피부 섬유아세포에서 비타민 C, Silicon, 철분 처리가 콜라겐 합성 및 분해 관련 효소의 발현에 미치는 효과 비교 Effect of Vitamin C, Silicon and Iron on Collagen Synthesis and Break-Down Enzyme Expression in the Human Dermal Fibroblast Cell (HS27)원문보기
본 연구에서는 비타민 C, silicon, 철분을 농도별로 피부섬유아 세포에 처리 후 콜라겐 합성 효소인 PH, LH의 mRNA와 protein 발현 및 분해 효소인 MMP-1와 저해제인 TIMP-1의 mRNA, protein 발현의 변화를 대조군과 비교 분석하였으며 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 피부 섬유아세포에서 비타민 C의 처리는 콜라겐 합성 효소인 PH의 mRNA 발현을 대조군에 비해 현저하게 증가시켰고 이와 병행하여, PH의 protein 발현도 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다. 그러나 다른 콜라겐 합성 효소인 LH의 mRNA 발현에는 영향을 미치지 않았으나 protein의 발현을 증가시켰다. 또한, 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 mRNA 발현은 대조군에 비해 유의적으로 증가시켰으나 protein 발현에서는 대조군과 차이가 없었다. 2) 피부 섬유아세포에서 silicon의 혈중 내 농도 처리는 LH의 mRNA 발현의 현저한 증가와 더불어 protein 발현에도 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 콜라겐 분해 효소인 MMP-1과 저해제인 TIMP-1의 단백질 발현을 대조군에 비해 증가시켰다. 3) 피부 섬유아세포에서 철분의 혈중 내 농도 처리는 콜라겐 합성 및 분해 관련 효소의 mRNA 및 protein 발현에 영향을 미치지 않았다. 결론적으로, 피부섬유아세포에서 비타민 C 및 silicon의 처리는 콜라겐의 posttranslational modification 관련 효소의 mRNA의 발현 및 단백질의 발현을 증가시켜 궁극적으로 콜라겐 합성에 긍정적인 영향을 나타내었다.
본 연구에서는 비타민 C, silicon, 철분을 농도별로 피부섬유아 세포에 처리 후 콜라겐 합성 효소인 PH, LH의 mRNA와 protein 발현 및 분해 효소인 MMP-1와 저해제인 TIMP-1의 mRNA, protein 발현의 변화를 대조군과 비교 분석하였으며 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) 피부 섬유아세포에서 비타민 C의 처리는 콜라겐 합성 효소인 PH의 mRNA 발현을 대조군에 비해 현저하게 증가시켰고 이와 병행하여, PH의 protein 발현도 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다. 그러나 다른 콜라겐 합성 효소인 LH의 mRNA 발현에는 영향을 미치지 않았으나 protein의 발현을 증가시켰다. 또한, 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 mRNA 발현은 대조군에 비해 유의적으로 증가시켰으나 protein 발현에서는 대조군과 차이가 없었다. 2) 피부 섬유아세포에서 silicon의 혈중 내 농도 처리는 LH의 mRNA 발현의 현저한 증가와 더불어 protein 발현에도 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 콜라겐 분해 효소인 MMP-1과 저해제인 TIMP-1의 단백질 발현을 대조군에 비해 증가시켰다. 3) 피부 섬유아세포에서 철분의 혈중 내 농도 처리는 콜라겐 합성 및 분해 관련 효소의 mRNA 및 protein 발현에 영향을 미치지 않았다. 결론적으로, 피부섬유아세포에서 비타민 C 및 silicon의 처리는 콜라겐의 posttranslational modification 관련 효소의 mRNA의 발현 및 단백질의 발현을 증가시켜 궁극적으로 콜라겐 합성에 긍정적인 영향을 나타내었다.
Collagen is the major matrix protein in dermis and consists of proline and lysine, which are hydroxylated by prolyl hydroxylase (PH) and lysyl hydroxylase (LH) with cofactors such as vitamin C, oxygen, iron (Fe$^{2+}$), ketoglutarate and silicon. The collagen degradation is regulated by m...
Collagen is the major matrix protein in dermis and consists of proline and lysine, which are hydroxylated by prolyl hydroxylase (PH) and lysyl hydroxylase (LH) with cofactors such as vitamin C, oxygen, iron (Fe$^{2+}$), ketoglutarate and silicon. The collagen degradation is regulated by matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), of which is the major collagen-degrading proteinase whereas tissue inhibitors of metalloproteinase-1 (TIMP-1) bind to MMP-1 thereby inhibiting MMP-1 activity. In this study, we investigated the effects of vitamin C, silicon and iron on mRNA, protein expressions of PH, LH, MMP-1 and TIMP-1. The physiological concentrations of vitamin C (0-100 $\mu$M), silicon (0-50 $\mu$M) and iron (Fe$^{2+}$：0-50 $\mu$M) were treated to human dermal fibroblast cells (HS27 cells) for 3 or 5days. The expression level of mRNA and protein was increased in not only PH but also LH when cells were incubated with vitamin C. A similar increase in LH mRNA or protein expression occurred when cells were incubated with silicon. Our results suggest that treatment of vitamin C and silicon increased mRNA and protein expression of PH and LH in human dermal fibroblast.
Collagen is the major matrix protein in dermis and consists of proline and lysine, which are hydroxylated by prolyl hydroxylase (PH) and lysyl hydroxylase (LH) with cofactors such as vitamin C, oxygen, iron (Fe$^{2+}$), ketoglutarate and silicon. The collagen degradation is regulated by matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), of which is the major collagen-degrading proteinase whereas tissue inhibitors of metalloproteinase-1 (TIMP-1) bind to MMP-1 thereby inhibiting MMP-1 activity. In this study, we investigated the effects of vitamin C, silicon and iron on mRNA, protein expressions of PH, LH, MMP-1 and TIMP-1. The physiological concentrations of vitamin C (0-100 $\mu$M), silicon (0-50 $\mu$M) and iron (Fe$^{2+}$：0-50 $\mu$M) were treated to human dermal fibroblast cells (HS27 cells) for 3 or 5days. The expression level of mRNA and protein was increased in not only PH but also LH when cells were incubated with vitamin C. A similar increase in LH mRNA or protein expression occurred when cells were incubated with silicon. Our results suggest that treatment of vitamin C and silicon increased mRNA and protein expression of PH and LH in human dermal fibroblast.
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문제 정의
비타민 C, silicon, 철분의 각 농도별 처리가 콜라겐을 분해하는 대표적인 효소로 알려져 있는 MMP-1과 MMP1의 저해제인 TIMP-1의 mRNA 발현에 미치는 영향에 대해 알아보았다. HS27 섬유아세포에서 비타민 C, silicon, 철분을 혈청 및 피부 내 농도 범위로 3일 또는 5일 처리 후 RT-PCR로 살펴본 MMP-1의 mRNA 발현을 house keeping gene 인 GAPDH 및 대조군의 발현을 기준으로 수치화 한 결과, 3일간의 50 μM 비타민 C를 처리한 군에서 대조군에 비해 MMP-1의 mRNA 발현이 200% 증가한 반면 (p = 0.
7) 그러나, 콜라겐 합성 과정에서 조효소로 작용하는 silicon, 철분 등의 콜라겐 합성 및 콜라겐의 분해 효소에 미치는 영향에 관한 연구는 미비한 실정이다. 이에 본 연구에서는 비타민 C, silicon, 철분을 HS27 피부 섬유아세포에 농도별로 처리하여 콜라겐의 합성에 관여하는 효소인 proline hydroxylase (PH), lysyl hydroxylase (LH)와 분해에 관여하는 효소인 MMP-1과 저해제인 TIMP-1의 mRNA와 단백질 발현에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
가설 설정
Human dermal fibroblast cultures were treated with ascorbic acid (0, 5, 10, 50, 100 μM), silicon (0, 5, 10, 25, 50 μM) and Fe (0, 5, 10, 20, 30, 50 μM) for 3 days. A: The expressions of MMP-1 protein was analysis by western blotting. B: The expressions of TIMP-1 was analyzed by western blotting.
A: The expressions of MMP-1 protein was analysis by western blotting. B: The expressions of TIMP-1 was analyzed by western blotting. Results shown are means ± SEM.
제안 방법
1% Tween-20을 함유한 PBS로 15분씩 3차례 세척하였다. Blocking solution으로 1：5,000배로 희석시킨 peroxidase-conjugated anti-IgG 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 0.1% Tween-20을 함유한 PBS로 3차례 세척하고 발색은 ECL hyperfilm으로 확인하였다. 각 Band의 intensity는 imaging densitometer (model GS-700, BIO-RAD, USA)를 사용하여 정량화하였다.
Human dermal fibroblast cultures were treated with ascorbic acid (0, 5, 10, 50, 100 μM), silicon (0, 5, 10, 25, 50 μM) and Fe (0, 5, 10, 20, 30, 50 μM) for 3 days.
Human dermal fibroblast cultures were treated with ascorbic acid (0, 5, 10, 50, 100 μM), silicon (0, 5, 10, 25, 50 μM) and Fe (0, 5, 10, 20, 30, 50, 100 μM) for 3 days (A) and 5 days (B).
MMP-1, TIMP-1 단백질의 발현 변화는 비타민 C, silicon 및 철분의 3가지 관련 영양소의 3일 및 5일 처리 후 western blotting을 이용하여 알아보았다. MMP-1 단백질의 발현을 단백질 loading control인 β-actin 및 대조군을 기준으로 수치화한 결과 (Fig.
PCR 생성물은 2% agarose gel에서 non-specific PCR product나 primer dimer 등이 없는지를 확인하였고, 생성물의 양을 imaging densitometer [Labworks ver.4.6. (image acquisition and analysis software), UVP, CA]를 사용하여 측정하였다.
PH 및 LH 단백질의 발현 변화를 비타민 C, silicon 및 철분의 3일 및 5일 처리 후 western blotting으로 살펴보았다 (Fig. 3, 4). PH 단백질의 발현을 단백질 loading control인 β-actin 및 대조군을 기준으로 수치화한 결과 (Fig.
준비된 단백질을 4x sample buffer에 혼합하고 95℃에서 5분간 가열한 다음 10% SDS-PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis)에서 전기 영동시킨 후 Hybond ECL nitrocellulose membrane에 흡착시켰다. PH, LH, MMP1 및 TIMP-1의 1차 항체는 5% skim milk, 0.1% Tween20을 함유한 PBS에 희석시켜서 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 0.1% Tween-20을 함유한 PBS로 15분씩 3차례 세척하였다. Blocking solution으로 1：5,000배로 희석시킨 peroxidase-conjugated anti-IgG 2차 항체와 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 0.
PH의 primer를 각각 1 μL (0.5 μg/μL)씩 가하고 합성된 cDNA에 0.1% DEPC-Water와 함께 PCR-premix tube ((주)바이오니아)에 첨가하여 Denaturation은 95℃에서 30초, annealing은 72℃에서 30초, extension은 72℃에서 2분동안 30cycle로 진행하였다.
1% diethylpyrocarbonate (DEPC) 증류수를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 가열하여 cDNA를 합성하였다. Prolyl hydroxylase (PH), Lysyl hydroxylase (LH), MMP-1, TIMP-1의 mRNA 발현량을 측정하기 위하여 합성된 cDNA로 RT-PCR을 실시하였다. 사용된 GAPDH (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), PH, LH, MMP-1, TIMP1의 primer sequence는 Table 1과 같다.
Silicon과 철분은 Silicon의 혈청 내 농도 5~20 μM15)과, 철분의 혈청 내 농도 6.27~32.23 μM16)를 기준으로 하여 0~50 μM을 처리 농도로 정하였다.
Total RNA 10 μL (0.5μg/μL)를 65℃에서 10분간 가열하고 4℃에서 10분 동안 방치한 후 1 μL oligo (dT)15 primer (0.5 μg/μL), 1μL M-MLV RT (10 unit/μL; promega, USA), 1 μL RNase inhibitor (20~40 unit/μL; promega, USA), 10μL 5X RT buffer (250 mM Tris-HCl, pH8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2), 5 μL 2.5 mmol/L dNTP mixture, 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) 증류수를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 가열하여 cDNA를 합성하였다.
각 농도의 비타민 C, 철분, silicon을 3일 또는 5일간 처리한 세포를 RIPA buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 10 mM NaPO, 10% glycerol, 100 μM NaVO, 100 μM ammonium molybdate, 1% NP-40, 0.1% SDS)에 4℃ 상태로 풀어놓고 원심 분리하여 상층액을 단백질 추출액으로 준비하였다.
05%, v/v)에 녹여 사용하였다. 각 표준물질의 농도는 각 영양소의 혈청 및 피부 내 농도를 기준으로 하였다. 구체적으로 본 실험에 사용한 ascorbic acid 농도는 혈청 내 ascorbic acid 농도 45 μM7) 및 피부 내 농도인 7.
구체적으로 본 실험에 사용한 ascorbic acid 농도는 혈청 내 ascorbic acid 농도 45 μM7) 및 피부 내 농도인 7.6 μM을 기준으로 하여 0~100 μM 범위로 정하였다.
1% SDS)에 4℃ 상태로 풀어놓고 원심 분리하여 상층액을 단백질 추출액으로 준비하였다. 단백질 양은 bovine serum albumin을 표준으로 하여 Bradford assay (Bio Rad)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였다.
본 연구에서는 비타민 C, silicon, 철분을 농도별로 피부섬유아 세포에 처리 후 콜라겐 합성 효소인 PH, LH의 mRNA와 protein 발현 및 분해 효소인 MMP-1와 저해제인 TIMP1의 mRNA, protein 발현의 변화를 대조군과 비교·분석하였으며 그 결과를 요약하면 다음과 같다.
HS27 피부 섬유아세포 (Human dermal fibroblast cell) 는 Polystyrene 세포 배양접시에 부착시키고 10% FBS (Gibco, USA)를 첨가한 DMEM (Gibco, USA)을 사용하여 배양하였다. 배양시 습도는 95%, 온도는 37℃를 유지하면서 5% CO2를 계속 공급하였다.
10% fetal bovine serum (FBS), Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), trizol reagent는 Gibco사 (CA, USA)에서 구입하였고, M-MLV RT, RNase inhibitor는 Promega (CA, USA)에서, PCR-premix tube는 (주)바이오니아에서 구입하였다. PH, LH, MMP-1 및 TIMP-1의 1차 항체는 CHEMICON International Co (Temecula, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
본 연구에 사용한 HS27 피부 섬유아세포는 한국세포주 은행에서 분양받아 본 연구실에서 계대 배양하여 사용하였다. 비타민 C (ascorbic acid: A4544), silicon (sodium silicate solution: 338443) 및 철분 (ferric citrate: F6129) 은 Sigma (Sigma, USA)에서 구입하였다.
본 연구에 사용한 HS27 피부 섬유아세포는 한국세포주 은행에서 분양받아 본 연구실에서 계대 배양하여 사용하였다. 비타민 C (ascorbic acid: A4544), silicon (sodium silicate solution: 338443) 및 철분 (ferric citrate: F6129) 은 Sigma (Sigma, USA)에서 구입하였다. 10% fetal bovine serum (FBS), Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), trizol reagent는 Gibco사 (CA, USA)에서 구입하였고, M-MLV RT, RNase inhibitor는 Promega (CA, USA)에서, PCR-premix tube는 (주)바이오니아에서 구입하였다.
데이터처리
대조군과 처리군 간의 평균에 대한 유의성은 general linear model (GLM)의 Duncan’s multiple range test를 이용하여 p <0.05에서 검증하였다.
실험 결과는 SPSS ver.13 (SPSS Inc, Illinois, USA) 통계 프로그램을 이용하여 분석하였으며 그 결과는 평균± 표준 오차 (mean ± SEM) 로 표시하였다.
이론/모형
Western blotting을 이용한 효소의 단백질 발현 측정 PH, LH, MMP-1, TIMP-1의 단백질 발현을 western blotting으로 측정하였다. 각 농도의 비타민 C, 철분, silicon을 3일 또는 5일간 처리한 세포를 RIPA buffer (20 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 10 mM NaPO, 10% glycerol, 100 μM NaVO, 100 μM ammonium molybdate, 1% NP-40, 0.
성능/효과
1) 피부 섬유아세포에서 비타민 C의 처리는 콜라겐 합성효소인 PH의 mRNA 발현을 대조군에 비해 현저하게 증가시켰고 이와 병행하여, PH의 protein 발현도 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다. 그러나 다른 콜라겐 합성 효소인 LH의 mRNA 발현에는 영향을 미치지 않았으나 protein의 발현을 증가시켰다.
10) 기질 단백질 분해효소는 여러 효소의 집합으로 구조와 기능적 특성에 따라 여러 개의 집단으로 나누어지는데,11) 이 중 피부의 대표적인 콜라겐인 콜라겐 Type 1은 MMP-1에 의해 분해되고 MMP-1의 작용은 세포의 항상성을 유지하기 위해 분비되는 2-marcroglobulin이나 TIMP-1과 같은 저해제에 의해 활성이 조절된다. 이러한 MMPs 및 TIMPs 등의 효소들은 섬유아세포를 포함한 대다수의 많은 세포들에서 분비된다.
2) 피부 섬유아세포에서 silicon의 혈중 내 농도 처리는 LH의 mRNA 발현의 현저한 증가와 더불어 protein 발현에도 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 콜라겐 분해 효소인 MMP-1과 저해제인 TIMP-1의 단백질 발현을 대조군에 비해 증가시켰다.
3) 피부 섬유아세포에서 철분의 혈중 내 농도 처리는 콜라겐 합성 및 분해 관련 효소의 mRNA 및 protein 발현에 영향을 미치지 않았다.
037), TIMP-1의 mRNA 발현은 농도와는 상관없이 대조군 보다 낮은 발현량을 나타내었다. 3일, 5일간의 silicon 및 철분 처리군 및 5일간의 비타민 C 처리군에서 MMP-1 및 TIMP-1의 mRNA 발현은 대조군과 차이가 없었다.
5 μM 비타민 C의 5일간의 처리군에서 300%까지 PH의 mRNA 발현이 현저히 증가하였으나, 그 증가 정도는 3일간의 처리에 비해서 낮았다.
HS27 섬유아세포에서 비타민 C, silicon, 철분을 혈청 및 피부 내 농도 범위로 3일 또는 5일 처리 후 RT-PCR로 살펴본 MMP-1의 mRNA 발현을 house keeping gene 인 GAPDH 및 대조군의 발현을 기준으로 수치화 한 결과, 3일간의 50 μM 비타민 C를 처리한 군에서 대조군에 비해 MMP-1의 mRNA 발현이 200% 증가한 반면 (p = 0.037), TIMP-1의 mRNA 발현은 농도와는 상관없이 대조군 보다 낮은 발현량을 나타내었다.
HS27 섬유아세포에서 비타민 C, silicon, 철분을 혈청 및 피부 내 농도 범위로 3일 또는 5일 처리 후 RT-PCR로 살펴본 prolyl hydroxylase (PH)의 mRNA 발현을 house keeping gene 인 GAPDH 및 대조군의 발현을 기준으로 수치화 한 결과 (Fig. 1), 3일간의 5~100 μM 비타민 C 처리는 PH의 mRNA 발현을 현저히 증가시켰는데, 특히5 μM 및 50 μM의 비타민 C 처리군에서 PH mRNA의 발현이 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다 (p = 0.026).
MMP-1 단백질의 발현을 단백질 loading control인 β-actin 및 대조군을 기준으로 수치화한 결과 (Fig. 5), 비타민 C 처리군에서 농도 및 기간과 무관하게 MMP-1 및 TIMP-1의 단백질 발현에 변화가 없었다.
PH 단백질의 발현을 단백질 loading control인 β-actin 및 대조군을 기준으로 수치화한 결과 (Fig. 3), 비타민 C 처리에 의한 PH mRNA의 현저한 발현 증가에도 불구하고 (Fig. 1), 3일 동안의 비타민 C는 처리 농도 및 처리 기간과 무관하게 PH 단백질의 발현에 영향을 미치지 않았으나 5 μM 비타민 C의 5일 처리군에서 PH 단백질의 발현이 유의적으로 증가하였다 (p = 0.037).
Silicon이 LH의 발현 또는 활성에 영향을 미치는 연구는 거의 없었으나 본 연구에서는 5~50 μM silicon을 처리한 군에서 LH의 mRNA 및 단백질 발현을 현저히 증가시키는 것으로 나타났다.
각 영양소의 3일 또는 5일간의 처리 후 Lysyl hydroxylase (LH)의 mRNA 발현을 수치화한 결과 (Fig. 2), 3일 간의 5~50 μM silicon 처리군에서 LH의 mRNA 발현이 대조군에 비해 유의적으로 증가하였다 (p = 0.012).
결론적으로, 피부섬유아세포에서 비타민 C 및 silicon의처리는 콜라겐의 posttranslational modification 관련 효소의 mRNA의 발현 및 단백질의 발현을 증가시켜 궁극적으로 콜라겐 합성에 긍정적인 영향을 나타내었다.
20,22) Murad, Sivarajah 등20)의 연구결과와 비교하여, 250 μM의 비타민 C를 처리하여 효소의 활성화를 나타냄에 있어서는 다소 차이가 있으나 본 연구결과에서는 3일 동안의 5 μM 비타민 C의 처리에 있어서 PH의 mRNA의 현저한 증가에도 불구하고 단백질 발현에는 대조군과 차이가 없었다. 그러나, 5일 동안의 비타민 C 처리에서는 다른 실험군보다 PH 단백질 발현이 유의적으로 증가하여 콜라겐 합성 과정에서 비타민 C가 콜라겐의 합성효소인 PH에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 나타났다. 또한, 본 연구 결과에서 비타민 C의 50 μM농도 처리에서 LH의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 보아, 이는 4일 동안 비타민 C를 1 mM, 100 μM 농도 처리하여 콜라겐의 합성을 알아본 Boyera, Galey 등23)의 연구와 비교하여, 본 연구에서 비타민 C의 혈청과 피부 내의 농도범위인 5~50 μM 농도를 처리한 군에서 콜라겐 합성효소인 PH 및 LH의 단백질 발현을 증가시킴으로써 비타민 C의 적은 농도로 fibroblast의 자극을 통해 콜라겐의 합성 효소의 발현을 증가시킬 것으로 여겨진다.
또한, 본 연구 결과에서 비타민 C의 50 μM농도 처리에서 LH의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 보아, 이는 4일 동안 비타민 C를 1 mM, 100 μM 농도 처리하여 콜라겐의 합성을 알아본 Boyera, Galey 등23)의 연구와 비교하여, 본 연구에서 비타민 C의 혈청과 피부 내의 농도범위인 5~50 μM 농도를 처리한 군에서 콜라겐 합성효소인 PH 및 LH의 단백질 발현을 증가시킴으로써 비타민 C의 적은 농도로 fibroblast의 자극을 통해 콜라겐의 합성 효소의 발현을 증가시킬 것으로 여겨진다.
또한, 본 연구에서 silicon의 5 μM를 처리한 군에서 TIMP1의 단백질 발현이 현저히 증가하였고, 50 μM의 처리군에서는 MMP-1의 단백질 발현이 대조군에 비해 증가하였다.
반면에 β-actin 및 대조군을 기준으로 수치화한 LH 단백질의 발현 결과 (Fig. 4), 3일간의 5~50 μM silicon 처리군에서 LH의 단백질 발현은 농도 의존적으로 현저히 증가하였다 (p = 0.011).
이 결과, 각 영양소의 3일 또는 5일 처리 후 MMP-1 및 TIMP-1의 mRNA 발현은 3일간의 비타민 C를 50 μM 처리한 군에서 MMP-1의 mRNA 발현이 대조군에 비해 증가한 반면 silicon, 철분의 처리 및 각 군의 5일간의 처리에서는 MMP-1 및 TIMP-1의 mRNA 발현은 대조군과 차이가 없었다.
Silicon이 LH의 발현 또는 활성에 영향을 미치는 연구는 거의 없었으나 본 연구에서는 5~50 μM silicon을 처리한 군에서 LH의 mRNA 및 단백질 발현을 현저히 증가시키는 것으로 나타났다. 이 결과는 silicon을 처리한 군에서의 LH mRNA 발현 증가 결과와 병행하여, 혈청 내 농도의 silicon이 피부 콜라겐의 posttranslational modification 관련 효소 중 lysyl hydroxylase mRNA의 발현 증가를 초래하여 궁극적으로 LH 단백질의 발현을 증가시킴과 동시에 LH의 최대 활성을 유지시켜 콜라겐의 cross-link 구조를 유지하는 것이라 여겨진다.
후속연구
이는 합성 효소와 결합한 Fe2+의 형태인 철분의 산화와 비타민 C의 환원 작용이 동시에 일어남으로써 효소의 활성이 이루어지는 것이나, 본 실험에서의 철분의 단독 처리만으로는 효소의 활성이 지속되지 않은 것으로 여겨진다. 또한 본 실험에서 사용된 철분의 농도는 사전 연구의 농도에 반해 높은 수준으로 처리되어 추후의 연구에서는 보다 낮은 농도를 이용한 연구가 진행되어야 할 것이다. 이와 병행하여 MMP-1과 TIMP-1의 발현에도 변화가 없었다.
이와 같은 5~50 μM의 비타민 C 및 silicon의 처리에 의한 피부 섬유아세포에서의 콜라겐 합성을 유도하는 효소에 미치는 긍정적인 변화가 최종적으로 콜라겐 합성량에관여하는지 in vitro에서의 연구가 이루어져야 할 것이며, 콜라겐 합성 효소 및 콜라겐 합성에 긍정적인 효과가 있는 농도를 찾아내어 추후 동물실험을 통한 연구가 진행되어야 할 것이나, 본 연구에서 제시된 비타민 C 및 silicon의 처리 후 콜라겐 합성 효소의 발현 증가는 피부 탄력 증진을 위한 건강 기능식품 소재로의 개발 가능성을 제안한다.
또한, 본 연구 결과에서 비타민 C의 50 μM농도 처리에서 LH의 발현이 현저하게 증가하는 것으로 보아, 이는 4일 동안 비타민 C를 1 mM, 100 μM 농도 처리하여 콜라겐의 합성을 알아본 Boyera, Galey 등23)의 연구와 비교하여, 본 연구에서 비타민 C의 혈청과 피부 내의 농도범위인 5~50 μM 농도를 처리한 군에서 콜라겐 합성효소인 PH 및 LH의 단백질 발현을 증가시킴으로써 비타민 C의 적은 농도로 fibroblast의 자극을 통해 콜라겐의 합성 효소의 발현을 증가시킬 것으로 여겨진다. 이와 병행하여 3~5일 사이의 비타민 C의 농도별 처리 기간은, 5일 이상 비타민 C를 처리는 세포배양액 내의 H2O2의 농도를 증가시켜 세포의 독성을 유발한다는 Duarte, Almeida 등24)의 연구와 비교하여, 세포 독성 및 비타민 C의 안정성에 영향을 미치지 않는 기간으로 향후 콜라겐 관련 연구에 적정 수준임을 제안한다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
tissue inhibitor of metalloproteinase 효소가 분비되는 세포는?
10) 기질 단백질 분해효소는 여러 효소의 집합으로 구조와 기능적 특성에 따라 여러 개의 집단으로 나누어지는데,11) 이 중 피부의 대표적인 콜라겐인 콜라겐 Type 1은 MMP-1에 의해 분해되고 MMP-1의 작용은 세포의 항상성을 유지하기 위해 분비되는 2-marcroglobulin이나 TIMP-1과 같은 저해제에 의해 활성이 조절된다. 이러한 MMPs 및 TIMPs 등의 효소들은 섬유아세포를 포함한 대다수의 많은 세포들에서 분비된다.12,13)
표피의 역할은?
피부는 표피, 진피, 피하조직으로 구성되어 이 중 표피는 외부 자극으로부터 신체를 보호하고, 체온 조절, 보습 유지 작용을 한다. 진피는 섬유성분, 기질성분으로 구성되어 있으며 섬유성분으로 존재하는 콜라겐은 진피층의 90%를 차지하는 주요 단백질로써 피부 연결 조직을 유지하여, 피부에 강도와 장력을 준다.
피부의 구성 요소는?
피부는 표피, 진피, 피하조직으로 구성되어 이 중 표피는 외부 자극으로부터 신체를 보호하고, 체온 조절, 보습 유지 작용을 한다. 진피는 섬유성분, 기질성분으로 구성되어 있으며 섬유성분으로 존재하는 콜라겐은 진피층의 90%를 차지하는 주요 단백질로써 피부 연결 조직을 유지하여, 피부에 강도와 장력을 준다.
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