비타민 C, Silicon, 철분, Proline 및 Lysine의 처리가 피부 섬유아세포의 증식 및 Collagen I과 III의 발현에 미치는 효과 비교 Effect of Ascorbic Acid, Silicon, Fe, Proline and Lysine on Proliferation and Collagen Synthesis in the Human Dermal Fibroblast Cell (HS27)원문보기
본 연구에서는 HS27 피부 섬유아세포에 비타민 C, silicon, 철분, proline 및 lysine을 혈청 및 피부 내 농도 범위로 처리한 후 세포의 증식을 비롯하여 콜라겐 I과 III의 mRNA 및 단백질의 발현을 비교하였다. 비타민 C는 처리 기간 및 농도와 무관하게 세포 증식 및 mRNA 발현에 영향을 미치지 않았으며 콜라겐 type I 및 III의 단백질 발현은 각각 5-50 ${\mu}M$, 10-50 ${\mu}M$ 농도에서 5일 처리 시 683.9%, 182% 이상으로 발현을 증가시켰다. Silicon의 3일 및 5일 농도별 처리는 세포증식과 콜라겐 mRNA 및 단백질 발현을 다소 감소시키거나 영향을 미치지 않았다. 철분의 3일 및 5일 처리는 혈청 내 농도(11-35 ${\mu}M$)에서 콜라겐 mRNA 발현에 영향을 미치지 않았으며 세포 증식 및 콜라겐 단백질 발현을 증가시켰다. 또한 철분의 5-30 ${\mu}M$의 농도 처리는 5일 처리보다 3일 처리 시 발현수준이 훨씬 컸다. 콜라겐의 구성 아미노산인 proline 및 lysine은 섬유아세포의 증식을 증가시켰다. 따라서 단기간의 콜라겐의 합성 증가는 철분의 섭취가 적합하나 장기간의 섭취에는 비타민 C의 섭취와 더불어 철분의 섭취가 필요한 것으로 여겨진다.
본 연구에서는 HS27 피부 섬유아세포에 비타민 C, silicon, 철분, proline 및 lysine을 혈청 및 피부 내 농도 범위로 처리한 후 세포의 증식을 비롯하여 콜라겐 I과 III의 mRNA 및 단백질의 발현을 비교하였다. 비타민 C는 처리 기간 및 농도와 무관하게 세포 증식 및 mRNA 발현에 영향을 미치지 않았으며 콜라겐 type I 및 III의 단백질 발현은 각각 5-50 ${\mu}M$, 10-50 ${\mu}M$ 농도에서 5일 처리 시 683.9%, 182% 이상으로 발현을 증가시켰다. Silicon의 3일 및 5일 농도별 처리는 세포증식과 콜라겐 mRNA 및 단백질 발현을 다소 감소시키거나 영향을 미치지 않았다. 철분의 3일 및 5일 처리는 혈청 내 농도(11-35 ${\mu}M$)에서 콜라겐 mRNA 발현에 영향을 미치지 않았으며 세포 증식 및 콜라겐 단백질 발현을 증가시켰다. 또한 철분의 5-30 ${\mu}M$의 농도 처리는 5일 처리보다 3일 처리 시 발현수준이 훨씬 컸다. 콜라겐의 구성 아미노산인 proline 및 lysine은 섬유아세포의 증식을 증가시켰다. 따라서 단기간의 콜라겐의 합성 증가는 철분의 섭취가 적합하나 장기간의 섭취에는 비타민 C의 섭취와 더불어 철분의 섭취가 필요한 것으로 여겨진다.
In the dermis, fibroblast plays an important role in the turnover of the dermal extracellular matrix. Collagen I and III, which are the most important dermal proteins of the extracellular matrix, function as a stabilizing scaffold of dermal connective tissues, as well as a regulator of differentiati...
In the dermis, fibroblast plays an important role in the turnover of the dermal extracellular matrix. Collagen I and III, which are the most important dermal proteins of the extracellular matrix, function as a stabilizing scaffold of dermal connective tissues, as well as a regulator of differentiation and migration of dermal cells. In this study, we investigated the effect of various nutrients, such as ascorbic acid, silicon, Fe, lysine and proline which function as cofactors or building blocks on collagen synthesis. When the physiological concentrations of ascorbic acid (0-100 ${\mu}M$), silicon (0-50 ${\mu}M$), Fe (0-50 ${\mu}M$), lysine (0-150 ${\mu}M$) and proline (0-300 ${\mu}M$) were treated at HS27 for either 3 or 5 days, 5 day treatment of ascorbic acid at the low concentration (5-10 ${\mu}M$) increased the expression of collagen I and III protein by 115-1300% without increasing cell proliferation. 3 or 5 days treatment of Fe increased the expression of collagen I and III proteins up to 323% in parallel with cell proliferation by 164%. However, cell proliferation and expression of collagen I and III protein in silicon treated HS27 did not differ. Proline and lysine only increased cell proliferation up to 247.9%. Taken together, we demonstrate that the physiological concentrations of ascorbic acid and Fe enhance the expression of collagen I and III protein for treatment of 3 or 5 days.
In the dermis, fibroblast plays an important role in the turnover of the dermal extracellular matrix. Collagen I and III, which are the most important dermal proteins of the extracellular matrix, function as a stabilizing scaffold of dermal connective tissues, as well as a regulator of differentiation and migration of dermal cells. In this study, we investigated the effect of various nutrients, such as ascorbic acid, silicon, Fe, lysine and proline which function as cofactors or building blocks on collagen synthesis. When the physiological concentrations of ascorbic acid (0-100 ${\mu}M$), silicon (0-50 ${\mu}M$), Fe (0-50 ${\mu}M$), lysine (0-150 ${\mu}M$) and proline (0-300 ${\mu}M$) were treated at HS27 for either 3 or 5 days, 5 day treatment of ascorbic acid at the low concentration (5-10 ${\mu}M$) increased the expression of collagen I and III protein by 115-1300% without increasing cell proliferation. 3 or 5 days treatment of Fe increased the expression of collagen I and III proteins up to 323% in parallel with cell proliferation by 164%. However, cell proliferation and expression of collagen I and III protein in silicon treated HS27 did not differ. Proline and lysine only increased cell proliferation up to 247.9%. Taken together, we demonstrate that the physiological concentrations of ascorbic acid and Fe enhance the expression of collagen I and III protein for treatment of 3 or 5 days.
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문제 정의
그러나 비타민 C 를 제외한 영양소들의 중요성 연구는 미비한 수준이다. 따라서 본 연구에서는 HS27 피부 섬유아세포에 콜라겐 합성의 주요 인자인 비타민 C를 비롯하여 철분, silicon, proline 및 lysine을 혈청 및 피부 내 농도 범위로 처리하여 세포의 증식과 콜라겐 type I 과 山의 mRNA 및 단백 질의발현을 비교하고자 한다. 이를 통해 콜라겐 합성에 대한 각 영양소의 상대적인 중요도를 알아보고 산업적으로 이들 영양소를 식품 소재로 사용할 수 있는 계기를 마련하여 산업적 소재로의 활성화를 유도하고자 한다.
따라서 본 연구에서는 HS27 피부 섬유아세포에 콜라겐 합성의 주요 인자인 비타민 C를 비롯하여 철분, silicon, proline 및 lysine을 혈청 및 피부 내 농도 범위로 처리하여 세포의 증식과 콜라겐 type I 과 山의 mRNA 및 단백 질의발현을 비교하고자 한다. 이를 통해 콜라겐 합성에 대한 각 영양소의 상대적인 중요도를 알아보고 산업적으로 이들 영양소를 식품 소재로 사용할 수 있는 계기를 마련하여 산업적 소재로의 활성화를 유도하고자 한다.
가설 설정
2)HS27 cells were plated at 0.2 x 104 cells/well. After 24 hrs, each treatment were added at an indicated concentration.
Whole cell extracts (15 pg protein/lane) were subjected to 10% SDS-PAGE and immunoblotting with collagen type I specific antibodies. B: The signal intensities of A were quantified and the integrated areas were percentaged to the signal observed in control (100%). Values are mean±SD (n=3).
Whole cell extracts (15 pg protein/lane) were subjected to 10% SDS-PAGE and immunoblotting with collagen type 皿 specific antibodies. B: The signal intensities of A were quantified and the integrated areas were percentaged to the signal observed in control cells (100%). Values are mean±SD (n=3).
2 x 10'cells/well의 농도로 분주하고 24시간 후에 비타민 C, 철분, silicon, proline 및 lysine을 농도별로 투여하여 3일 및 5일간 배양하였다. 3일 또는 5일째 되는 날 MTS (40 uL/well) 시약을 첨가하고 2시간 30분 동안 37℃ 에서 배양한 후 MTS 가 formazan 으로 분해되는 양을 ELISA reader(CA, USA)를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
1% Tween-20을 함유한 PBST로 15분씩 3차례 세척하였다. Blocking solution으로 1:5000배로 희석시킨 peroxidase - conjugated anti-IgG 이차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시 킨 후 0.1% Tween-20을 함유한 PBST로 3차례 세척하고 발색은 ECL hyperfilm으로 확인하였다. (20) 각 Band의 intensity는 imaging densitometer (model GS-700, Bio-Rad)를 사용하여 정량하였다.
HS27 피부 섬유아세포는 Polystyrene 세포 배양접시에 부착시키고 10% FBS(Gibco, CA, USA), 1% penicillin- streptomycin을 첨가한 DMEM(Gibco)을 사용하여 5% CO2 와 95% 습도가 유지되는 37oC Incubator에서 배양하였다 (14). 세포가 배양 접시의 80~90% 차면 배지 제거 후 phos- phate-buffered saline(PBS, pH 7.
HS27 피부 섬유아세포에 비타민 C, silicon, 철분의 농도별 처리가 콜라겐 type I(Fig. 2)과 山(Fig. 3)의 단백질 발현에 미치는 영향을 western blotting으로 살펴보았으며 각 영양소별 0 uM 처리를 기준으로 하여 %contr이로 나타내었다. 3일 동안 5 uM의 비타민 C 처리는 콜라겐 type I 단백질의 발현을 132.
HS27 피부 섬유아세포에 비타민 C, 철분, silicon, proline 및 lysine 을 혈청 및 피부 내 농도 범위로 처리한 후 세포증식을 MTS assay로 측정하였다. 사전연구(23, 24)에 따라 비타민 C 는 장기간 처리 시 불안정하여 쉽게 산화되고 H2O2 를 생산하기 때문에 단기간인 3일과 5일로 나누어 살펴보았다 (Table 1).
HS27 피부 섬유아세포에 비타민 C, 철분, silicon의 농도별 처리가 콜라겐 type I(Fig. 1-A)과 皿(Fig. 1-B)의 mRNA 발현에 미치는 영향을 살펴보았다. Proline과 lysine 처리에 의한 HS27 피부 섬유아세포의 증식 증가로 이와 병행하는(Table 1) 콜라겐 합성 변화는 무의미할 것으로 생각되어 살펴보지 않았다.
23 uM(14)을 기준으로 하여 0~50 uM을 처리 농도로 정하였다. Prolinee 혈청 내 농도 200~300 uM(18)을 기준으로 0~300 uM을, lysine는 혈청 내 농도 71~151 uM(19)를 기준으로 0~150 uM 범위를 처리 농도로 정하였다.
6 uM(16)을 기준으로 하여 0~100 uM 범위로 정하였다. Silicon과 철분(Fe2+: ferrous ion)은 silicon의 혈청 내 농도 5~20 uM(17)과 철분의 혈청 내 농도 6.27~32.23 uM(14)을 기준으로 하여 0~50 uM을 처리 농도로 정하였다. Prolinee 혈청 내 농도 200~300 uM(18)을 기준으로 0~300 uM을, lysine는 혈청 내 농도 71~151 uM(19)를 기준으로 0~150 uM 범위를 처리 농도로 정하였다.
발현을 western blotting으로 측정하였다. 각 농도의 영양소를 3일 및 5일간 처리한 세포를 RIPA buffer(20 mM Tris-HCl, pH8, 150 mM NaCl, 10 mM NaPO4, 10% glycerol, 100 uM NasVOi, 100 uM ammonium molybdate, 1% NP-40, 0.1% SDS)에 4oC 상태로 풀어놓고 원심분리하여 상층액을 단백질 추출액으로 준비하였다. 단백질 양은 bovine serum albumin(BSA)을 표준액으로 하여 Bradford assay(Bio-Rad, CA, USA)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
05%, v/v) 에녹여 사용하였다. 각 표준물질의 농도는 각 영양소의 혈청 및 피부 내 농도를 기준으로 하였다. 구체적으로 본 실험에 사용한 비타민 C 농도는 혈청 내 농도 45 uM(15) 및 피부 내 농도인 7.
각 표준물질의 농도는 각 영양소의 혈청 및 피부 내 농도를 기준으로 하였다. 구체적으로 본 실험에 사용한 비타민 C 농도는 혈청 내 농도 45 uM(15) 및 피부 내 농도인 7.6 uM(16)을 기준으로 하여 0~100 uM 범위로 정하였다. Silicon과 철분(Fe2+: ferrous ion)은 silicon의 혈청 내 농도 5~20 uM(17)과 철분의 혈청 내 농도 6.
1% SDS)에 4oC 상태로 풀어놓고 원심분리하여 상층액을 단백질 추출액으로 준비하였다. 단백질 양은 bovine serum albumin(BSA)을 표준액으로 하여 Bradford assay(Bio-Rad, CA, USA)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
본 연구에서는 HS27 피부 섬유아세포에 비타민 C, silicon, 철분, proline 및 lysine을 혈청 및 피부 내 농도 범위로 처리한 후 세포의 증식을 비롯하여 콜라겐 I 과 山의 mRNA 및 단백질의 발현을 비교하였다. 비타민 c는 처리 기간 및 농도와 무관하게 세포 증식 및 mRNA 발현에 영향을 미치지 않았으며 콜라겐 type I 및 山의 단백질 발현은 각각 5~50 uM, 10~50 uM 농도에서 5일 처리 시 683.
MTS assay로 측정하였다. 사전연구(23, 24)에 따라 비타민 C 는 장기간 처리 시 불안정하여 쉽게 산화되고 H2O2 를 생산하기 때문에 단기간인 3일과 5일로 나누어 살펴보았다 (Table 1). MTS[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3- carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazo- lium)는 phenazine methosulfate(PMS)와 함께 세포의 미토콘드리아 내의 효소에 의해 환원반응이 일어나 water soluble formazan을 생성하는 특징을 가진다.
Silicon의 3일 및 5일 농도별 처리는 세포증식과 콜라겐 mRNA 및 단백질 발현을 다소 감소시키거나 영향을 미치지 않았다. 철분의 3일 및 5일 처리는 혈청 내 농도(11~35 uM)에서 콜라겐 mRNA 발현에 영향을 미치지 않았으며 세포 증식 및 콜라겐 단백질 발현을 증가시켰다. 또한 철분의 5~30 uM의 농도 처리는 5일 처리보다 3일 처리 시 발현수준이 훨씬 컸다.
또한 철분의 5~30 uM의 농도 처리는 5일 처리보다 3일 처리 시 발현수준이 훨씬 컸다. 콜라겐의 구성 아미노산인 proline 및 lysinee 섬유아세포의 증식을 증가시켰다. 따라서 단기간의 콜라겐의 합성 증가는 철분의 섭취가 적합하나 장기간의 섭취에는 비타민 C 의 섭취와 더불어 철분의 섭취가 필요한 것으로 여겨진다.
, Seoul, Korea)를 첨가하여 50oC에서 50분간 반응시킨 후 85oC에서 5분간, 4oC에서 5분간 반응하여 cDNA(250 ng/uL)를 합성하였다. 합성된 cDNA template를 gene-specific 한 oligonucleotide primer Collagen type I (GeneBank accesion No. NM00089)(10 pmol/uL)(21)의 sense primer(5'-CGGACGACCTGGTGAGAGA-3') 및 antisense primer(5'-CATTGTGTCCCCTAATGCCTT-3'), Collagen type 皿(GeneBank accesion No. NM 000090)(10 pmol/uL)(22) 의 sense primer(5'-TGGTCCCCAAGGTGT CAAAG-3') 및 antisense primer(5'-GGGGGTCCTGGG TTACCATTA-3') 를 사용하여 SYBR Green(Qiagen, Hilden, Germany) dye를 넣고 Applied Biosystems prism 7900 Sequence Detection System(Applied Biosystems, CA, USA)으로 증폭한 후 PCR product를 정량 분석하였다.
대상 데이터
0~100 uM 농도의 비타민 C, 0~50 uM의 철분 (ammonium ferrous sulfate)과 silicon(sodium siliconte solution), 0~300 uM proline과 0~150 uM의 lysine 표준물질을 dimethylsulfoxide(DMSO, 최종농도 <0.05%, v/v) 에녹여 사용하였다. 각 표준물질의 농도는 각 영양소의 혈청 및 피부 내 농도를 기준으로 하였다.
본 연구에서 사용한 HS27 피부 섬유아세포(human fibroblast cell) 는 한국 세포주 은행에서 분양받아 본 연구실에서 계대 배양하여 사용하였다. 실험에 사용한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), Fetal bovine se- rum(FBS), penicillin-streptomycin 및 Trypsin-EDTA는 Gibco사(CA, USA)에서 구입하였다.
계대 배양하여 사용하였다. 실험에 사용한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), Fetal bovine se- rum(FBS), penicillin-streptomycin 및 Trypsin-EDTA는 Gibco사(CA, USA)에서 구입하였다. 비타민 C(ascorbic acid: A4544), silicon(sodium silicate solution: 338443), ly- sine(L5501), proline(P5607), Fe(ferric citrate: F6129) 그리고 1차 항체 (collagen type I 과 山)와 본 연구에서 사용한 일반적 인 시 약은 Sigma-Aldrich Co.
데이터처리
0 program Statistical package for social science, Illinois, USA) 통계 프로그램을 이용하여 분석하며 결과는 평균 표준 오차로 표시하였다. 대조군과 처리군 간의 효과 비교는 one way ANOVA로 분석한 후 Duncan's multiple range test로 각 실험군 간의 유의성을 p<0.05 수준에서 검증하였다.
실험 결과는 SPSS(Ver 15.0 program Statistical package for social science, Illinois, USA) 통계 프로그램을 이용하여 분석하며 결과는 평균 표준 오차로 표시하였다. 대조군과 처리군 간의 효과 비교는 one way ANOVA로 분석한 후 Duncan's multiple range test로 각 실험군 간의 유의성을 p<0.
이론/모형
HS27 피부 섬유아세포의 증식 측정은 단기간에 대량 검색이 가능한 MTS(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3- carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazo- lium) colorimetric assay 방법 (Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay: Promega, CA, USA)을 사용하여 측정하였다. 96 well plate에 0.
피 부 섬 유아세포의 대표적인 collagen인 collagen I 과 山 단백질의 발현을 western blotting으로 측정하였다. 각 농도의 영양소를 3일 및 5일간 처리한 세포를 RIPA buffer(20 mM Tris-HCl, pH8, 150 mM NaCl, 10 mM NaPO4, 10% glycerol, 100 uM NasVOi, 100 uM ammonium molybdate, 1% NP-40, 0.
성능/효과
3)의 단백질 발현에 미치는 영향을 western blotting으로 살펴보았으며 각 영양소별 0 uM 처리를 기준으로 하여 %contr이로 나타내었다. 3일 동안 5 uM의 비타민 C 처리는 콜라겐 type I 단백질의 발현을 132.5%까지 증가시키나 유의적인 차이는 없었으며 100 uM의 처리는 단백질 발현을 현저히 감소시켰다. 반면 5일 동안 5~50 uM의 비타민 C 처리는 콜라겐 type I 단백질의 발현을 558.
7%)하였다. 또한 5일 동안 철분의 5~10 uM 처리 시 콜라겐 type I 발현을 158.2%까지 현저히 증가시켰으나 20 uM 이상의 농도처리에서 콜라겐 type I 발현을 현저히 감소시켰다. 철분의 콜라겐 type ffl 단백질의 발현은 3일과 5일 처리 시 5~30 uM에서 각각 250.
또한 진피 콜라겐의 80~85%를 차지하는 것으로 알려 진(4, 5) 콜라겐 type I 의 발현이 10~15% 차지하는 콜라겐 type 山보다 7배 이상 더 많이 발현이 되었으며 이는 여러 사전 연구(4, 5)와 일치하는 결과이다. 또한 세포 증식 없이 콜라겐 단백질의 발현 증가가 나타났으며 이는 콜라겐 합성에 있어서 비타민 C 의 조효소로서의 역할이 본 연구를 통해 그 중요성 이 다시 강조되었다, Silicon의 3일 처리는 콜라겐 type I 단백질 발현을 115.1%까지 증가시켰으나 유의적인 차이가 없었으며 5일 처리는 단백질 발현이 현저히 감소되었다. 또한 콜라겐 type 皿의 단백질 발현은 silicon 의 3일과 5일 처리 시 감소하는 경향이나 유의적인 차이가 없었다.
6 uM(16) 범위에서 콜라겐 단백질 발현이 현저히 증가하였으며 단기간의 처리보다 장기간의 비타민 C 처리가 더 효과적으로 나타났다. 또한 진피 콜라겐의 80~85%를 차지하는 것으로 알려 진(4, 5) 콜라겐 type I 의 발현이 10~15% 차지하는 콜라겐 type 山보다 7배 이상 더 많이 발현이 되었으며 이는 여러 사전 연구(4, 5)와 일치하는 결과이다. 또한 세포 증식 없이 콜라겐 단백질의 발현 증가가 나타났으며 이는 콜라겐 합성에 있어서 비타민 C 의 조효소로서의 역할이 본 연구를 통해 그 중요성 이 다시 강조되었다, Silicon의 3일 처리는 콜라겐 type I 단백질 발현을 115.
또한 콜라겐 type 山의 mRNA 발현에서 비타민 C 및 철분의 3일과 5일 처리는 다소 증가하는 경향이나 각각 100 uM, 50 이의 농도에서는 감소하였으며 유의적인 차이는 나타나지 않았다. Silicon의 3일과 5일 처리는 콜라겐 type 山의 mRNA 발현을 각각 116%, 108%까지 증가시켰으나 유의적인 차이가 없었다.
이는 여러 사전 연구 (27, 28)와 일치하는 결과로서 철분 역시 콜라겐 합성에 중요한 조효소임을 확인하였다. 본 연구에서 철분은 다소 세포증식 증가를 수반하나 증가 정도에 비해 콜라겐 단백질 합성증가가 현저히 크게 나타났다. 따라서 단기간의 콜라겐 합성증가에는 철분이 중요한 영양소로 생각되어지며 장기간의 콜라겐 합성 증가의 중요한 영양소는 비타민 C 로 생각되어진다.
5일 동안 비타민 C의 10~50 uM 처리는 콜라겐 type 山의 단백질 발현을 182%까지 현저히 증가시켰다. 비타민 C의 혈청 내 농도인 45 uM(15)와 피부 내 농도인 7.6 uM(16) 범위에서 콜라겐 단백질 발현이 현저히 증가하였으며 단기간의 처리보다 장기간의 비타민 C 처리가 더 효과적으로 나타났다. 또한 진피 콜라겐의 80~85%를 차지하는 것으로 알려 진(4, 5) 콜라겐 type I 의 발현이 10~15% 차지하는 콜라겐 type 山보다 7배 이상 더 많이 발현이 되었으며 이는 여러 사전 연구(4, 5)와 일치하는 결과이다.
단백질의 발현을 비교하였다. 비타민 c는 처리 기간 및 농도와 무관하게 세포 증식 및 mRNA 발현에 영향을 미치지 않았으며 콜라겐 type I 및 山의 단백질 발현은 각각 5~50 uM, 10~50 uM 농도에서 5일 처리 시 683.9%, 182% 이상으로 발현을 증가시켰다. Silicon의 3일 및 5일 농도별 처리는 세포증식과 콜라겐 mRNA 및 단백질 발현을 다소 감소시키거나 영향을 미치지 않았다.
철분 역시 세포의 증식을 초래하였으나 proline 및 lysine의 증식 수준에는 미치지 못하였다. 이 결과 HS27 피부 섬유아세포에 각 영양소간에 3일과 5일 처리는 세포 독성을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
그러나 본 연구에서 silicon의 혈청 내 농도 범위인 5~20 uM(17) 처리 시콜라겐에 대한 영향을 조사한 결과 콜라겐 단백질 발현 증가에 영향을 미치지 않는 것으로 생각되어진다. 철분은 3일 동안 10~50 uM 처리에서 323.0%까지 콜라겐 type I 단백질의 발현을 증가시켰으나 30 uM 이상의 농도처리에서는 콜라겐 type I 단백질의 발현 증가가 다소 감소(179.7%)하였다. 또한 5일 동안 철분의 5~10 uM 처리 시 콜라겐 type I 발현을 158.
2%까지 현저히 증가시켰으나 20 uM 이상의 농도처리에서 콜라겐 type I 발현을 현저히 감소시켰다. 철분의 콜라겐 type ffl 단백질의 발현은 3일과 5일 처리 시 5~30 uM에서 각각 250.3%, 185.1%까지 증가시켰으나 50 UM의 처리에서는 콜라겐 type E 단백질 발현을 감소시켰으며 3일 처리에 비해 5일 처리 시 감소 정도가 현저히 컸다. 철분은 비타민 C 와 더불어 콜라겐 합성에 중요한 조효소로 작용하는 영양소로 혈청 내 농도 11~35 uM(14)에서 콜라겐단백질 합성을 현저히 증가시켰다.
9%까지 증가시켰으며 100 uM 의 처리는 콜라겐 단백질 발현을 1300% 이상으로 증가시켰다. 콜라겐 type 山의 단백질 발현은 콜라겐 type I 의 단백질 발현과 유사한 경향으로 나타났으며 3일 동안 5 uM의비타민 C 처리는 콜라겐 type 山의 단백질 발현을 135.1% 증가시키나 유의적인 차이는 없었으며 100 uM 처리 시 현저히 감소시켰다. 5일 동안 비타민 C의 10~50 uM 처리는 콜라겐 type 山의 단백질 발현을 182%까지 현저히 증가시켰다.
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