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문제 정의
- white sim., Crystal, 은별, 금별 등 10품종이 DFR 유전자가 blocking 된 것으로 추정되나 또 다른 유전자가 이중으로 변이가 일어났을 가능성을 배제하지 못해 DFR 이외의 유전자로 Northern 분석을 하여 정확한 결과를 도출하고자 하였다. 이러한 DFR 유전자에 대한 Northern blot 분석은 청색의 색소발현을 유도하는 전략에 있어 매우 중요한 기초연구이므로 정확한 연구결과는 매우 중요하다.
- 본 실험에서는 궁극적으로 DFR유전자가 blocking된 계 통을 선발하고 이러한 카네이션계통에 F3',5'H유전자를 도입하여 청색 발현을 유도하는 기질인 delphinidin 의 함 량을 증가시키는 것이 목적이므로 DFR 돌연변이체의 분 리는 가장 중요한 단계이다. 이를 위해 분리한 카네이션 DFR 유전자를 probe로 사용하여 원예연구소에서 수집한 33품종 및 계통에 대한 Northern blot 분석을 수행하였다.
- 이러한 대사공학을 이용하여 색소의 발현을 강화시키거나 새로운 색소발현을 유도하여 원예적인 가치를 높이는 시도는 매우 의미 있는 일이라 사료된다. 본 실험에서는 카네이션에 있어서 상품성이 높은 청색의 발현을 유도하기 위하여 delphinidin 의 발현을 유도하고 보라색 색소 발현의 원인이되는 cyanidin 의 발현을 억제하여 기존의 보라색이 아닌청색의 색소발현을 위한 기초연구로써 Northern blot 분석과 효소의 활성 분석을 통하여 플라보노이드 생합성 관련 유전자가 blocking 된 돌연변이체를 구명하였기에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 색소유전자의 전이를 통하여 새로운 색소발현체계를 가진 품종을 육종하기 위한 기초연구로 카네이션 (Dianthus caryophyllus)외 꽃봉오리로부터 cDNA-library 를 합성하였고 페튜니아의 CHS, FHT, DFR, ANS 유전자를 probe 로 사용하여 anthocyanin 합성경로의 중요 유전자들인 카네이션의 CHS, FHT, DFR, 그리고 ANS 유전자를 분리하였다. 수집한 카네이션 품종 및 계통으로부터 돌연변이체를 선발하기 위해 분리한 유전자들를 probe 로사용하여 Northern blot 분석을 수행하여 DFR 돌연변이체로는 금별, 은별, Ballatyne, Crystal, Eugenia, Koreno, Imp.
제안 방법
- 0g 의 꽃잎을 취하여 buffer 와 함께 저온에서 분쇄하고 원심분리를 한 후 상층액을 다시 Sephadex G50 columns 을통해 정제하여 DFR 활성 실험을 수행하였다.DFR 활성은 NADPH 를 cofactor 로 사용하여 (14C)dihyd- rokaempfer이이 (14C)leucopelargonidin 으로 전이되는 양을 TLC 위에서 측정하였다. Fig.
- Northern blot 분석을 통하여 DFR돌연변이체로 판명된카네이션 품종 은별, Crystal, West crystal, White charlotte, Virginie 가 DFR 유전자가 blocking 된 돌연변이임을 증명하기 위하여 DFR 유전자의 효소활성을 측정하였다. 각각의품종으로부터 1.
- Northern 분석을 위한 probe 로 이미 본 실험에서 분리하여 염기서열분석을 마친 카네이션의 CHS, FHT, DFR 및 ANS 를사용하여 수행하였고 명확한 실험결과를 위하여 반복실험을 통하여 확인하였다. Northern blot 분석을 통하여 우선적으로 DFR 유전자가 blocking 된 돌연변이체를 선발하였고, 선발된 DFR 유전자를 중심으로 다른 유전자의 돌연변이 여부를 조사하여 형질전환을 위한 목적식물을 결정하였다. 표 2에서 보는 바와 같이 DFR 돌연변이체로는 금별, 은별, Ballatyne, Crystal, Eugenia, Koreno, Imp.
- Northern 분석을 위한 probe 로 이미 본 실험에서 분리하여 염기서열분석을 마친 카네이션의 CHS, FHT, DFR 및 ANS 를사용하여 수행하였고 명확한 실험결과를 위하여 반복실험을 통하여 확인하였다. Northern blot 분석을 통하여 우선적으로 DFR 유전자가 blocking 된 돌연변이체를 선발하였고, 선발된 DFR 유전자를 중심으로 다른 유전자의 돌연변이 여부를 조사하여 형질전환을 위한 목적식물을 결정하였다.
- 분리된 mRNA 의 순도를 측정하기 위하여 UV- spectrophotometer 를 통하여 확인하였다. cDNA-library 를 합성하기 위하여 Pharmacia (미국) 회사 제품인 cDNA-library 합성 kit 를 사용하여 cDNA 를 합성하고 이 ds-cDNA는 Lambda-ZAP II vector 에 삽입시킨 후 재조합시켰으며 재조합된 lambda-zap Ⅱ는 곧 바로 in vitro packaging (Stratagene) 과 amplification 을 통하여 cDNA-library 를 완성하였다. 카네이션의 플라보노이드 생합성 관련 유전자의 분리를 위하여 페튜니아의 유전자를 probe 로 사용하였으며 분리할유전자를 가장 효과적으로 분리하기 위해 labelling 효과가 높은 rediprime labelling kit (Amersham)를 사용하였고 hybridization 은 일반적인 방법에 의하여 수행하였다.
- 각각의품종으로부터 1.0g 의 꽃잎을 취하여 buffer 와 함께 저온에서 분쇄하고 원심분리를 한 후 상층액을 다시 Sephadex G50 columns 을통해 정제하여 DFR 활성 실험을 수행하였다.DFR 활성은 NADPH 를 cofactor 로 사용하여 (14C)dihyd- rokaempfer이이 (14C)leucopelargonidin 으로 전이되는 양을 TLC 위에서 측정하였다.
- 및 계통의 꽃잎을 수집하였다 (표 1). 꽃잎은 완전 개화된 것은 제외하고 작은 봉오리부터 개화되기 직전의 꽃잎만 수집하였고 암술과 수술을 제거한 후 액체질소에 급속 냉동한 후 -70℃ 에 보관하고 필요에 따라 유전자 분석에 사용하였다. 수집을 위한 기준은 주 목적이 DFR 돌연변이체를 선발하는 것이므로 대부분 백색의 품종 및 계통을 수집하였고 대조구로 적색을 수집하였다.
- 2% SDS) 로 씻어준 후 분리하였다. 분리된 mRNA 의 순도를 측정하기 위하여 UV- spectrophotometer 를 통하여 확인하였다. cDNA-library 를 합성하기 위하여 Pharmacia (미국) 회사 제품인 cDNA-library 합성 kit 를 사용하여 cDNA 를 합성하고 이 ds-cDNA는 Lambda-ZAP II vector 에 삽입시킨 후 재조합시켰으며 재조합된 lambda-zap Ⅱ는 곧 바로 in vitro packaging (Stratagene) 과 amplification 을 통하여 cDNA-library 를 완성하였다.
- , 2001). 분리한 카네이션의 ANS 유전자를 probe 로 사용하여 수집한 33품종 및 계통에 대한 Northern blot 분석을 수행하였다. 적색의 색소 발현을 보이는 카네이션인 Malaga와 Daringe 역시 강한 ANS 활성을 나타내고 있고 그 밖에 품종 및 계통은 다양한 발현 양상을 보였다 (Fig.
- 이 유전자는 3분자의 malonyl-CoA와 cou- maroyl-CoA 의 탈수축합반응에 의해 기본적인 구조를 갖추는데 관여하는 유전자이기 때문에 flavonoids 생합성에 있어서 가장 중요한 유전자중의 하나로 여겨지고 있다. 분리한 카네이션의 CHS 유전자를 probe 로 사용하여 국립원예특작과학원에서 수집한 품종 및 계통에 대한 Northern blot 분석을 수행하였다. 일반적으로 CHS유전자는 매우 안정적이기 때문에 염기서열의 비교에 있어서도 일치성이 높으며 변이가 잘 일어나지 않는 것으로 알려져 있다.
- 꽃잎은 완전 개화된 것은 제외하고 작은 봉오리부터 개화되기 직전의 꽃잎만 수집하였고 암술과 수술을 제거한 후 액체질소에 급속 냉동한 후 -70℃ 에 보관하고 필요에 따라 유전자 분석에 사용하였다. 수집을 위한 기준은 주 목적이 DFR 돌연변이체를 선발하는 것이므로 대부분 백색의 품종 및 계통을 수집하였고 대조구로 적색을 수집하였다. DFR 유전자가 blocking 된 경우 화색의 발현은 백색을 나타내며 CHI 유전자가 불안전할 경우 황색이 약하게 발현될 경우도 있다.
- , 2003). 수집한 33품종 및 계통에 대한 FHT유전자가 blocking 된 변이체를 분리하기 위해 이미 분리한 카네이션의 FHT 유전자를 probe 로 사용하여 Northern blot 분석을 수행하였다. 적색의 색소 발현을 나타내는 Malaga 와 Daring 은 예상한 바와 같이 FHT 활성을 나타내고 있고, 그 외 대부분의 카네이션 품종과 계통도 FHT 활성에 있어서는 문제가 없는 것으로 나타났다.
- 수집한 33품종 및 계통의 카네이션을 중심으로 그들의 색소발현체계를 Northern blot 분석을 통하여 검정하고 그 결과를 토대로 DFR 유전자가 blocking 된 돌연변이 계통을 선발하여 형질전환을 위한 목적식물로 사용하였다. Northern 분석을 위한 probe 로 이미 본 실험에서 분리하여 염기서열분석을 마친 카네이션의 CHS, FHT, DFR 및 ANS 를사용하여 수행하였고 명확한 실험결과를 위하여 반복실험을 통하여 확인하였다.
- 등 이다. 이 혼합물을 25℃ 에서 30 분간 항온기에서 각각의 반응을 유도한 후 즉시 2번 (50 and 30 yl) 반복하여 ethyl acetate 로 추출한 후 추출액은 Thin layer chromatography (TLC) 를 통하여 분석하였고 여기에 사용된 solvent system 은 chloroform/acetic acid/water (10:9:1)로 혼합하였다. TLC 위의 방사선의 정량분석은 TLC analyzer (Berthold, Germany) 을 사용하여 수행하였다.
- 카네이션의 플라보노이드 생합성 관련 유전자의 분리를 위하여 페튜니아의 유전자를 probe 로 사용하였으며 분리할유전자를 가장 효과적으로 분리하기 위해 labelling 효과가 높은 rediprime labelling kit (Amersham)를 사용하였고 hybridization 은 일반적인 방법에 의하여 수행하였다. 이러한 방법을 통하여 CHS, CHI, FHT, DFR, 그리고 ANS 유전자를 분리하였다.
- 본 실험에서는 궁극적으로 DFR유전자가 blocking된 계 통을 선발하고 이러한 카네이션계통에 F3',5'H유전자를 도입하여 청색 발현을 유도하는 기질인 delphinidin 의 함 량을 증가시키는 것이 목적이므로 DFR 돌연변이체의 분 리는 가장 중요한 단계이다. 이를 위해 분리한 카네이션 DFR 유전자를 probe로 사용하여 원예연구소에서 수집한 33품종 및 계통에 대한 Northern blot 분석을 수행하였다. Northern blot 분석 결과 wildtype의 카네이션인 Malaga와 Daringe 강한 DFR 활성을 나타내고 있고 적색 발현을 나타내는 Desio의 경우 발현이 나타나지 않았는데 이는 아마 재료의 수집에 오류가 있는 것으로 사려된다.
- cDNA-library 를 합성하기 위하여 Pharmacia (미국) 회사 제품인 cDNA-library 합성 kit 를 사용하여 cDNA 를 합성하고 이 ds-cDNA는 Lambda-ZAP II vector 에 삽입시킨 후 재조합시켰으며 재조합된 lambda-zap Ⅱ는 곧 바로 in vitro packaging (Stratagene) 과 amplification 을 통하여 cDNA-library 를 완성하였다. 카네이션의 플라보노이드 생합성 관련 유전자의 분리를 위하여 페튜니아의 유전자를 probe 로 사용하였으며 분리할유전자를 가장 효과적으로 분리하기 위해 labelling 효과가 높은 rediprime labelling kit (Amersham)를 사용하였고 hybridization 은 일반적인 방법에 의하여 수행하였다. 이러한 방법을 통하여 CHS, CHI, FHT, DFR, 그리고 ANS 유전자를 분리하였다.
- 이 중 5 yg 의 mRNA 를 cDNA-library 의 합성에 사용하였다. 합성된 cDNA-library로부터 페튜니아의 CHS, FHT, DFR 그리고 ANS cDNA를 probe로 하여 screening 해 본결과 각각 positive clone들을 분리하였고 이것으로부터 phage-DNA 를 분리하여 EcoRI 으로 처리하고 그 중 1.0 kb- 1.5 kb 크기의 insert만 분리하였다. 이 clone 들을 벡터 pUC19 에 cloning 하여 염기서열분석을 수행한 결과 모두 full size clone임을 확인하였다.
대상 데이터
- 강한 적색 발현을 나타내는 품종인 Desio 의 꽃봉오리 10 g 으로부터 guanidine hydrochloride 방법을 변형하여 total RNA 를 분리한 후 이 total RNA 로부터 mRNA 를 분리하기위하여 oligo-dt-cellulose (Sigma) 를 사용하였고 bufferA (10 mM Tris-HCl pH7.4, 0.4M NaCl, 0.2% SDS)와 bufferB (10 mM Tris-HCl pH7.4, 0.1M NaCl, 0.2% SDS) 로 씻어준 후 분리하였다. 분리된 mRNA 의 순도를 측정하기 위하여 UV- spectrophotometer 를 통하여 확인하였다.
- white sim. 및 W-alpine 은 DFR 과 ANS 의 이중돌연변이체로 밝혀졌고 Koreno 는 DFR 과 CHS 의 이중돌연변이로 사려되며, 금별, Ballatyne 은 DFR, CHI 의 이 중 돌연변이체로 판명되어 목적 식물에서 제외되고 최종적으로 은별, Crystal, West crystal, White charotte 그리고 이미 유전적으로 DFR 돌연변이체로 선발된 Verginie 를 포함하여 총 5계통의 카네이션이 목적 식물로 선발되었다. 선발된 DFR 돌연변이체의 확인을 위하여 유전자의 효소활성을 측정해 본 결과 5품종의 카네이션 모두 DFR 활성을 가지고 있지 않음을 확인하였다.
- white sim. 및 White alpine 은 DFR과 ANS의 이중돌연변이체로 밝혀졌고 Koreno는 DFR과 CHS의 이중돌연변이로 사려되며, 금별, Ballatyne 은 chalcone 의 축적으로 인하여 황색의 색소 발현을 보이므로 DFR, CHI 의 이 중 돌연변이체로 판명되어 목적식물에서 제외되고 최종적으로 은별, Crystal, West crystal, White charotte 그리고 이미 유전적으로 DFR 돌연변이체로 선발된 Virginie 를 포함하여 총 5품종의 카네이션이 목적식물로 선발되었다 (Lee et al., 2006).
- 본 연구는 농촌진흥청 바이오그린 21 사업단의 지원을받아 수행하였다.
- DFR 유전자가 blocking 된 경우 화색의 발현은 백색을 나타내며 CHI 유전자가 불안전할 경우 황색이 약하게 발현될 경우도 있다. 유전자원의 수집은 국립원예특작과학원의 온실에서 선발 수집하였다.
- 유전자원의 유전자분석을 위하여 33종의 카네이션 품종 및 계통의 꽃잎을 수집하였다 (표 1). 꽃잎은 완전 개화된 것은 제외하고 작은 봉오리부터 개화되기 직전의 꽃잎만 수집하였고 암술과 수술을 제거한 후 액체질소에 급속 냉동한 후 -70℃ 에 보관하고 필요에 따라 유전자 분석에 사용하였다.
- 821 mg 을 얻었고 1차 oligo- dt-cellulose column 을 통하여 52 yg 의 mRNA 를 얻었으며 2 차 column 을 통과한 후 18 yg 의 순수한 mRNA 를 분리하였다. 이 중 5 yg 의 mRNA 를 cDNA-library 의 합성에 사용하였다. 합성된 cDNA-library로부터 페튜니아의 CHS, FHT, DFR 그리고 ANS cDNA를 probe로 하여 screening 해 본결과 각각 positive clone들을 분리하였고 이것으로부터 phage-DNA 를 분리하여 EcoRI 으로 처리하고 그 중 1.
이론/모형
- DFR 효소활성 측정은 Heller (1985) 등의 방법에 의하여 수행하였다. 기본적인 효소활성의 측정을 위해서 전체 용량을 50 ㎕로 하였으며 자세한 조성은 5-50 y! 의 효소추출액, 0.
- Northern blot분석을 위해서는 서로 다른 야생주와 돌연 변이식물체의 어린 꽃봉오리로부터 total RNA의 추출은 Logemann 등 (1987)의 방법에 따라 하였으며 전기영동은 1.2% formaldehyde agarose gel 상에서 수행하였고, Sambrook 등 (1989)의 방법에 준하여 DFR cDNA 의 1.5 kb 절편을 32P 로 labeling하여 probe로 사용하였다. Hybridizatione 50% formamide, 5 X SSC, 0.
- 이 혼합물을 25℃ 에서 30 분간 항온기에서 각각의 반응을 유도한 후 즉시 2번 (50 and 30 yl) 반복하여 ethyl acetate 로 추출한 후 추출액은 Thin layer chromatography (TLC) 를 통하여 분석하였고 여기에 사용된 solvent system 은 chloroform/acetic acid/water (10:9:1)로 혼합하였다. TLC 위의 방사선의 정량분석은 TLC analyzer (Berthold, Germany) 을 사용하여 수행하였다.
성능/효과
- DFR 활성은 NADPH 를 cofactor 로 사용하여 (14C)dihyd- rokaempfer이이 (14C)leucopelargonidin 으로 전이되는 양을 TLC 위에서 측정하였다. Fig. 5의 결과에서 보는 바와 같이 positive contr이로 사용한 적색발현의 Malaga의 경우 leucopelargonidin (Lpg) peak 을 나타냄으로서 기대했던 DFR 효소 활성을 보였고 (Fig. 5a), negative control 로 reticulocyte lysate만 넣어준 경우는 전혀 효소 활성을 보이지않았다 (Fig. 5b). 반면에 DFR 돌연변이체로 선발된 은별, Crystal, West crystal, 그리고White charlotte의 꽃으로부터분리한효소를 사용한 활성 측정의 결과는 negative control 과 같이 DFR 활성을 나타내지 않았다 (Fig.
- , 1987). 대조구로 사용된 적색 발현 카네이션인 Malaga 와 Daring 은 CHS 활성을 나타내고 있고 그 밖에 품종 및 계통도 대부분 발현 양상을 보였다 (Fig. 3). Korena, Creame intermezzo 등이 CHS 유전자가 blocking 된 것으로 추정되나 또 다른 유전자가 이중으로 mutation 이 일어났을 가능성을 배제하지 못해 CHS이외의 유전자로 Northern 분석을 할 필요가 있다.
- 및 W-alpine 은 DFR 과 ANS 의 이중돌연변이체로 밝혀졌고 Koreno 는 DFR 과 CHS 의 이중돌연변이로 사려되며, 금별, Ballatyne 은 DFR, CHI 의 이 중 돌연변이체로 판명되어 목적 식물에서 제외되고 최종적으로 은별, Crystal, West crystal, White charotte 그리고 이미 유전적으로 DFR 돌연변이체로 선발된 Verginie 를 포함하여 총 5계통의 카네이션이 목적 식물로 선발되었다. 선발된 DFR 돌연변이체의 확인을 위하여 유전자의 효소활성을 측정해 본 결과 5품종의 카네이션 모두 DFR 활성을 가지고 있지 않음을 확인하였다.
- 5 kb 크기의 insert만 분리하였다. 이 clone 들을 벡터 pUC19 에 cloning 하여 염기서열분석을 수행한 결과 모두 full size clone임을 확인하였다.
- 5e, 5f). 이러한 결과를 종합하면 Northern blot 분석을 통하여 규명된 DFR 돌연변이체들은 이미 DFR 돌연변이체로 규명된 Virginie 와 같이 DFR 유전자가 blocking 된 돌연변이체 임을확인할 수 있었다 (Lee et al. 2006). 이러한 돌연변이체에향 후 페튜니아의 DFR 유전자와 F3’, 5’H유전자를 형질전환을 통하여 delphinidin 의 함량을 증가시켜 기존의 보라색이 아닌 경제성이 있는 청색발현을 하는 새로운 카네이션 품종의 개발을 기대하고 있다.
- 수집한 33품종 및 계통에 대한 FHT유전자가 blocking 된 변이체를 분리하기 위해 이미 분리한 카네이션의 FHT 유전자를 probe 로 사용하여 Northern blot 분석을 수행하였다. 적색의 색소 발현을 나타내는 Malaga 와 Daring 은 예상한 바와 같이 FHT 활성을 나타내고 있고, 그 외 대부분의 카네이션 품종과 계통도 FHT 활성에 있어서는 문제가 없는 것으로 나타났다. 다만 백색의 화색발현을 보이는 Eugenia의 경우 FHT 유전자가 blocking된변이체로 나타났다 (Fig.
후속연구
- 2006). 이러한 돌연변이체에향 후 페튜니아의 DFR 유전자와 F3’, 5’H유전자를 형질전환을 통하여 delphinidin 의 함량을 증가시켜 기존의 보라색이 아닌 경제성이 있는 청색발현을 하는 새로운 카네이션 품종의 개발을 기대하고 있다.
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