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문제 정의
- 본 실험은 淸肌散과 三黃洗劑加味方을 이용하여 in vivo 실험으로 아토피 유발 모델인 NC/Nga mice에 대해 항알레르기효과 및 아토피유발 억제를 알아보았다.
- 이에 저자는 淸肌散과 三黃洗劑加味方을 병용하여 NC/Nga atopic mice 병태 모델에 미치는 영향 및 다양한 면역학적 기전을 관찰하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
- A : Clinic기 skin features of dermatitis in NC/Nga atopic mice. B : Clinical skin severity of dermatitis in NC/Nga atopic mice.
제안 방법
- 7(1x106 cell) 를 60 mm plate 에서 배양한 후 LPS(1 ㎍/ml) 를 처리한 후 淸肌散 (CG) 10, 50, 100 mg/L 을 24시간 처리하였다. 24시간 처리 후 배양액을 제거하고 세포를 lysis buffer(RIPA buffer에 protease inhibitors(10 ㎍/ml Leupeptin, 1mM AEBSF, 10 ㎍/ml, Aprotinin, 10 ㎍/ml Pepstatin A) 와 phosphatase inhibitor(NasVO4) 처리하고, cell scraper로 세포를 모은 후얼음에서 30분간 반응 후 4C, 12000 rpm에서 원심분리하여, 상충액을 따서 BCA 방법으로 단백질 정량을 하였다. 10% SDS-PAGE gel 에 각 샘플 30 ㎍의 단백질을 전기영동하였다.
- 24시간 후 30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 100% ethan이에 차례로 조직을 담아서 탈수를 하였다. xylene 처리 후 파라핀에 조직을 담아서 24시간 동안 52 C incubater 에 보관하여 잔여 xylene 이 모두 증발하도록 하였다.
- 연구에 많이 사용되고 있다.29)그러나 NC/Nga mice 의 이런 장점에도 불구하고 자발적인 피부염 유도 비율이 낮고, 유도된 피부염의 정도차이가 심하여13) 본 실험에서는 DNCB 를 사용하여 아토피 피부염을 유발하여 실험을 진행하였다.
- LPS 를 사용하여 대식세포주인 RAW264.7세포에서 COX-2 의 활성을 유도한 모델에서 淸肌散 (CG) 의 효과를 살펴보았다. COX 효소에는 두 종류가 있는데, COX-1은 조직에서 지속적으로 만들어져 체내 생리적 항상성 유지에 필요한 prostaglandin 을 생성하지만 COX-2는 체내 염증자극시 유발되어 체내 염증질환이나 종양에 관련되는 것으로 알려져 있다.
- LPS(1 俸/ml) 를 사용하여 대 식세포주인 RAW 264.7(1 x106cell) 의 COX-2 활성을 유도한 모델에서 淸肌散 (CG) 을 50, 100, 200 mg/L 농도로 24시간 처리하여 COX-2 발현 정도를 Western Blot 수행하여 분석하였다. LPS 단독 처리군에 비해 淸 肌散 (CG) 의 농도에 의존적으로 억제됨을 확인하였다.
- NC/Nga mice 의 등 부위를 제모한 뒤 피부 조직을 1 g 떼어내어 DMEM 배양액으로 수세하여 미세조각으로 잘게 썬 후 10% FBS-DMEM 으로 Petri-dish 에서 7일간 배양하였다. 이후 배양 상충액을 제거하고 다시 10% FBS-DMEM 으로 교체하였다.
- RAW 264.7(1x106 cell) 를 60 mm plate 에서 배양한 후 LPS(1 ㎍/ml) 를 처리한 후 淸肌散 (CG) 10, 50, 100 mg/L 을 24시간 처리하였다. 24시간 처리 후 배양액을 제거하고 세포를 lysis buffer(RIPA buffer에 protease inhibitors(10 ㎍/ml Leupeptin, 1mM AEBSF, 10 ㎍/ml, Aprotinin, 10 ㎍/ml Pepstatin A) 와 phosphatase inhibitor(NasVO4) 처리하고, cell scraper로 세포를 모은 후얼음에서 30분간 반응 후 4C, 12000 rpm에서 원심분리하여, 상충액을 따서 BCA 방법으로 단백질 정량을 하였다.
- RT 반응은 준비된 total RNA 3 ㎕을 65C에서 5분 동안 변성시키고, 여기에 2.5 ㎕ 10 mM dNTPs, 1 ㎕ random sequence hexanucleotides (25 pmole/25 ^), RNA inhibitor로서 1 成 RNase inhibitor (20 U/㎕), 1 ㎕ 100 mM DTT, 4.5 ㎕ 5X RT buffer (250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCk) 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 ㎕가 되도록하였다. 이 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000rpm 에서 5초간 원심 침강하여 37C 항온 수조에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95C에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT 를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA 를 PCR 에 사용하였다.
- 24시간 후 30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 100% ethan이에 차례로 조직을 담아서 탈수를 하였다. xylene 처리 후 파라핀에 조직을 담아서 24시간 동안 52 C incubater 에 보관하여 잔여 xylene 이 모두 증발하도록 하였다. 조직을 임베딩 틀에 고정하여 파라핀이 충분히 굳은 후에 조직을 5 ㎛로 절편하여 슬라이드 글라스에 붙여서 37C 에서 24시간 동안 두어 조직이 슬라이드 글라스에 완전히 접착되도록 하였다.
- 淸肌散 (CG) 을 8주령부터 주 3회 구강으로 투여하고, 三黃洗 劑加味方 (SG) 분무를 8주령부터 일 2회 실시하여 8주부터 16주까지 2, 3, 3주(10, 13, 16주) 간격으로 NC/Nga mice 의 피부 손상정도를 측정하였다. 그 결과 대조군은 10주에 4.
- 淸肌散(CG)과 三黃洗劑加味方(SG)의 아토피 피부염 치료기전을 규명하기위해 NC/Nga mice 의 동물 병태 모델을 이용하여 다양한 면역 반응을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 18 ㎕ Taq polymerase (5 U/㎕) 를 첨가한 다음 최종 부피가 40 ㎕가 되도록 멸균증류수를 가하고 pre-denaturation; 95 C, 5분, denaturation; 95 C, 5분, annealing; 55 C, 1분, elongation; 72C, 1분을 25cycle한 뒤 post-elongation 을 72C 에서 3분 동안의 조건으로 PCR 을 수행하였다. 각 PCR product 는 20 ㎕씩 1.2% agarose gel 에 loading 하여 120 V 조건에서 20분간 전기영동을 통하여 분석하였다.
- 등부위를 충분히 적실 정도로 분무하였다. 대조군은 생리식염수를 淸肌散(CG)과 같은 용량, 용법으로 경구투여 하였으며, 외용제 또한 생리식염수를 실험군과 같은 방법으로 도포하였다. 아토피 피부염은 1-chloro 2, 4-dinitrobenzene(DNCB) 을 이용하여 유발하였다.
- 아토피 피부염은 1-chloro 2, 4-dinitrobenzene(DNCB) 을 이용하여 유발하였다. 먼저 NC/Nga mice의 등부위를 깨끗이 제모한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 실험 4일 전 1% DNCB용액 (acetone:olive oil=3:1) 200 ㎕를 등부위에 도포하고 실험 시작일부터 종료일까지 8주간 일주일에 2번 0.
- 반응은 이미 합성된 3 ㎕의 cDNA 를 주형으로 사용하고, 주형에 대한 primer 는 P-actin, IL-4, IL-5, IL-6, CCR3, IFN-y 유전자를 증폭하기 위하여 sense primer (20 pmol/㎕)와 antisense primer (20 pmol/㎕)를 혼합하여 1 ㎕를 가하고, 다시 3 ㎕ 2.5 mM dNTPs, 4 ㎕ 10xPCR buffer (100 mM Tris-HCl, pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCL), 0.18 ㎕ Taq polymerase (5 U/㎕) 를 첨가한 다음 최종 부피가 40 ㎕가 되도록 멸균증류수를 가하고 pre-denaturation; 95 C, 5분, denaturation; 95 C, 5분, annealing; 55 C, 1분, elongation; 72C, 1분을 25cycle한 뒤 post-elongation 을 72C 에서 3분 동안의 조건으로 PCR 을 수행하였다. 각 PCR product 는 20 ㎕씩 1.
- 세포배양은 10% fetal bovine serum(FBS) 과 100 unit/ml 의 penicillin/streptomycin 을 1% 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DEME) 배지를 사용하였고, 37C, 5% CO2 로 조정된 배양기내에서 배양하였으며, 배양액은 3일마다 교환하였다. 배양된 세포는 1x trypsin-EDTA 로 부유시킨 후 0.4% trypan blue로 염색하여 혈구계측기 (Hemocytometer)로 세포수를 계산하였다. 세포독성 시험은 배양된 세포를 96 well plate 에 5x103 cell/well이 되도록 세포 부유액을 120 ㎕씩 분주하여 배양한 후 실험에 사용하였다.
- 14). 배양후 RNA 를 분리한 후이를 이용하여 cDNA 를 합성하여 LPS 에 의해 생성된 cytokine 의측정하기 위해서 RT-PCR 을 수행하였다.
- 조직을 임베딩 틀에 고정하여 파라핀이 충분히 굳은 후에 조직을 5 ㎛로 절편하여 슬라이드 글라스에 붙여서 37C 에서 24시간 동안 두어 조직이 슬라이드 글라스에 완전히 접착되도록 하였다. 슬라이드 글라스를 xylene 에 담궈파라핀을 녹인 후, ethan이로 재수화시켜 hematoxylin- eosin(H&E) 염색을 실시하였다.
- 먼저 NC/Nga mice의 등부위를 깨끗이 제모한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 실험 4일 전 1% DNCB용액 (acetone:olive oil=3:1) 200 ㎕를 등부위에 도포하고 실험 시작일부터 종료일까지 8주간 일주일에 2번 0.2% DNCB용액 150㎕를 등부위에 도포하였다.
- 실험군은 淸肌散(CG)을 8주간 주 3회(월, 수, 금) 경구투여 (250 ㎎/㎏) 하였으며, 외용제인 三黃洗劑加味方(SG)는 매일 2 회 등부위를 충분히 적실 정도로 분무하였다. 대조군은 생리식염수를 淸肌散(CG)과 같은 용량, 용법으로 경구투여 하였으며, 외용제 또한 생리식염수를 실험군과 같은 방법으로 도포하였다.
- 실험에 사용된 16주령의 NC/Nga mice 를 ethyl ether 로 마취한 후 심장 천자법으로 혈액을 채혈하여 혈청을 분리한 후 혈청중 IL-4, 5, INF-y, IgM, IgG1 량을 ELISA kit 로 정량하였다.
- 대조군은 생리식염수를 淸肌散(CG)과 같은 용량, 용법으로 경구투여 하였으며, 외용제 또한 생리식염수를 실험군과 같은 방법으로 도포하였다. 아토피 피부염은 1-chloro 2, 4-dinitrobenzene(DNCB) 을 이용하여 유발하였다. 먼저 NC/Nga mice의 등부위를 깨끗이 제모한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다.
- 역 전사중합연쇄 반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction; RT-PCR) 은 역전사 kit(promega, Madison USA) 와 중합연쇄반응 kit(Pre-mix, 한국생공, 대덕)를 이용하여 실시하였다. 즉 rapid guanidium isothiocyanate 방법으로 마우스 대식세포주로부터 추출한 0.
- 염증반응의 중요한 cytokine 들인 IL-1P, TNF-a, IL-6 의 발현도를 분석하기 위해서 마우스 대식세포주 RAW 264.7에 淸肌散 (CG) 10, 50, 100 mg/L 을 LPS(0.1 ㎍/ml) 로 자극하기 30분 전에처리하고 20시간 배양하였다 (Fig. 14). 배양후 RNA 를 분리한 후이를 이용하여 cDNA 를 합성하여 LPS 에 의해 생성된 cytokine 의측정하기 위해서 RT-PCR 을 수행하였다.
- 3, 375 mM KCl, 15 mM MgCk) 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 ㎕가 되도록하였다. 이 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000rpm 에서 5초간 원심 침강하여 37C 항온 수조에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95C에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT 를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA 를 PCR 에 사용하였다.
- 평가항목은 홍반, 찰상, 부종과 혈종, 짓무름, 그리고 태선화로 나누어진다. 이 각각의 항목은 없음(0), 약함(1), 중증도 , (2) 심함(3)으로 나누어서 채점하였다.
- 장치로 농축하여 600 ml을 얻었다. 이 농축액을 개체당 1 ml(10 mg)을 주 3회 경구투여 하였다.
- 이후 배양 상충액을 제거하고 다시 10% FBS-DMEM 으로 교체하였다. 이를 7일간 배양하여 배양 상충액을 분리한 후 배양액내의 IL-6 분비량을 ELISA kit로 측정하였다.
- 즉 rapid guanidium isothiocyanate 방법으로 마우스 대식세포주로부터 추출한 0.5 ㎍의 total RNA 를 역전사반응액 (0.1 ㎍; oligo (dT)15, reverse transcription buffer, 5 mM MgCl2, 1 mM dNTP mixture, 10unit; rRNase ribonuclease inhibitor, 10units; AMV reverse transcriptase) 과 혼합하여 42C 에서 30 분간 반응시켜 cDNA 를 합성하였다. 합성한 cDNA 1 ㎕ (0.
- 석 하여 처리 농도별로 사용하였다. 처리 농도는 10, 50, 100, 200, 300, 500, 1000 mg/L로 처리하고, 처리시간은 24시간으로 실시하였다.
- 추출한 한약물을 처리 당일 FBS 가 첨가되지 않은 DMEM 에희 석 하여 처리 농도별로 사용하였다. 처리 농도는 10, 50, 100, 200, 300, 500, 1000 mg/L로 처리하고, 처리시간은 24시간으로 실시하였다.
- 1 ㎍; oligo (dT)15, reverse transcription buffer, 5 mM MgCl2, 1 mM dNTP mixture, 10unit; rRNase ribonuclease inhibitor, 10units; AMV reverse transcriptase) 과 혼합하여 42C 에서 30 분간 반응시켜 cDNA 를 합성하였다. 합성한 cDNA 1 ㎕ (0.01 ㎍), cytokine 혹은 p-actin primers 각각 1 ㎕(25 pg), 그리고 중합연쇄반응액 (Premix, 한국생공, 대덕; 1unit; thermostable DNA polymerase, 0.25 mM dNTP, 50 mM Tris-HCl (pH 9.0), 40 mM KCl, 1.5 mM MgCL) 17 ㎕을 혼합한 후 Perkin elmer (GeneAmp PCR system 2400)를 이용하여 95℃에서 30초, 62'C 에서 30초, 72C에서 30초 동안 30회 반복 실시하여 증폭된 cDNA는 1.2% agarose gel에서 전기영동하였다. Cytokines의 mRNA/Q-actin mRNA 양은 ethidium bromide로 염색한 band density를 Fluor-STM Imager (Bio-Rad, Muncher, Germany)로 측정하여 정량하였다.
- 혈청내 IgE 와 IL-6 의 량은 8주, 10주, 13주, 16주에 mice 의 눈에서 capillary tube를 이용하여 약 100 ㎕의 혈액을 채혈한 후원심분리기로 혈청을 분리하여 IgE량을 ELISA Kit로 측정하였다. 실험에 사용된 16주령의 NC/Nga mice 를 ethyl ether 로 마취한 후 심장 천자법으로 혈액을 채혈하여 혈청을 분리한 후 혈청중 IL-4, 5, INF-y, IgM, IgG1 량을 ELISA kit 로 정량하였다.
대상 데이터
- 24마리의 NC/Nga atopic mice 를 정상군, 대조군, 실험군 각각 8마리씩 나누어 실험을 시행하였다.
- 대식세포주인 RAW 264.7(monocyte)는 Korean Cell Line Bank(KCLB)로 구입하였다. 세포 배양은 10% fetal bovine serum(FBS) 과 100 unit/ml 의 penicillin/ streptomycin 을 1% 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DEME) 배지를 사용하며, 37C, 5% CO2 incubator 에서 배양하였다.
- 있다. 따라서 NC/Nga mice 의 아토피 피부염에 효능이 있으리라 사료되어 경구투여 약물로 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 淸肌散 (CG) 과 三黃洗劑加味方 (SG) 의 약제는 원광대학교 광주한방병원에서 구입한 후 정선하여 사용하였고, 淸肌散 1첩 및 三黃洗劑加味方의 내용과 구성은 다음과 같다 (Table 1, 2).
- 본 실험에서는 三黃洗劑에 淸熱解毒의 효능이 있는 金銀花, 連翹, 馬齒竟을 가미하여 외용제로 사용하였다.
- 생쥐 섬유모세포의 일종인 L929 세포주를 사용하였다. 세포배양은 10% fetal bovine serum(FBS) 과 100 unit/ml 의 penicillin/streptomycin 을 1% 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DEME) 배지를 사용하였고, 37C, 5% CO2 로 조정된 배양기내에서 배양하였으며, 배양액은 3일마다 교환하였다.
- 7(monocyte)는 Korean Cell Line Bank(KCLB)로 구입하였다. 세포 배양은 10% fetal bovine serum(FBS) 과 100 unit/ml 의 penicillin/ streptomycin 을 1% 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DEME) 배지를 사용하며, 37C, 5% CO2 incubator 에서 배양하였다.
- 세포배양은 10% fetal bovine serum(FBS) 과 100 unit/ml 의 penicillin/streptomycin 을 1% 첨가한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DEME) 배지를 사용하였고, 37C, 5% CO2 로 조정된 배양기내에서 배양하였으며, 배양액은 3일마다 교환하였다. 배양된 세포는 1x trypsin-EDTA 로 부유시킨 후 0.
- 웅성(雄性) 6주령 30 g 내외의 Balb/c계 NC/Nga atopic dermatitis model mice(NC/Nga atopic mice) 를 중앙실험동물에서 공급받아 실험당일까지 고형사료와 물을 공급하고 실온 22± 2℃, 상대습도 50~65%, 조도 200 lux(8 시 점등, 20시 소등)를 계속 유지하면서 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 통계학적 유의성 검정은 one-way ANOVA (Analysis of Variance) 방법을 사용하였으며, 유의수준 p<0.01의 범위내에서 그 결과들은 평균에 대한 표준 편차로 나타내었다.
이론/모형
- secondary Ab (1:2000) 로 2 시간 동안 incubation 하였다. ECL 방법으로 COX-2 band 를 detection하였다.
- NC/Nga mice의 피부염은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 육안 평가법을 이용하여 측정하였다. 육안평가 결과는 다음의 5가지 항목을 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타낸다.
- PCRe GeneAmp PCR system 2400을 이용하여 수행하였다. 반응은 이미 합성된 3 ㎕의 cDNA 를 주형으로 사용하고, 주형에 대한 primer 는 P-actin, IL-4, IL-5, IL-6, CCR3, IFN-y 유전자를 증폭하기 위하여 sense primer (20 pmol/㎕)와 antisense primer (20 pmol/㎕)를 혼합하여 1 ㎕를 가하고, 다시 3 ㎕ 2.
성능/효과
- NC/Nga mice의 피부 조직 배양에서 IL-4, Ⅱ.-5, CCR3 유전자 발현은 실험군이 대조군에 비하여 현저히 감소하였고, IL-6 발현량은 유의성 있게 감소하였으며, IFN-y의 유전자발현은 실험군이 대조군에 비하여 증가하였다. NC/Nga mice 의귀와 등 피부 조직 변화에서는 표피와 진피의 염증 정도와 침윤된 염증 면역 세포 등이 실험군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소되었다.
- COX 효소에는 두 종류가 있는데, COX-1은 조직에서 지속적으로 만들어져 체내 생리적 항상성 유지에 필요한 prostaglandin 을 생성하지만 COX-2는 체내 염증자극시 유발되어 체내 염증질환이나 종양에 관련되는 것으로 알려져 있다.34) 淸肌散 (CG) 을 10, 50, 100 mg/L처리한 군에서는 대조군에 비해 40%, 45%, 50% 정도의 COX-2 발현 억제 효과가 있는 것으로 나타났다.
- 9). Chemokine 인 CCR3 mRNA 발현은 정상군이 1 (IF), NC/Nga 대조군이 1.72 (IF)로 나타났고, 실험군이 0.79 (IF) 으로 나타나 대조군에 비하여 현저히 감소하였다 (Fig. 10).
- Conventional 조건에서는 8주부터 16주까지 2, 3, 3주(10, 13, 16주) 간격으로 피부 손상정도를 측정한 결과 대조군은 10주에 4.50±1.20, 13주에 6.83±1.40로 급격한 증가를 나타내었으며, 실험종료 전 16주령은 9.50±1.20로 나타났다. 이에 반해 실험군은 10 주까지는 대조군과 약간 감소한 3.
- LPS 단독 처리군에 비해 淸 肌散 (CG) 의 농도에 의존적으로 억제됨을 확인하였다. Fig. 13에서 같이 10, 50 mg/L 을 처리한 군에서 40, 45% 정도 발현 억제효과가 나타남을 확인하였고, 100 mg/L에서는 50%정도의 COX-2 발현 억제 효과가 있는 것으로 나타냈었다(Fig. 13).
- 7). IFN-y mRNA 발현은 정상군이 1 (IF), 대조군이 1.30 (IF) 로 나타났고, 실험군이 4.90 (IF)으로 나타나 대조군에 비하여 현저히 증가하였다(Fig. 8). IL-5 mRNA 발현은 정상군이 1 (IF), 대조군이 1.
- IFN-ye Th1 세포가 분비하는 가장 중요한 cytokine이며, IL-4, IL-5 은 Th2 세포가 분비하는 가장 중요한 cytokine 이라 할수 있는데, 31) 위의 결과를 종합하여 보면 Th1 세포가 분비하는 IFN-y가 상승함으로써 Th2세포의 작용이 억제되어 IL-4, Ⅱ.-5, IgE의 분비가 감소하는 것을 알 수 있다.
- 4%으로 나타나 淸肌散 (CG) 의 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. IL-6 은 House keeping gene 인 Q-actin 의 양과 비교 측정시 Table 5 에서 같이 淸肌散 (CG) 을 10, 50, 100 mg/L 의 처리하였을때 IL-6의 발현량이 LPS에 비해 69.5%, 51.5%, 45.8%으로 나타나 淸肌散(CG) 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다.
- 7(1 x106cell) 의 COX-2 활성을 유도한 모델에서 淸肌散 (CG) 을 50, 100, 200 mg/L 농도로 24시간 처리하여 COX-2 발현 정도를 Western Blot 수행하여 분석하였다. LPS 단독 처리군에 비해 淸 肌散 (CG) 의 농도에 의존적으로 억제됨을 확인하였다. Fig.
- NC/Nga mice 의 피부 손상 정도는 13주와 16주에 실험군이 대조군에 비하여 각각 42%, 50% 감소하였다. NC/Nga mice의 혈중 I gE, IL-4, IL-5, IL-6, IgM 및 IgG1 수준은 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, IFN-y 수준은 유의성 있게 증가하였다.
- -5, CCR3 유전자 발현은 실험군이 대조군에 비하여 현저히 감소하였고, IL-6 발현량은 유의성 있게 감소하였으며, IFN-y의 유전자발현은 실험군이 대조군에 비하여 증가하였다. NC/Nga mice 의귀와 등 피부 조직 변화에서는 표피와 진피의 염증 정도와 침윤된 염증 면역 세포 등이 실험군에서 대조군에 비하여 유의성 있게 감소되었다. RAW 264.
- 비하여 각각 42%, 50% 감소하였다. NC/Nga mice의 혈중 I gE, IL-4, IL-5, IL-6, IgM 및 IgG1 수준은 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, IFN-y 수준은 유의성 있게 증가하였다. NC/Nga mice의 피부 조직 배양에서 IL-4, Ⅱ.
- 7에서 염증성 cytokine 발현도에 대한 실험에서 IL-1P, TNF-a, IL-6 유전자 발현은 실험군이 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다. RAW 264.7에서 COX-2 활성을 유도한 모델의 항염증 효과에 의하면 실험군이 대조군에 비해 농도 의존적으로 억제되었다.
- RT-PCR 결과 IL-고은 House keeping gene 인 Q-actin의 양과 비교 측정시 Table 3 에서 같이 淸肌散(CG)을 10, 50, 100 mg/L 의 처리하였을때 IL-1Q 의 발현량이 LPS 에 비해 89.6%, 78.2%, 59.3%으로 나타나 淸肌散 (CG) 의 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. TNF-a 은 House keeping gene 인 Q-actin 의 양과 비교 측정시 Table 4 에서 같이 淸肌散 (CG) 을 10, 50, 100 mg/L 의 처리하였을때 TNF-a의 발현량이 LPS에 비해 87.
- 3%으로 나타나 淸肌散 (CG) 의 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. TNF-a 은 House keeping gene 인 Q-actin 의 양과 비교 측정시 Table 4 에서 같이 淸肌散 (CG) 을 10, 50, 100 mg/L 의 처리하였을때 TNF-a의 발현량이 LPS에 비해 87.3%, 69.4%, 65.4%으로 나타나 淸肌散 (CG) 의 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. IL-6 은 House keeping gene 인 Q-actin 의 양과 비교 측정시 Table 5 에서 같이 淸肌散 (CG) 을 10, 50, 100 mg/L 의 처리하였을때 IL-6의 발현량이 LPS에 비해 69.
- 淸肌散 (CG) 과 三黃洗劑加味方 (SG) 을 처리한 NC/Nga mice 의 혈액에서 IgE 수치는 13주와 16주에서 대조군에 비하여 약 70.4%와 66.1%의 유의성 있는(p<0.01) 감소를 나타내었고(Fig. 2A), 혈중 IL-6 수치도 대조군에 13주와 16주에서 비하여 각각 67.8%, 65%의 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타냈다 (Fig. 2B).
- 淸肌散 (CG) 을 구강으로 투여하고, 三黃洗劑加味方 (SG) 분무를 8주령부터 실시하여 NC/Nga mice 의 피부손상정도를 관찰한 결과, NC/Nga mice 가 자연적으로 피부염으로 유발된 conventional 조건에서는 10주 이후 피부 발진이 유발된 것을 알수 있었다 (Fig. 1A).
- 淸肌散(CG)의 염증성 cytokine 발현도에 대한 효과(Fig. 12) 는 IL-고는 淸肌散(CG)을 10, 50, 100 mg/L의 처리시 89.6%, 78.2%, 59.3%으로 농도 의존적으로 억제되었으며 (Table 3), TNF- a 에서는 10, 50, 100 mg/L 의 처리시 87.3%, 69.4%, 65.4%으로 나타나 농도 의존적으로 억제되었으며 (Table 4), IL-6 에서도 10, 50, 100 mg/L 의 처리시 69.5%, 51.5%, 45.8%으로 나타나 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다(Table 5). 이로써 淸肌散(CG)이 LPS 에 의해 비만세포에서 분비되는 cytokine 들을 농도 의존적으로 감소시키는 효과가 있는 것으로 확인되었다.
- 측정하였다. 그 결과 대조군은 10주에 4.50±0.90, 13주에 6.83±1.40으로 급격한 증가를 나타내었으며, 실험 종료 전 16 주령은 9.50±1.20로 나타났다. 이에 반해 실험군은 10주까지는 대조군과 비교하여 약간 감소한 3.
- 본 실험에서 IgE 의 생산과 관련되는 IgM 과 B 세포 분화 중에 비례적으로 증가되는 IgG1의 면역 글로불린의 변화에서 IgM 은 대조군에 비하여 36.8%, IgG1은 대조군에 비하여 46%정도의 유의성 있는 감소를 나타내었다 (Fig. 5, 6).
- 분비되어30) 피부손상을 일으킨다. 본 실험에서 IgE가 실험군에서 유의성 있게 감소한 것으로 확인되어 IgE 매개 염증반응으로 인한 피부손상이 억제되는 것을 알 수 있었다.
- 본 실험에서 혈청 중 IFN-y 수치는 대조군에 비하여 약 1.81 배로 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 나타내었다(Fig. 4). IFN-y의 주된 생리적 기능은 면역반응을 조절하는 것이다.
- 실험군에서는 대조군에 비하여 표피와 진피의 두께가 다소 줄어들었고, 표피의 각질화도 심하지 않은 것으로 관찰되었다 (Fig. 15).
- 8%으로 나타나 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다(Table 5). 이로써 淸肌散(CG)이 LPS 에 의해 비만세포에서 분비되는 cytokine 들을 농도 의존적으로 감소시키는 효과가 있는 것으로 확인되었다.
- -5, IgE의 분비가 감소하는 것을 알 수 있다. 이에 따라 NC/Nga mice 의 아토피 피부염의 증상이 호전되는 것을 육안적인 검사 (Fig. 1A, 1B.) 와 조직검사상에 확인할 수 있었다 (Fig.15, 16).
- 정상 NC/Nga mice 의 귀 조직에서는 표피, 진피, 그리고 연골이 뚜렷하게 관찰되었으나, 대조군은 표피충이 두꺼워져 있고, 진피충은 콜라겐의 부종이 있고, 혈관의 확장이 관찰되었다.
- 정상 NC/Nga mice의 피부 조직에서는 표피, 진피, 그리고 기저부선이 관찰되나, 대조군에서는 표피가 전반적으로 확장되었으며, 진피의 부종이 심한 것으로 관찰되었다. 반면, 실험군은 대조군에 비하여 표피의 각화와 진피의 부종이 심하지 않고, 염증세포의 침윤도 덜 관찰되었다 (Fig.
- 혈청 IFN-Y 수준은 최종 16주령 정상군에서는 11.20+1.30 pg/ml, 대조군에서 481.60+74.27 pg/ml, 실험군에서 875.20+33.13 pg/ml로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 나타냈다(Fig. 4).
- 혈청 IgM 수준은 최종 16주령에서 정상군은 58.40+8.84 ㎍ /ml, 대조군은 568.60+42.82 ㎍/ml로 나타난 반면, 실험군은 359.00+36.37 ㎍/ml로 나타나 대조군에 비하여 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타냈다 (Fig. 5).
후속연구
- 본 실험을 통하여 NC/Nga mice 의 아토피 피부염에 대한 淸 肌散 (CG) 과 三黃洗劑加味方 (SG) 병용의 효과를 알 수 있었고 향후 아토피 피부염의 치료 범위 확대에 기여할 것으로 사료된다.
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