도는 400 μM 이며 당귀는 앞의 실험에서 가장 항산화 효과가 있는 0.625 와 2.5 m/I 을 사용하였다. 결과는 Fig.
성능/효과
- DPPH 소거능과 BSA degradation 의 결과에서 홍천군 재배 참당귀와 일당귀가 정선군 재재 참당귀에 비하여 비교적 좋은 결과를 나타내었다. 이런 결과를 같은 기원의 시료라도 생육조건이 다르기 때문에 활성에 차이가 있는 것으로 생각된다.
- 각각의 시료는 농도가 증가함에 따라 소거효과를 50% ~80% 까지 나타냈는데, 홍천산 참당귀와 홍천산 일당귀는 2.5 mg/I 에서 최대 소거 능력을 보였으며, 정선산 참당귀는 1.25 mg/I 에서 최대의 소거효과를 보였다 (Fig. 1). 홍천산 참당귀와 일당귀의 경우는 강26) 등의 논문 결과와 유사하게 나타났으며, 최 등33)의 결과에 의한 현미녹차, 홍차, 녹차 등의 다류와 비교할 때 당귀를 이용한 다류의 개발에 관심을 가질 수 있다.
- 625 m/I이상에서 세포사를 막는 것으로 나타났다. 과산화수소를 처리한 군에서 caspase-3 효소 활성화가 일어났으며, 세포질 내 Bcl-2가 감소하였고 Bax 와 cyto가irome C 는 증가 하였으나, 당귀 처리에 의하여 세포사가 방지됨을 확인할 수 있었다 (Fig. 3).
- 산화억제를 보였다. 본 실험에서 과산화수소에 의한 BSA 의 분해를 홍천산 일당귀가 가장 낮은 농도에서 나타내었다.
- 여러가지 세포외 인자에 의하여 세포사가 유발될 경우 결정적인 요소인 미토콘드리아 내막과 외막에 있는 세포사멸 유전자에 영향을 미쳐 Bax 와 Bcl-2에 의하여 cytochrome C 가미토콘드리아에서 빠져 나와 Caspase-3 효소를 활성화하여 세포가 죽음에 이르게 된다. 이러한 세포사 모델을 이용하여 과산화수소로 유발시킨 후 당귀가 세포사를 막을 수 있음을 증명하였다. 사용된 과산화수소의 농도는 400 μM 이며 당귀는 앞의 실험에서 가장 항산화 효과가 있는 0.
- 항산화 효과의 경우 홍천산 참당귀, 홍천산 일당귀, 정선산 참당귀순으로 항산화능이 나타났다. Apoptosis 의 경우는 모든 시료에서 비슷한 결과를 타내었다.
후속연구
- 대부분의 연구에서는 기원이나 원산지를 표기하였으나, 간혹 명확하지 않거나 기재하지 않은 경우들도 있었다. 원산지와 기원의 명확성은 기초연구뿐만 아니라, 한약재를 이용한 산업화 과정 중에서도 매우 중요한 자료가 될 것이다.
- 특히, 참당귀의 경우 재배지에 따라 다른 결과를 보일 수 있음을 알 수 있었다. 향후 재배지가 다른 동일 기원의 당귀를 대상으로 성분 및 효능에 대한 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
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