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문제 정의
- 본 연구에서는 효소분해법으로 직접 제조한 키토산 가수분해물의 정상세포에 대한 세포 독성, 종양세포에 대한 in vitro 항종양성에 대하여 조사하였다.
제안 방법
- 02% 되도록 하였다. 20 ㎕씩 각 well에 가한 시료의 최종 농도는 well당 각각 1,200, 600, 300, 150 및 75 ㎕/㎖가 되도록 하였다. 한 가지 농도군에 대해서는 1컬럼(8 wells)을 동일한 조건으로 사용하며, 나머지 한 컬럼에는 약물 대신 PBS(0.
- 후)제거하였다 (이">제거하였다(이 때 각 well의 바닥에 형성된 formazan 결정이 흐트러지지 않도록 주의하였다). 배지가 제거된 각 well에 DMSO를 150 ㎕씩 가한 후에 formazan 결정이 녹을 때까지 약 10분간 가볍게 진탕해 주고 바로 microplate reader(scanning multiwell spectrophotometer)로 540 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 이 흡광도는 MTT가 세포에 의해 formazan으로 분해된 양을 나타내며, 따라서 각 well에 살아있는 세포(viable cell)의 수와 비례한다.
- 적정수의 세포를 180 ㎕의 배지에 부유시켜 96-well plate의 12개 컬럼 중 10개의 컬럼에 접종하였다. 시료는 100% DMSO(dimethyl sulfoxide)의 배지 내 최종농도가 0.02% 되도록 하였다. 20 ㎕씩 각 well에 후)정상세포주인">정상 세포주인 Vero E6 세포에 대한 세포 독성 실험도 상기와 같이 MTT법으로 검색하였으나, 시료의 농도를 3,000 ㎕/ ㎖부터 2배수 희석하여 사용하였다. 시험군에서 8개 well의 OD540 값으로부터 한 컬럼의 평균 OD540 값을 구하여 대조군(100% 생존군)의 평균 OD540 값에 대한 백분율을 산출하였다. 7에 이를 수 있는 세포수로 정하였다. 적정수의 세포를 180 ㎕의 배지에 부유시켜 96-well plate의 12개 컬럼 중 10개의 컬럼에 접종하였다. 시료는 100% DMSO(dimethyl sulfoxide)의 배지 내 후)㎕/㎖가되도록">㎕/㎖가 되도록 하였다. 한 가지 농도군에 대해서는 1컬럼(8 wells)을 동일한 조건으로 사용하며, 나머지 한 컬럼에는 약물 대신 PBS(0.2% DMSO) 만을 20 ㎕ 첨가하여 100% 생존군(control survival)으로 삼았다. 흡광도 측정 시 사용할 blank에는 세포 없는 항종양성 실험에 사용한 암세포주의 적정세포수는 약물처리하지 않은 대조군에서 세포 접종 당시로부터 4일 후 MTT 실험 종료 시에 모두 세포가 지수 함수적으로 활발히 증식하면서 MTT 처리 후의 OD540 값이 0.6～0.7에 이를 수 있는 세포수로 정하였다. 적정수의 세포를 180 ㎕의 배지에 부유시켜 96-well plate의 12개 컬럼 중 10개의 컬럼에 접종하였다.
- 2% DMSO) 만을 20 ㎕ 첨가하여 100% 생존군(control survival)으로 삼았다. 흡광도 측정 시 사용할 blank에는 세포 없는 배지만을 180 ㎕ 가하고 PBS 또는 약물을 20 ㎕ 첨가하였다. 암세포와 약물이 접종된 plate를 37℃, 5% CO2 하에서 4일간 배양한 후 0.
대상 데이터
-
후)정상세포주로는">정상 세포주로는 Vero E6(Africa green monkey kidney cell)를 사용하였고, 종양 세포주로는 간암 세포주인 A549, 방광암 세포주인 J82, 대장암 세포주인 SNU-C4, 위암 세포주인 SNU-1, 유방암 세포주인 ZR75-1을 사용하였다.
이론/모형
- 후)정상세포주와">정상 세포주와
- 키토산 가수분해물은 전보의 방법(Park HK 1999)에 따라서 키토산에 Trichoderma viride 유래의 셀룰레이스(cellulase) 를 처리하여 제조하였다.
- 키토산 가수분해물의 세포 독성과 항종양성은 전보의 방법(Park HK 2009)에 따라서 측정하였다.
성능/효과
- 후)세포독성은">세포 독성은 거의 없었다. 따라서 키토산 가수분 해물은 항균성, 면역부활기능, 항종양성 등 다양한 생리활성 기능을 활용한 기능성 식품 첨가물로 이용함에 있어서 안전성이 높은 물질이라고 판단된다.
- 후)항종 양성을">항종양성을 비교하였을 때 활성이 잘 일치하지 않는다. 또한 전보의 결과와 비교할 때 종양세포주에 따라서 다소의 차이가 있지만 폐암 세포주, 방광암 세포주, 유방암 세포주에 대한 항종양성은 저분자량 키토산 올리고당의 경우보다 본 실험에 사용된 키토산 가수분해물이 더 높은 것을 확인할 수 있었는데, 이는 6량체 이상의 고분자량 키토산 올리고당이 항종양성에 관여할 것으로 추정된다. 그러나 어떤 크기의 키토산 올리고당이 항종양성에 관여하는지 어떠한 기작으로 항종양성을 나타내는지를 밝히기 위한 추가적인 연구가 계속되어야 할 것으로 생각된다.
- 생산된 키토산 가수분해물을 전보의 방법(Park HK 1999) 에 따라서 HPLC 분석한 결과, 2량체(dimer)가 14.24%, 3량체(trimer)가 13.55%, 4량체(tetramer)가 6.59%, 5량체(pentamer)가 7.27%, 6량체(hexamer)가 9.04%, 7량체(heptamer)가 16.39%, 8량체(octamer) 이상이 32.93%로 6량체 이상이 전체 올리고당중 58.36%에 달하는 비교적 중합도가 높은 화합물로 구성된 키토산 올리고당이었다.
후속연구
- 후)항종 양성은">항종양성은 저분자량 키토산 올리고당의 경우보다 본 실험에 사용된 키토산 가수분해물이 더 높은 것을 확인할 수 있었는데, 이는 6량체 이상의 고분자량 키토산 올리고당이 항종양성에 관여할 것으로 추정된다. 그러나 어떤 크기의 키토산 올리고당이 항종양성에 관여하는지 어떠한 기작으로 항종양성을 나타내는지를 밝히기 위한 추가적인 연구가 계속되어야 할 것으로 생각된다.
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때 본 실험에 사용된 키토산 가수분해물은 독성이 없는 안전한 물질로 생각되며 in vitro 항종양성을 가지고 있을 뿐만 아니라 세포의 면역기능을 활성화시키는 등의 우수한 생리적 기능을 갖는 새로운 개념의 기능성 식품 소재로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
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