초록 ▼

1. 색소유전자의 분리 및 분석
1) 도라지 꽃으로부터 mRNA 분리 및 cDNA Library 제작
도라지(P. grandiflorum(Jacq.) A.Dc)의 꽃잎으로부터 guanidium chloride 방법을 통해 total RNA를 분리하였으며 oligo dt-cellulose coloum을 사용하여 mRNA를 분리하였다. 순수 mRNA를 사용하여 cDNA library (Lambda gt10)를 제작하였다
2) Flavonoid 3', 5'-hydroxylase (F3'5'H) 유전자의 클로닝
도

1. 색소유전자의 분리 및 분석
1) 도라지 꽃으로부터 mRNA 분리 및 cDNA Library 제작
도라지(P. grandiflorum(Jacq.) A.Dc)의 꽃잎으로부터 guanidium chloride 방법을 통해 total RNA를 분리하였으며 oligo dt-cellulose coloum을 사용하여 mRNA를 분리하였다. 순수 mRNA를 사용하여 cDNA library (Lambda gt10)를 제작하였다
2) Flavonoid 3', 5'-hydroxylase (F3'5'H) 유전자의 클로닝
도라지 꽃이 유래, cDNA library로부터 페류니아의 flavonoid 3',5'-hydroxylase 유전자를 probe로 이용하여 도라지의 flavonoid 3',5'-hydroxylase 유전자를 클로닝하였다.
3) 장미 cDNA library로부터 chalcone synthase (CHS) 유전자 분리 및 염기 서열분석
장미의 야생품종의 하나인 Insel Maninau의 꽃잎으로부터 mRNA를 분리하고 cDNA library를 제작 장미의 CHS 유전자를 분리하였다. 페튜니아의 chalcone synthase유전자를 probe로 사용하여 장미의 chalone synthase 유전자를 분리하였고 분리된 1.6kb크기의 유전자를 vector pUC19의 EcoRI site에 cloning하여 염기서열분석을 수행하였다
4) 장미 cDNA library로부터 dihydroflavonol-4-reductase (DFR) 유전자 분리 및 염기서열분석
장미의 cDNA library로부터 페튜니아의 DFR 유전자를 prove로 사용하여 장미의 DFR 유전자를 분리하였다. 분리된 1.2kb 크기의 유전자를 vector pUC19의 EcoRI site에 cloning하여 염기서열분석을 수행하였다.
2. 장미 형질전환용 벡터제작
1) 페튜니아의 F3'5'H 유전자 벡터 제작
페튜니아의 F3'5'H 유전자(약 1.8kb)를 Eco RI 및 Apa I으로 double digestion pBluescript SK에 클로닝하였으며, 또한 페튜니아의 1.8kb의 F3'5'H 유전자에 T4 DNA polymerase를 처리한 후 blunt end를 만든 다음 Eco RI adaptor를 연결하여 Agrobacterium의 binary vector인 pGA748의 EcoRI site에 sense 방향으로 cloning하여 벡터 제작을 하였다.
2) 장미 DFR 유전자의 anti-sense 벡터 제작
장미의 DFR(약 1.2kb) 유전자의 발현 억제를 통한 화색 변화를 시도하기 위하여 분리된 장미 DFR 유전자를 Agrobacterium의 binary vector인 pGA748의 EcoRI site에 antisense방향으로 cloning하여 형질전환용 벡터를 제작하였다.
3) 장미 CHS 유전자의 sense 및 antisense 벡터 제작
장미의 CHS 유전자(약 1.6kb)의 발현 억제를 통한 화색 변화를 시도하기 위하여 분리된 장미 CHS 유전자를 Agrobacterium의 binary vector인 pGA748의 EcoRI site에 각각 sense 및 antisense방향으로 cloning하여 형질전환용 벡터를 제작하였다.
3. 체세포배발생을 통한 장미의 기내재분화 시스템 확립
1) 장미의 미성숙배로부터 체세포발생
장미(R.hybrida L.)의 미성숙배로부터 체세포배발생을 통한 식물체 재생시스템을 확립하기 위하여 미성숙배 배양에 요구되는 생장조절제 (BA와 2,4-D)의 종류 및 농도를 조사하였으며 GA₃와 myo-inositol이 체세포배발생에 미치는 영향을 조사하였다.
2) 배발생 현탁배양 세포로부터 식물체재생
장미(R.hybrida L.)의 미성숙배로부터 유도된 배발생캘러스로부터 현탁배양을 통한 배발생캘러스의 대량증식 및 식물체재분화 시스템을 확립하기위한 배양조건을 규명하였다. 또한 proline이 배발생 현탁배양에 미치는 양향을 조사하였다.
3) 장미 배발생캘러스 원래 원형질체 배양을 통한 식물체 재생
장미(R.hybrida L.) 배발생세포주로부터 식물체의 대량증식을 위해 원형질체의 분리 및 배양체계를 확립하였다. 장미 원형질체 배양에 요구되는 배양밀고, 배양방법 및 배양배지 조건을 규명하였다.
4) 상업용 스프레이장미 챠밍과 퍼플프린스의 식물체 재분화 시스템 확립
개발된 장미의 미성숙배 배양을 통한 식물체 재생체계가 다른 상업용 장미에도 효과적으로 적용될 수 있는지를 조사하기 위해 아직까지 식물체 재생이 보고된 바 없는 두 종류의 상업용 장미품종(챠밍과 퍼플프린스)의 미성숙배로부터 체세포발생을 통한 식물체 재생시스템을 확립하였다.
5) 기내 재생 장미의 발근 조건 규명
체세포배로부터 발달한 장미 유식물체의 순화 및 포장시험을 위해 기내재생 장미의 발근 및 순화에 요구되는 배양배지 및 생장조절체의 영향을 조사하였다.
4. 장미의 형질전환
장미의 형질전화 효율을 증가시키기 위하여 Agrobacterium 과 공동배양시 형질전환에 관여하는 여러 요인 즉 공동배양 시간, Agrobacterium의 배양 온도, phenolic compound 의 첨가, 공동배양배지의 pH, betaine phosphate의 첨가 등 여러 요인을 제시하여 장미의 형질전환을 수행하였다.
1) Agrobacterium-mediated transformation
① A. tumefaciens공동 배양을 통한 transformation
장미의 배발생캘러스로부터 형성된 다수의 체세포배를 수거하여 장미의 chalchone synthase (CHS), antisense-chalchone synthase (ACHS), antisense-dihydroflavonol-4-reductase (ADFR), 페튜니아의 flavonoid 3',5'-hydroxylas(F3'5'H) 유전자가 각각 도입된 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 배양액을 50배로 희석하여 접종하였다. 균접종 후 28℃향온기에서 2일간 공동배양한 다음 배양배지로 세척하여 균을 제거하고 여과지로 수분을 제거하였다. 체세포배를 50 mg/L carbenicilline과 100 mg/L kanamycin 이 첨가된 첨가된 배양배지로 옮겨 25℃ 향온기에서 암배양하였다. 약 2주 간격으로 동일배지에 계대배양하면서 균을 제거하였으며 kanamycin 저항성 세포주를 선발하였다.
② A. tumefaciens공동 배양을 통한 GFP 유전자 도입
Green fluorescent protein 유전자를 Agrobacterium binary vector인 pGA748과 pBinl9에 2 mL을 첨가하여 실온에서 1시간 공동배양하였다. 공동배양 후 여과지로 균을 제거하고 500 ㎎/L carbenicilline 100 ㎎/L kanamycin 이 첨과된 선발배지에 여과지를 깐 뒤, 여과지위에서 평판배양하였다. 평판배양 후 5-6주후 형성된 colony를 선발하여 선발배지 (1/2 MS salts, 1 ㎎/L BA, 100 ㎎/L kanamycin) 로 옮겨 25℃ 항온기에서 암배양하였다. Shoots의 경우 길이가 약 10-15mm 정도의 shoot를 수거하여 forccep 및 주사기 바늘로 상처를 준 다음 현탁배양세포와 동일한 방법으로 Agrobacterium 공동배양을 수행하였다.
③ 형질전환 확인
형질전화 여부는 일차적으로 PCR을 통해 수행하였다. kanamycin 저항성 세포주로 부터 발달한 체세포배는 식물체로 발달하였으며 CTAB 방법에 따라 식물체로부터 DNA를 추출하였다. 이중 약 100 ng 을 PCR 증폭에 사용하였다. PCR 증폭에 이용된 NPT-II 유전자의 primer는 아래와 같은며 이 primer로 NPT-II 유전자의 도입 여부를 확인하였다. PCR 증폭조건은 93℃에서 1분간 DNA를 변성시키고, 55℃에서 1분간 primer annealing, 72℃에서 2분간 primer extention하여 31회 반복하였으며, PCR 증폭산물은 1% agarosegel 전기영동 후 UV하에서 관찰하였다.
2) Biolistic transformation
① DNA coating과 bombadment
F3'5'H와 GFP 유전자의 농도를 각각 1㎍/㎕로 조정하여 PDS-1000/He device particle bombadment(Bio-Rad Laboratories Ltd., Hemel Hempstead, UK)를 사용하여 실험을 수행하였다. Microprojectile은 텅스텐입자(MIO)를 사용하였으며, 텅스텐입자는 100% 알콜 1mL에 60㎎을 넣어 microprojectile stock으로 저장하였다. microprojectile bombadment를 수행하기 위하여 텅스테은 stock에서 35㎕를 취한 후 1mL 멸균수를 첨가하여 5분간 원심분리하여 멸균수를 제거하였다. 그리고 25㎕(25㎍) DNA와 멸균수, 2.5M CaCl₂, 0.1M spermidine을 첨가하여 DNA로 코팅하였다. 코팅된 DNA입자를 macro carrier disk에 10㎕를 도말, 건조하여 stopping screen과 같이 결합하여 particle bombadment 챔버내에 장착하였다. microprojectile의 목표가 되는 페트리접시는 챔버내의 선반에 놓고 시료와 macrocarrier의 firing distance는 6㎝으로 유지하여 수행하였다. 이때 헬륨가스의 압력은 1100 PSI로, 챔버내의 진공압은 28-29 cmHg로 조절하여 particle bombadment를 작동하여 DNA를 투입시켰다.
② GFP gene 발현의 조사
Bombadment된 절편에서 GFP의 발현조사는 Zeiss사의 axioskop fluorescence microscope를 사용하였으며, filter는 excitation filter 450-490 nm, dichronic mirror 510 nm, band pass filter 515-561 nm를 이용하였다. 그리고 광원(light source)은 HBO 50W high-pressure mercury를 이용하였다.
③ 형절전환체 선발
Bombadment 후 절편은 본 연구에서 확립된 재분화 조건인 1 ㎎/L BA + myo-inositol 0.6% 와 1 ㎎/L BA + 0.3 ㎎/L 2,4-D + myo-inositol 0.6%가 포함된 1/2 MS배지에 배양하였다. 형질전환 여부는 PCR분석을 통해 확인하였다.
5. 형질전환장미의 순화, 포장시험 및 특성분석
1) 형질전환 장미의 순화처리 및 포장시험
형질전환된 장미의 발근 및 순화에 요구되는 배양조건 (무기염류, 철이온 요구도, 생장조절제)을 규명하였다. 발근이 이루어진 소식물체는 부엽토: 질석: 펄라이트가 2:2:1 로 첨가된 배양토로 옮겨 순화시켰다. F3', 5'H 유전자가 도입된 장미 및 스프레이 상업용장미 차밍의 기내 재생된 shoots를 재료로 발근배지, 순화용토 및 순화 (온도, 광, 습도) 조건을 규명하였다.
2) 형질질환 장미의 특성분석
형질질환 장미의 형태적 특징(화형, 꽃잎의 색, 꽃잎 수 등)을 현미경으로 관찰하였으며, 특히 꽃잎 표면의 세포배열은 전자현미경으로 관찰하였다.
3) 화색분석
형질질환에 이용된 장미(적색)와 스프레이 장미(챠밍) 그리고 형질전환된 장미의 꽃잎 1g을 1% HC1-methanol 용액에 4℃에서 24시간 방치한 다음 상충액을 여과하여 흡광도를 분석하였다.

Abstract ▼

1. Cloning and analysis of anthocyanin pigments gene
1) Purification of mRNA from petal of P. grandiflorum and construction of cDNA library
Total RNA was extracted from from petal of P. grandiflorum through guanidium chloride method and mRNA was purified using oligo-dT cellulose column.
2)

1. Cloning and analysis of anthocyanin pigments gene
1) Purification of mRNA from petal of P. grandiflorum and construction of cDNA library
Total RNA was extracted from from petal of P. grandiflorum through guanidium chloride method and mRNA was purified using oligo-dT cellulose column.
2) Cloning of F3'5'H from petal cDNA library of P. grandiflorum
Three F3'5'H clones of P. grandiflorum were isolated from petal cDNA library using full clone of petunia F3'5'H cDNA as a probe.
3) Cloning of CHS from petal cDNA library of R. hybrida
Full clone of rose CHS was isolated and sequenced through cDNA library screening using petunia CHS cDNA as a probe.
4) Cloning of DFR from petal cDNA library of R. hybrida
Partial clone of rose DFR was isolated and sequenced through cDNA library screening using petunia DFR cDNA as a probe.
2. Development of binary vectors
1) Development of binary vectors containing F3'5'H
F3'5'H cDNA of petunia was double digested with Eco RI and Apa I and cloned into pBluescript SK. Isolated F3'5'H cDNA was ligated with EcoRI adaptor. After ligation, F3'5'H cDNA was cloned into Agrobacterium tumefaciens LBA4404 haboring binary vector pGA748. Orientation of inserted gene was conformed by restriction enzyme pattern.
2) Development of binary vectors containing antisense-DFR
CHS cDNA of rose was ligated into EcoRI site of Agrobacterium tumefaciens LBA4404 haboring binary vector pGA748. Orientation of inserted gene was conformed by restriction enzyme pattern.
3) Development of binary vectors containing sense, antisense-CHS
DFR cDNA of rose was ligated into EcoRI site of Agrobacterium tumefaciens LBA4404 haboring binary vector pGA748. Orientation of inserted gene was conformed by restriction enzyme pattern.
3. Establishment of Plant regenertion system
1) Plant regeneration from immature zygotic embryo cultures via somatic embryogenesis
To obtain somatic embryos, immature embryos were placed on half-strength MS medium supplemented with 0.01-5 mg 1-1 2, 4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), or 0.1-5 mg/L 6-benzyladenine (BA). To examine the effect of combination of BA and 2,4-D on embryogenic callus formation, immature embryos were placed on half-strength MS medium supplemented with 1 mg/L BA and various concentrations (0.1-1 mg/L) of 2, 4-D.
2) Plant regeneration from embryogenic cell suspension cultures
To establish plat regeneration system from embryogenic cell suspension cultures of rose, immature embryo-derived callus (approximately 1g) was transferred into liquid culture medium with same composition without gelrite. Also, effect of proline for embryo formation was examined.
3) Plant regeneration from protoplasts derived from embryogenic cell suspension cultures
Protoplasts were enzymatically isolated from two week old embryogenic cell suspension cultures. Freshly isolated protoplast suspension culture were plated on half-strength MS medium containing 0.4 mg/L thiamineHCl, 0.1 mg/L nicotinic acid, 0.5 mg/L pyridoxinHCl, 2 mg/L glycine, 6 g/L myo-inositol, 30 g/L sucrose, 4.4 ㎛ BA, and 1.4 ㎛ 2,4-D (protoplast culture medium). All culture were incubated at 25℃ in the dark.
4) Plant regeneration from immature zygotic embryo cultures of commercial rose cultivars (Charming and Purple prince)
To apply the established plant regeneration system of rose into commercial rose cultivars, immature embryos were placed on half-strength (2,4-D) and 1 ㎎/L 6-benzyladenine (BA).
5) In vitro rooting of regenerated plantlets
To establish acclimatization of regenerated plantlets, culture condition (concentration of inorganic salts, growth regulators) was examined.
4. Genetic transformation of rose
1) Agrobacterium-mediated transformation
To increase the frequency through Agrobacterium-mediated transformation, several factors related to genetic transformation such as cocultivation period, cocultivation temperature, pH of cocultivation medium, effects of acetosyringone and betaine phosphate were examined.
2) Biolistic transformation
The conditions of microprojectile bombardment were as follows: firing distance 6 ㎝: pressure of helium 1100 psi: tungsten particle M10, PDS-1000/He device. Concentration of DNA(F3'5'H and GFP) was adjusted 1 ㎍/㎕. Expression of GFP was observed with axiokop fluorescence microscope. Filter sets was as follow: excitation filter 450-490 nm: dichromic mirror 510 nm: band pass filter 515-561 nm.
5. Acclimatization and field test of transgenic rose
1) Acclimatization
Plantlets of wild type and tansgenic rose (Charming) were grown to maturity in phytotron.
2) Flower morphology and electron microscopy
Flower morphology of wild type and tansgenic rose was examined. And surface of petal was examined by electron microscopy.
3) Pigment analysis
Anthocyanins was extracted with 1% HCl-methanol from petal (1 g) of wild type and tansgenic rose. Maximum absorption pattern of anthocyanin estracts were examined, respectively.

목차 Contents

• 제출문 ...1
• 요약문 ...2
• SUMMARY ...20
• CONTENTS ...34
• 목차 ...37
• 제1장 서론 ...40
• 제1절 연구개발의 필요성 ...40
• 1. 기술적 측면 ...40
• 2. 경제.산업적 측면 ...46
• 3. 사회.문화적 측면 ...50
• 제2절 연구개발의 목적과 범위 ...51
• 1. 연구개발의 목적 ...51
• 2. 연구개발의 범위 ...51
• 제2장 색소유전자의 분리 및 분석 ...53
• 제1절 서설 ...53
• 제2절 도라지 꽃으로부터 mRNA 분리 및 cDNA Library 작성 ...54
• 1. 도라지 꽃으로부터 mRNA 분리 및 cDNA Library 작성 ...54
• 2. Flavonoid 3...57
• 3. 장미 cDNA Library로부터 CHS 유전자 분리 및 분석 ...59
• 4. 장미 cDNA Library로부터 DFR 유전자 분리 및 분석 ...59
• 제3장 장미 형질전환용 벡터제작 ...61
• 제1절 서설 ...61
• 제2절 형질전환용 벡터제작 ...61
• 1. 페튜니아의 flavonoid 3, 5-hydroxylass 유전자 벡터 제작...61
• 2. 장미 DFR(Dihydroflavonol 4-reductase)유전자의 anti-sense 벡터 제작 ...62
• 3. 장미 CHS (Chalchone synthase) 유전자의 sense 및 antisense 벡터제작 ...62
• 4. PEG trnsformation 용 벡터제작 ...62
• 제4장 장미의 식물체 재분화 시스템 확립 ...66
• 제1절 서설 ...66
• 제2절 체세포배발생을 통한 장미 기내재분화 시스템확립 ...67
• 1. 절화장미의 약배양 및 화사배양 ...67
• 2. 장미의 접합자배 배양 ...68
• 3. 미니장미와 장미의 조직배양 ...68
• 4. 장미의 미성숙배 배양을 통한 체세포발생 ...68
• 5. 조직학적 관찰 ...72
• 6. 장미의 배발생 현탁배양 세포로부터 식물체재생 ...74
• 7. GA₃와 Myo-inositol이 장미 미성숙배로부터 체세포배형성에 미치는 영향 ...81
• 8. 장미의 배발생 캘러스로부터 원형질체 분리, 배양 및 식물체 재분화 ...86
• 9. 스프레이강업용 장미 차밍과 퍼플프린스의 식물체 재분화 시스템 확립 ...92
• 10. 기내 재생 장미의 발근 조건 규명 ...95
• 제5장 장미의 형질전환 ...97
• 제1절 서설 ...97
• 제2절 장미의 형질전환 ...97
• 1. Agrobacterium-mediated transformation ...98
• 2. PEG transformation ...104
• 3. Biolistic transformation ...107
• 제3절 형질전환 장미의 순화, 포장시험 및 특성분석 ...119
• 1. 형질전환 장미의 순화처리 및 포장시험 ...119
• 2. 형질전환 장미의 특성분석 ...120
• 3. 화색분석 ...121
• 참고문헌 ...132
• 위탁연구과제 ...144