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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 임상적 유용성을 지닌 처방의 객관적인 효능 규명을 통하여 EBM(Evidence based medicine)을 구축함과 동시에 임상에서의 활용성 제고를 위한 기초적 자료를 제공하기 위하여 ‘石紫解肌湯’을 시료로 산화적 손상과 기본적인 염증 유관 인자에 미치는 영향을 검색하고자 하였다.
제안 방법
- 150 mM DPPH/EtOH 150 ㎕에 SHT을 25, 50, 100, 200, 400, 800 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 100 ㎕씩 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이를 ELISA reader를 이용하여 wave length 517nm에서 흡광도를 측정한 후 아래의 방법으로 계산하였다.
- 48 well plate에 Raw 264.7 세포를 2 × 105/well/400 ㎕씩 첨가하고 LPS 1㎍/㎖ 및 SHT 50, 100, 200 ㎍/㎖ 농도를 처리한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다.
- 6 well culture plates에 Raw 264.7 세포를 3× 105 cells/㎖로 분주하여 24시간 동안 배양한 후, SHT 각각의 농도를 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖로 처리하고, LPS 1 ㎍/㎖을 처리하여, 다시 24시간 동안 배양하였다.
- NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System을 이용하여 측정하였다. Raw 264.
- N1 buffer를 50 ㎕를 각 well에 처리한 후, 10분간 상온에서 암소반응 후, N2 buffer 50 ㎕를 각 well에 처리하고, 10분간 반응시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.
- SHT의 세포독성 여부를 확인하기 위해 Raw 264.7 세포를 이용하여 세포독성을 확인하였다. Raw 264.
- 石紫解肌湯(SHT)이 아토피피부염 치료제로써의 가능성 및 효과를 살펴보기 위하여 세포독성 및 항산화 효능 평가, in vitro에서 염증 반응 조절 및 억제 효과를 확인한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 배양 종료 후 DCF-DA 10 μM을 처리하여 15분 동안 빛이 차단된 상온에서 배양한 후 차가운 PBS를 넣어 1,200 rpm에서 5분간 원심분리한 다음 상청액을 제거하고 다시 PBS 400 ㎕를 부유시켜 유세포 분석기(Flow cytometer)를 이용하여 형광강도의 세기에 따른 ROS를 측정하였다.
- 배양 후 세포배양액을 수거하여 배양액에 함유된 IL-1β, IL-6, MCP-1, TNF-α를 custom-made 4-plex cytokine Milliplex panel을 이용하여 다음과 같이 측정하였다.
- 시료 추출 방법은 SHT 2첩을 한약 유출기에 넣고, 증류수 1200 ㎖와 같이 혼합하여 3시간 열탕하여 추출한 후 흡입 여과하였다. 이를 rotary vacuum evaporator에서 감압 농축하여 SHT을 분리한 후, 다시 동결 건조기에서 24시간 동결건조하여 분말 18.
- 따라서 본 연구에서는 임상적 유용성을 지닌 처방의 객관적인 효능 규명을 통하여 EBM(Evidence based medicine)을 구축함과 동시에 임상에서의 활용성 제고를 위한 기초적 자료를 제공하기 위하여 ‘石紫解肌湯’을 시료로 산화적 손상과 기본적인 염증 유관 인자에 미치는 영향을 검색하고자 하였다. 최근 보고된 아토피피부염에 대한 효능 평가에서 산화적 손상과 염증 유관인자에 대한 효능 평가는 기본적인 검색 방법으로 사용되고 있어, 본 실험에서는 동물 실험에 앞서 in vitro에서 기본적인 검색을 통한 객관적인 효능 규명에 중점을 두었다.
대상 데이터
- Raw 264.7 세포 내에서 reactive oxygen species (ROS)를 측정하기 위하여 2',7'- Dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA)를 이용하였다.
- 본 실험에 사용된 기기는 rotary vacuum evaporator (EYELA Co, Japan), CO2 incubator (Sanyo Co, Japan), autoclave, deep-freezer (Nihon Co, Japan), clean bench, water bath, vortex mixer, heating block, Ice Flaker Machine (Icematic Co, Italy), plate shaker (Lab-line Co, USA), flow cytometer (Becton Dickinson, USA), centrifuge (Hanil Co, Korea), 48well microchamber (Neuroprobe, Gaithersburg, MD, USA), ELISA reader (Molecular Devices, Co, USA), Luminex (Millipore, Co, USA) 등을 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 ‘石紫解肌湯’ (Seokjahaekitang ; 이하 SHT)의 구성 약재들은 대전대학교 난치성면역질환의 동서생명의학연구센터 (TBRC)에서 구입하여 정선하여 사용하였고, 그 내용과 분량 (1첩)은 다음과 같다.
- 실험에 사용된 시약 중 trypan-EDTA, acetic acid, tris-base, tris-HCl, dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2',7'- Dichlorodihydrofluorescin diacetate (DCFH-DA) 등은 Sigma (USA)사 제품을, MTT assay kit(EZ CyTox)는 Daeil Lab Service (Korea)사 제품을, NO assay kit는 인트론 바이오 (Korea)사 제품을, IL-4, IL-5, IL-6, IL-13, TNF-α, IFN-γ Milliplex panel (IL-1β, IL-6, MCP-1, TNF-α)은 Millipore (USA)사 제품을 구입하여 사용하였으며, 기타 일반 시약은 특급 시약을 사용하였다.
데이터처리
- Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (***, p<0.001).
- The result were presented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (**, p<0.01).
- The result were presented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*, p<0.05).
- The result were presented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with control group by student's t-test (*, p<0.05, ***, p<0.001).
- The results were represented by the mean ± S.E. Statistically significant value was calculated by compared with normal group by student's t-test (+++, p<0.001).
- 다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean ± standard error (S.E.)로 기록하였고, 유의성 검증은 Student＇s t-test 분석법을 이용하여 결정하였다.
성능/효과
- ,MCP-1생성량은 100, 200 (㎍/㎖) 농도에서 5.8, 4.9 % 감소하였고, 100 (㎍/㎖) 농도에서 대조군에 비하여 유의성 있는 (*, p<0.05) 감소를 나타내었다 (Fig. 7).
- Griess Reagent System을 이용하여 Raw 264.7 세포 내 생성되는 NO 양을 측정한 결과, 대조군을 100 %로 나타냈을 때 정상군이 20.8 ± 1.1 % 로 나타나 대조군에서 정상군에 비하여 유의성 있는 (+++, p<0.001) 증가를 나타내었고, SHT 투여군은 50, 100, 200 (㎍/㎖) 농도에서 각각 79.6 ± 1.1, 73.9 ± 2.8, 71.2 ± 1.6 (%) 로 대조군에 비하여 모든 농도에서 유의성 있는 (***, p<0.001) 감소를 나타내었다 (Fig. 4).
- IL-1β 생성량을 측정한 결과, 대조군을 100 (%)로 나타냈을 때 SHT 처리군은 50, 100, 200 (㎍/㎖) 농도에서 각각 50.0 ± 5.0, 67.5 ± 2.5, 66.7 ± 17.7 (%)로 나타났으며, SHT 처리군의 50(㎍/㎖) 농도에서 대조군에 비하여 유의성 있는 (**, p<0.01) 감소를 나타내었다 (Fig. 5).
- IL-6 생성량을 측정한 결과, 대조군을 100 (%)로 나타냈을 때 SHT 처리군은 50, 100, 200 (㎍/㎖) 농도에서 각각 79.63 ± 7.1, 79.1 ± 3.8, 69.0 ± 0.3 (%)로 나타났으며, SHT 처리 군의 100, 200 (㎍/㎖) 농도에서 대조군에 비하여 각각 유의성 있는 (*, p<0.05, ***, p<0.001) 감소를 나타내었다 (Fig. 6).
- MCP-1 생성량을 측정한 결과, 대조군을 100 (%)로 나타냈을 때 SHT 처리군은 50, 100, 200 (㎍/㎖) 농도에서 각각 102.2 ± 2.2, 94.2 ± 1.2, 95.1 ± 2.6 (%) 으로 나타났으며, SHT 처리군의 100(㎍/㎖) 농도에서 대조군에 비하여 유의성 있는 (*, p<0.05) 감소를 나타내었다 (Fig. 7).
- Raw 264.7 세포내 생성되는 ROS 양을 측정한 결과, 대조군(B)의 ROS 생산율이 100 (%) 일 때 SHT(C,D,E) 처리군의 50, 100, 200 (㎍/㎖) 농도에서 대조군에 비하여 각각 66.7, 64.8, 57.4 (%)로 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다 (Fig. 3).
- SHT은 DPPH 소거 활성에서 농도 의존적으로 소거 활성을 나타내었으며, 특히 400 (㎍/㎖)와 800 (㎍/㎖)의 농도에서 80% 이상의 소거 활성 효과를 나타내었다.
- SHT은 LPS를 처리한 Raw 264.7 cells의 200 (㎍/㎖) 농도에서 대조군에 비해 IL-1β, IL-6, MCP-1, TNF-α 생성량을 각각 32.3%, 31.0%, 4.9%, 7.1% 감소시켰으나, IL-6와 TNF-α에서만 유의성이 나타났다.
- SHT은 NO 생성율을 대조군에 비해 농도 의존 적으로 감소시켰으며, 200 (㎍/㎖) 농도 처리군에서는 28.8%의 유의성 있는 감소가 나타났다.
- SHT은 ROS 생성율을 대조군에 비해 농도 의존적으로 감소시켰으며, 200 (㎍/㎖)의 농도에서는 57.4% 억제 효과를 나타내었다.
- TNF-α 생성량을 측정한 결과, 대조군을 100 (%)로 나타냈을 때 SHT 처리군은 50, 100, 200(㎍/㎖) 농도는 102.2 ± 2.2, 98.6 ± 2.9, 92.9 ± 1.9 (%)로 나타났으며, SHT 처리군의 200 (㎍/㎖) 농도에서 대조군에 비하여 유의성 있는 (*, p<0.05) 감소를 나타내었다 (Fig. 8).
- 53). 결과적으로 NO는 활성산소종 중에 가려움의 증강에 깊이 관여하고 있는 것으로 보여, NO 억제는 아토피 등의 피부염의 유발뿐만 아니라 악화 등을 억제할 수 있을 것으로 생각되어 진다.
- 2). 또한 Raw 264.7 세포내 생성되는 ROS 양을 측정한 결과 대조군에 비하여 50, 100, 200 (㎍/㎖) 농도의 SHT 처리군에서 33.3, 35.2, 42.6% 감소하는 것으로 나타나 (Fig. 3), SHT가 염증 유관 인자로 인식되고 있는 산화적 스트레스에 대하여 유의성이 있음을 객관적으로 확인할 수 있었다.
- 또한 TNF-α의 생성량은 100, 200 (㎍/㎖) 농도에서 1.4, 7.1 % 감소하였고, 200 (㎍/㎖) 농도에서 대조군에 비하여 유의성 있는 (*, p<0.05) 감소를 나타내었다 (Fig. 8).
- 본 연구에서 먼저 기본적인 실험으로 실시한 세포독성에 관한 실험에서는 Raw 264.7 세포에 대하여 25, 50, 100, 200 (㎍/㎖) 농도에서 모두 100%의 이상의 세포 생존율을 보여 SHT가 세포독성이 없는 것으로 나타났다 (Fig. 1).
- 본 연구에서는 Griess Reagent System을 이용하여 Raw 264.7 세포에 LPS를 처리하여 생성되는 NO 양을 측정한 결과, 50, 100, 200 (㎍/㎖) 농도 투여에서 각각 20.4, 25.0, 28.7 %로 유의성 있게(***, p<0.001) 감소하는 것으로 나타나 (Fig. 4), SHT가 NO 생성으로 인한 병리학적 변화에 유의성이 있음을 확인할 수 있었다.
- 본 연구에서는 산화적 손상에 대한 효능 평가를 위하여 DPPH radical의 소거능을 측정한 결과, 25, 50, 100, 200, 400, 800 (㎍/㎖) 농도에서 각각 16.2 ± 0.4, 41.4 ± 0.5, 54.8 ± 0.7, 65.4 ± 4.1, 90.8 ± 1.0, 92.9 ± 0.4 (%)로 SHT가 농도 의존적으로 DPPH radical의 소거 활성 효과를 나타내었다 (Fig. 2).
- 본 연구에서는 생쥐 마크로파지 세포주인 raw 264.7 세포를 LPS로 자극하여 생산 유도된 염증성 사이토카인 생성량을 측정한 결과, IL-1β 생성량이 50, 100, 200 (㎍/㎖) 농도에서 각각 50, 32.5, 33.3 % 감소하였으며 50(㎍/㎖) 농도에서 유의성 있는 (**, p<0.01) 감소를 나타냈다 (Fig. 5).
- 세포독성을 관찰한 결과 Raw 264.7 세포에서는 대조군의 세포생존율 100 ± 0.0 (%)에 대하여, SHT의 25, 50, 100, 200 (㎍/㎖) 농도에서 각각 137.3 ± 10.8, 118.5 ± 12.0, 109.3 ± 8.7, 112.7 ± 10.0 (%)으로 나타났다 (Fig. 1).
- 이상의 결과를 통하여 ‘石紫解肌湯’ (SHT)이 항산화 활성과 LPS에 이해 유도된 Raw 264.7세포내 사이토카인 생성량에 대하여 유의성 있는 억제를 나타냄으로써 기본적인 항염증 효능이 객관적으로 입증되었다.
후속연구
- 이상의 결과로 보아 石紫解肌湯(SHT)의 염증 반응 조절 및 억제 효과가 실험적으로 검증되어 임상에서 항아토피 치료제로써의 활용이 제고될 것으로 기대되며, 향 후 이를 기본방으로 가감을 통한 염증 질환에 다양하게 응용될 수 있을 것으로 사료된다.
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