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문제 정의
- 본 연구에서는 산화스트레스에 대한 식물의 방어 반응에서 폴리아민의 생리, 생화학적 역할을 규명하고자 하였다. 이를 위해 세포 내 산소 분자를 환원하여 superoxide 라디칼과 H2O2 분자를 만들어 냄으로서 세포에 산화적 손상을 발생시켜 산화스트레스 유도인 자로 잘 알려진 제초제 PQ (Martinez et al.
제안 방법
- CAT isozyme 분리는 Kunce 와 Trelease (1986)방법을 기초로 하여 수행하였다. 7% polyacrylamide gel 및 4% stacking gel을 이용하여 4C 온도 조건과 일정전압 (stacking gel: 50V, seperating gel: 100V) 하에서 8 시간 동안 Native-PAGE 롤 실시하였다. 이때 loading 시료는 35 nL 부피 내에 동량의 자엽단백질 (40 ug)이 포함되도록 하였다 전기영동 후 gel을 증류수로 10분간 2회 세척한 후 3.
- Taewang) 종자를 선별하여 1% sodium hypochlorite 용액에 15 분간 표면 살균시킨 후 증류수로 충분히 세척하였다. Ball 상토 No. 1 (흥농종묘) 을 1/3 가량 담은 투명한 플라스틱 용기 (11.5 X 11.5 X 7.5 cm) 에 증류수 120 mL 를 가해 충분히 적신 후 이 용기 1 개당 25개씩의 살균된 종자를 파종하고 투명한 wrap 을 씌웠다. 이 발아용기를 75% 상대습도, 24/20^ (나밤)의 온도 및 8, 000 lux 빛 세기로 16 h / 8 h (낮/밤)의 광주기 조건을 갖는 growth chamber 내에 넣고 발아, 생육시켰다.
- 1971). GPX isozyme 분리를 위해 10% polyacrylamide gel 및 4% stacking gel 을 이용하여 4C 온도 및 일정 전압 (stacking gel: 50V, seperating gel: 100V)하에서 7시간 동안 Native-PAGE 를 실시하였다. 이때 loading 시료는 80 uL 부피 내에 동량의 자엽단백질 (200 ug)이 포함되도록 하였다.
- PQ 의 산화적 독성에 대한 여러 폴리아민의 생리 효과를 조사하기 위해 먼저 각 종류별 PA 의 처리 농도 결정 실험을 수행하였는데, PQ 처리 24시간 후 자엽의 생체량 변화를 조사한 결과는 Fig. 1에 나타낸 바와 같다.
- PQ 처리 24시간 후 무 유식물에서 하배축과 뿌리를 제거한 후자엽을 취하여 생체량 변화를 측정하였다. 자엽의 엽록소 정량은 5쌍의 자엽을 냉각된 mortar 와 pestle 을 이용해서 80% aceton (0.
- 1985). 그러므로 본 실험에서 PQ 에 노출된 무 자엽에서 PA에 의해 유도된 H2O2 축적 억제 현상( Fig. 3)과 관련하여 CAT 와 GPX 의 총활성도 변화에 미치는 PA 의 효과를 먼저 조사하였다. Fig.
- Donahue 등 (1997) 은 제초제 PQ 를 완두 잎에 단기간 처리 시잎의 나이 및 품종에 따라 ascorbate peroxidase 및 glutathione reductase 의 총활성도 및 그 들의 동위효소 반응이 차등적으로 발현됨을 관찰하여 식물이 스트레스에 대한 내성을 발휘하는데 있어 이 들 항산화 효소의 특정 동위효소가 중요한 역할을 할 가능성을 제시하였다. 따라서 무 자엽에서 PQ 스트레스에 대한 PA 의 방어 효과를 이해하기 위해 CAT 및 GPX 총활성도 변화와 함께 이들 효소의 동위효소 발현 양상을 분석하였다. 본 실험 식물인 무 자엽에서는 2개의 CAT 동위효소 밴드가 분리되었다( Fig.
- 가장 방어 효과가 현저한 10-3 M 농도에서 PA 종류별로 그 효과를 비교하여 볼 때, Spd, Spm, 및 Put 순으로 방어 효과가 나타났다. 따라서 이 후의 실험에서는 PQ 독성에 대한 방어 효과가 가장 높은 10-3 M (1 mM) 농도를 모든 PA 처리 농도로 사용하였다.
- 반면에 Put 와 Spm 처리에 의한 CAT 활성도 회복 효과는 보이지 않았다. 또 한편, CAT 활성도 측정 경우와 마찬가지로 4일 된 자엽에 12 시간 PA 전처리 후 PQ 를 처리하여 GPX 활성도 변화를 24시간 동안 조사하였다(Fig. 5). 그 결과 PQ 를 처리하지 않은 대조구 자엽에서는 GPX 활성도가 약간 증가하는 경향을 보이긴 하나 24시간 동안 거의 비슷한 수준이었으며 반면에 PQ 단독처리구 자엽에서는 PQ 처리 6 시간째부터 현저히 감소하여 24시간 때까지 계속 낮은 활성도( 대조구의 55% 수준)를보였다.
- 무 유식물의 자엽에 산화스트레스를 유도하기 위해 50 uM 농도의 PQ 를 24시간 이상 처리한 결과 심각한 자엽 손상이 일어났다 그러므로 생리적으로 의미있는 조건하에서 식물의 반응을 평가하기 위해 자엽의 최대 PQ 노출 시간을 24 시간으로 결정하였다
- 그러나 모든 PA 전처리로 PQ 에 의한 엽록소 함량 감소가 억제되었으며 또한 PA 처리구 사이에서의 감소 억제 효과 경향은 생체량의 경우처럼 큰 차이를 보이지는 않았지만 그 중에서 Spd 처리구가 엽록소 감소를 보다 더 효과적으로 지연시켰다. 엽록소 함량 변화와 함께 잎의 산화적 손상을 나타내는 또 다른 생화학적 지표인 단백질 함량 변화도 조사하였다 (Fig. 2C). 24시간 PQ 단독 처리구에서 단백질 함량 역시 현저히 감소되어 대조구의 67% 수준을 나타내었다.
- 5 cm) 에 증류수 120 mL 를 가해 충분히 적신 후 이 용기 1 개당 25개씩의 살균된 종자를 파종하고 투명한 wrap 을 씌웠다. 이 발아용기를 75% 상대습도, 24/20^ (나밤)의 온도 및 8, 000 lux 빛 세기로 16 h / 8 h (낮/밤)의 광주기 조건을 갖는 growth chamber 내에 넣고 발아, 생육시켰다. 파종 후 2일째 wrap 을 벗기고 3 일째에 30 mL 증류수를 추가로 공급하였다.
- 생리, 생화학적 역할을 규명하고자 하였다. 이를 위해 세포 내 산소 분자를 환원하여 superoxide 라디칼과 H2O2 분자를 만들어 냄으로서 세포에 산화적 손상을 발생시켜 산화스트레스 유도인 자로 잘 알려진 제초제 PQ (Martinez et al. 2001)로 처리된 무 (Raphanus sativus L.) 유식물 자엽에서 PQ에 의해 유도된 산화적손상과 H2O2 분해 효소로 작용하는 catalase 와 guaiacol peroxidase 의총 활성도 변화 및 그 들 동위효소 조성의 생화학적 변화에 대한 여러 종류의 폴리아민 (putrescine, spermidine, spermine) 효과를 조사하였고 이들 폴리아민의 종류에 따른 방어 효과를 평가하였다.
- 5, 2 mM benzidine 포함)에 10 분 동안 배양 한 후 다시 이 용액에 30% H2O2 용액 30 uL을 첨가하고 20 분간 진탕 배양시켰다. 이후 gel 을 증류수로 짧게 세척하여 효소 반응을 중지시키고 사진 촬영을 하였다.
- 특히 PQ 처리 24시간 후, 1 mM Spd 처리구에서 생체량 감소가 가장 크게 억제되어 대조구의 80% 수준까지 회복되 었고 다음으로 1 mM Spm 처 리구이 었으며 1 mM Put 처리구에서 생체량 감소 억제 효과가 가장 적게 나타났다. 자엽에서 또 다른 PQ 손상으로 자엽 조직에 검은 반점이 나타나는 괴사 (necrosis) 현상이 출현해서 엽록소 함량 변화를 추적 조사하였다 (Fig. 2B). PQ 단독 처리구에서는 처리 24시간 후에 비록 생체량 감소 (Fig.
- 파종 후 4 일된 무 유식물을 각 그룹 별로 나누어 이들 유식 물의 자엽에 0.1% Tween 20이 포함된 10-5M에서 10-3M 농도 범위의 putrescine (Put), spermidine (Spd) 및 spermine (Spm) 용액을 각각 spray (1 mL/ plant) 한 후 12 시간 배양하였다. 12 시간 각각의 PA 로 전처리된 자엽에 다시 50 uM PQ (0.
- CAT 총활성도는 Chance 와 Maehly (1955)의 방법을 기초로 하여 측정하였다. 효소 활성도는 H2O2 기질의 분해에기인되는 240 nm 의 흡광도 (ε240 = 39.4 M-1・ cm-1) 감소 값을 측정하여 산출하였다. 이 때의 효소 반응은 2.
- GPX 활성도는 Polle 등 (1994)의 방법을 기초로 하여 측정하였다. 효소 활성도는 반응액 내에서 guaiacol 기질이 tetraguaiac이로 산화될 때 470 nm 에서의 흡광도 @470 = 25.2 mM-1・cm-1) 증가 값을 측정하여 산출하였다. 이때 효소 반응은 2.
대상 데이터
- 크기, 모양 색깔이 균일한 무 (Raphanus sativus L. cv. Taewang) 종자를 선별하여 1% sodium hypochlorite 용액에 15 분간 표면 살균시킨 후 증류수로 충분히 세척하였다. Ball 상토 No.
이론/모형
- 3 g 의 sea sand 와 함께 넣고 마쇄한 후 4C 에서 원심분리 (20, 000g, 20 min)하여 얻은 상등액을 사용하였다. CAT isozyme 분리는 Kunce 와 Trelease (1986)방법을 기초로 하여 수행하였다. 7% polyacrylamide gel 및 4% stacking gel을 이용하여 4C 온도 조건과 일정전압 (stacking gel: 50V, seperating gel: 100V) 하에서 8 시간 동안 Native-PAGE 롤 실시하였다.
- 3 g의 sea sand와 함께 넣고 마쇄한 후 4℃ 에서 원심분리 (20, 000g, 20 min) 하여 얻은 상등액을 효소원으로 사용하였다. CAT 총활성도는 Chance 와 Maehly (1955)의 방법을 기초로 하여 측정하였다. 효소 활성도는 H2O2 기질의 분해에기인되는 240 nm 의 흡광도 (ε240 = 39.
- 1 mL의 효소 추출액이 포함된 3 mL의 반응액 내에서 진행시켰다. GPX 활성도는 Polle 등 (1994)의 방법을 기초로 하여 측정하였다. 효소 활성도는 반응액 내에서 guaiacol 기질이 tetraguaiac이로 산화될 때 470 nm 에서의 흡광도 @470 = 25.
- 5, 1% PVPP 포함) 로 마쇄 후 이 마쇄물을 4℃ 에서 원심분리 (20, 000g, 20 min) 하여 단백질 추출액을 얻었다. 이 추출액 0.1 mL 에 증류수 0.9 mL 를 섞어 1 mL 로 만든 후 동부피의 15% TCA를 가하고 1시간 냉장 보관 후 재원심분리 (1,000g, 10 min) 하여 얻은 단백질 침전물을 0.1 N NaOH 용액으로 녹인 후 Lowry (1951)의 방법으로 정량하였다.
- 자엽의 H2O2 함량은 Bernt and Bergmeyer (1974)의 효소적 방법을 기초로 하여 측정하였다. 자엽 10 쌍을 냉각된 mortar 와 pestle 을이 용해서 2.
- 취하여 생체량 변화를 측정하였다. 자엽의 엽록소 정량은 5쌍의 자엽을 냉각된 mortar 와 pestle 을 이용해서 80% aceton (0.1% , w/v, CaCO3 포함)으로 추출 후 원심분리 (1,000g, 10 min) 하여 얻은 상등액의 흡광도 A/와 A663 값을 이용하여 Arnon (1949)의 방정식으로 산출하였다. 단백질 정량은 10 쌍의 자엽을 냉각된 mortar 와 pestle 을 이용해서 0.
- 이때 loading 시료는 80 uL 부피 내에 동량의 자엽단백질 (200 ug)이 포함되도록 하였다. 전기영동 후 GPX isozyme 활성도 검출은 Rao 등 (1996)의 방법을 사용하였다. 즉 전기 영동 후 gel을 50 mM sodium acetate buffer (pH 4.
성능/효과
- 수행한 결과는 Figure 6과 같다. 12 시간 PA 전처리 후 24 시간 PQ 에 노출된 자엽과 아무런 처리를 받지 않은 대조구 자엽에서 CAT 동위효소 조성의 변화에 대한 결과에 의하면 (Figure 6), 대조구 자엽을 포함한 모든 처리구 자엽에서 2개의 CAT 동위효소 (CAT1 와 CAT2, 전기영동거리의 증가 순서 기준) 밴드가 분리되었다. CAT1 경우, 이 밴드의 activity staining 강도가 대조구에 비해 PQ 단독처리구에서 뚜렷이 감소되었다 그러나 PA 전처리구 (12 시간 PA 전처리 후 24시간 PQ에 노출된 자엽)중에서 Put와 Spm 전처리구를 제외한 Spd 전처리구에서만 다시 대조구 수준 이상으로 회복되었다.
- 2C). 24시간 PQ 단독 처리구에서 단백질 함량 역시 현저히 감소되어 대조구의 67% 수준을 나타내었다. 그러나 Spd 처리 구에서 단백질 함량 감소가 가장 크게 억제되어 대조구의 83% 수준으로 회복되었고 다음으로 Spm 처리구 순으로 단백질 함량 감소가 지연되었다.
- PA 의 효과는 Figure 3에 나타낸 바와 같다. 24시간 동안 PQ 단독 처리된 자엽에서는 처리되지 않은 대조구 자엽(0.163 ug/cot. pair )에 비해 2.6 배 많은 H2O2 함량(0.422 ug/cot. pair) 을 보였으나 PA로 전처리 후 PQ 에 노출시켰을 때 모든 PA 전처리구에서 H2O2 의 함량이 다시 감소되었다. 이때 H2O2 축적에 대한 PA 의 억제 효과는 Spd 전처리구에서 가장 높아 거의 대조구와 유사한 수준 정도로 낮았으며, 비록 Spd의 억제 효과보다는 적었지만 Put 처리구와 Spm 처리구 에서도 의미 있게 H2O2 축적을 억제하여 PQ 단독 처리 구보다 낮은 수준의 H2O2 함량을 보였다.
- 50 |1M PQ 로 처리된 무 유식물에서 최초로 나타나는 가시적인 PQ 작용의 결과는 자엽의 시듦 현상이었다. 그러므로 PQ 손상의 지표로서 PQ 처리 24시간 후 자엽의 생체량 변화를 먼저 분석하여 Fig.
- 반면에 Put 와 Spm 처리에 의한 CAT 활성도 회복 효과는 보이지 않았다. GPX 의 경우에도 PQ 단독처리 구자엽에서는 PQ 처리 6 시간째부터 현저히 감소하여 24시간 때까지 계속 낮은 활성도( 대조구의 55% 수준)를 보였으나, PA 전처리에 의해서 다시 회복되었으며 특히 Spd 전처리에 의한 회복 효과는 PQ에 노출된 6 시간째부터 나타나서 24 시간째에는 대조구의 90% 이상의 수준으로 크게 회복되었다 (Fig. 5). 또한 Spm 전 처리 구에서도 Spd 전처리구보다는 적었지만 의미 있게 회복시켰다.
- 2(A)에 나타내었다. PQ 단독 처리구에서는 24시간 경과 후, 생체량이 급속히 감소하여 0.1% Tween 20 대조구의 약 30% 수준을 보였다. 그러나 PQ 에 의해 유도된 급격한 생체량 감소가 모든 PA 전처리구에서 억제되었다.
- 4와 같다. PQ 에 노출된 무 유식물 자엽에서 PA 전처리에 따른 CAT 활성도 변화를 24시간 동안 조사한 결과, PQ 단독처리구는 PQ 를 처리하지 않은 대조구와 비교 시 12 시간까지는 별다른 차이가 없었으나 24 시간째에 약 14%의 활성도 감소가 나타났다(Fig. 4). 그러나 PQ 처리에 의해 감소된 CAT 활성도가 PA 중에서 특히 Spd 전처리로 다시 회복되어 24 시간째에는 대조 구보다도 높게 나타났다.
- 그리고 PQ 에 노출된 자엽에서 Spd 가 가장 효율적으로 CAT 와 GPX 의 활성도 회복을 유도하였으며 그로인한 H2O2 의 축적 억제를 통해서 PQ 독성에 대한 방어 효과를 보이는 것으로 생각되었다. Spd 에 의한 이들 CAT 와 GPX 총활성도 증가에는 각각 CAT1 그리고 GPX1 및 새로 합성된 GPX 동위효소가 주도적인 기여를 하고 있음을 알 수 있었다.
- 1% Tween 20 단독처리구) 수준까지 회복되었다. 가장 방어 효과가 현저한 10-3 M 농도에서 PA 종류별로 그 효과를 비교하여 볼 때, Spd, Spm, 및 Put 순으로 방어 효과가 나타났다. 따라서 이 후의 실험에서는 PQ 독성에 대한 방어 효과가 가장 높은 10-3 M (1 mM) 농도를 모든 PA 처리 농도로 사용하였다.
- 결론적으로 무 자엽에서 PA 전처리는 PQ에 의해 유도되는 산화적 손상에 대한 내성을 의미 있게 증진시켰으며 이때 PA 중에서 Spd 의 내성 증진 효과가 가장 높았다. 그리고 PQ 에 노출된 자엽에서 Spd 가 가장 효율적으로 CAT 와 GPX 의 활성도 회복을 유도하였으며 그로인한 H2O2 의 축적 억제를 통해서 PQ 독성에 대한 방어 효과를 보이는 것으로 생각되었다.
- 5). 그 결과 PQ 를 처리하지 않은 대조구 자엽에서는 GPX 활성도가 약간 증가하는 경향을 보이긴 하나 24시간 동안 거의 비슷한 수준이었으며 반면에 PQ 단독처리구 자엽에서는 PQ 처리 6 시간째부터 현저히 감소하여 24시간 때까지 계속 낮은 활성도( 대조구의 55% 수준)를보였다. 그러나 PQ 에 의해 감소된 GPX 활성도는 PA 전처리에 의해서 다시 회복되었으며 특히 Spd 전처리에 의한 회복 효과는 PQ 에 노출된 6 시간째부터 나타나서 24 시간째에는 대조구의 90% 이상의 수준으로 크게 회복되었다.
- 그 결과 PQ 를 처리하지 않은 대조구 자엽에서는 GPX 활성도가 약간 증가하는 경향을 보이긴 하나 24시간 동안 거의 비슷한 수준이었으며 반면에 PQ 단독처리구 자엽에서는 PQ 처리 6 시간째부터 현저히 감소하여 24시간 때까지 계속 낮은 활성도( 대조구의 55% 수준)를보였다. 그러나 PQ 에 의해 감소된 GPX 활성도는 PA 전처리에 의해서 다시 회복되었으며 특히 Spd 전처리에 의한 회복 효과는 PQ 에 노출된 6 시간째부터 나타나서 24 시간째에는 대조구의 90% 이상의 수준으로 크게 회복되었다. Spm 전처리구에서도 Spd 전처리 구보다는 적었지만 PQ 에 의한 활성도 감소를 의미 있게 회복시켰다 반면에 Put 전처리구에서 회복 효과가 가장 작게 나타났다.
- 4). 그러나 PQ 처리에 의해 감소된 CAT 활성도가 PA 중에서 특히 Spd 전처리로 다시 회복되어 24 시간째에는 대조 구보다도 높게 나타났다. 반면에 Put 와 Spm 처리에 의한 CAT 활성도 회복 효과는 보이지 않았다.
- 24시간 PQ 단독 처리구에서 단백질 함량 역시 현저히 감소되어 대조구의 67% 수준을 나타내었다. 그러나 Spd 처리 구에서 단백질 함량 감소가 가장 크게 억제되어 대조구의 83% 수준으로 회복되었고 다음으로 Spm 처리구 순으로 단백질 함량 감소가 지연되었다.
- 2A) 경우처럼 급격하지는 않았지만 엽록소 함량이 대조구에 비해 약 24% 감소하였다. 그러나 모든 PA 전처리로 PQ 에 의한 엽록소 함량 감소가 억제되었으며 또한 PA 처리구 사이에서의 감소 억제 효과 경향은 생체량의 경우처럼 큰 차이를 보이지는 않았지만 그 중에서 Spd 처리구가 엽록소 감소를 보다 더 효과적으로 지연시켰다. 엽록소 함량 변화와 함께 잎의 산화적 손상을 나타내는 또 다른 생화학적 지표인 단백질 함량 변화도 조사하였다 (Fig.
- 또한, GPX2 밴드의 staining 강도는 대조구를 포함한 모든 처리구에서 별다른 차이를 나타내지 않았다. 그러나 한가지 흥미로운 사실은 모든 PA 전처리구에서 대조구에는 없었 던 새로운 GPX 동위효소 밴드 한개( ◄ 표시)가 출현하였으며 이 밴드의 activity staining 강도 역시 Spd 처리구에서 가장 컸으며 그 다음으로 Spm, Put 처리구 순으로 나타났다. 이들 결과는, 24시간 PQ에 노출된 자엽에서 특히 Spd 전처리에 의한 GPX 총활성도 회복이 새로 생성된 GPX 동위효소와 더불어 GPX1 동위효소의 발현증가에 기인하고 있음을 나타내는 것이다.
- Spd 의 내성 증진 효과가 가장 높았다. 그리고 PQ 에 노출된 자엽에서 Spd 가 가장 효율적으로 CAT 와 GPX 의 활성도 회복을 유도하였으며 그로인한 H2O2 의 축적 억제를 통해서 PQ 독성에 대한 방어 효과를 보이는 것으로 생각되었다. Spd 에 의한 이들 CAT 와 GPX 총활성도 증가에는 각각 CAT1 그리고 GPX1 및 새로 합성된 GPX 동위효소가 주도적인 기여를 하고 있음을 알 수 있었다.
- 7), 대조구에 있던 GPX1 밴드가 PQ 단독 처리구에서 완전히 사라졌으나 PA 전처리구 가운데 Spd 전처리구에서 다시 뚜렸이 회복되었다. 더욱 흥미로운 사실은 대조구에는 없었던 새로운 GPX 동위효소 밴드 한 개 (◄ 표시)가 모든 PA 전처리구에서 출현하였으며 이 밴드의 activity staining 강도 역시 Spd 처리구에서 가장 컸으며 그다음으로 Spm, Put 처리구 순으로 나타났다. 이들 결과는 24시간 PQ 에 노출된 자엽에서 Spd 전처리에 의한 GPX 총활성도 회복이 새로 생성된 GPX 동위효소와 더불어 GPX1 동위효소의 활성도 증가에 밀접한 관련이 있음을 의미하는 것이다.
- 3) 이들 결과는 자엽에서 명백히 PQ 스트레스에 기인한 산화적 손상임을 입증하는 것이다. 동시에 방어 효과의 크기는 비록 다르지만 이들 PQ 손상이 1 mM PA 전처리로 완화됨 (즉, 1 mM Spd 가 가장 높고, 다음으로 1 mM Spm, 1 mM Put 순서)을 보였다 (Fig. 2A-C, 3). Zheleva 등(1994)도 완두 식물에서 제초제 atrazine 에의한 생물량 감소 및 엽록소 소실 현상이 PA 전처리로 반전된 결과를 입증하였는데, 이때 Put 보다는 Spd 와 Spm 에서 높은 방어 효과를 얻어 본 실험과 유사한 결과를 제시한 바 있다.
- Put 전처리구에서는 회복 효과가 가장 작게 나타났다. 따라서 무 자엽에서 PQ 손상에 대한 PA 의 종류별 방어 효과 크기는 이들 PA 에의한 CAT 와 GPX 활성도 회복에 의존하고 있음을 알 수 있었다.
- 모든 PA 처리구에서 PQ 단독처리구보다 생체량 감소가 억제되는 PQ 독성 방어 효과가 나타났으며 이때 또한 PA 처리농도 및 종류에 따라 그 효과가 다르게 나타났다 (Fig. 1). 이 결과에 따르면 모든 PA 처리구에서 10-4 M 농도까지는 PQ 독성에 대한 방어 효과가 약하게 나타났으나 10-3 M 농도에서는 Put 처리구를 제외하고 높게 나타났다 특히 Spd 처리구에서는 생체량이 거의 대조구 (0.
- 본 실험에서 PQ 처리로 인한 자엽의 현저한 시듦 현상과 생체량 감소( Fig. 2A) 그리고 뚜렷한 엽록소 및 단백질 함량의 소실이 일어났다(Fig. 2B and C). 또한 많은 H2O2 의 축적 현상도 나타났는데 (Fig.
- 1996). 본 실험에서는 3개의 동위효소 (GPX1, GPX2 및 GPX3) 밴드가 분리되었는데 (Fig. 7), 대조구에 있던 GPX1 밴드가 PQ 단독 처리구에서 완전히 사라졌으나 PA 전처리구 가운데 Spd 전처리구에서 다시 뚜렸이 회복되었다. 더욱 흥미로운 사실은 대조구에는 없었던 새로운 GPX 동위효소 밴드 한 개 (◄ 표시)가 모든 PA 전처리구에서 출현하였으며 이 밴드의 activity staining 강도 역시 Spd 처리구에서 가장 컸으며 그다음으로 Spm, Put 처리구 순으로 나타났다.
- 일반적으로, 다양한 산화스트레스에 대한식물의 저항성 발현은 스트레스에 의해 축적되는 superoxide 라디칼 H2O2 등과 같은 활성산소 라디칼을 제거할 수 있는 능력과 관련이 있다고 제안되어 왔다 그러므로, 무 자엽에서 PQ 스트레스에 대한 PA 의 방어 효과를 PA 의 항산화 성질과 관련하여 조사하였다 Figure 3의 결과에 의하면 24시간 PQ 에 노출된 자엽에서 H2O2 의축적이 PA 전처리로 (특히 Spd 전처리)로 크게 억제되었는데, 이 H2O2 는 매우 산화력이 강한 singlet 산소 분자와 hydroxyl 라디칼. 의형성을 초래하며 이들은 세포 지질분자의 과산화 (lipid peroxidation) 반응을 유도한다는 점에서 볼 때 본 연구 결과는 명백히 PA 가 PQ 스트레스를 받고 있는 무 자엽에서 효과적인 항산화제로서의 역할을 수행 할 수 있음을 보여주는 것이다. PA 의 항산화능과 관련하여 Velikova 등(2000)은 PA가 세포 내 항산화효소로 구성된 세포 항산화 대사 능력을 증진시킴으로서 스트레스에 대한 내성을 증진시킨다고 제안한 바 있다.
- 1). 이 결과에 따르면 모든 PA 처리구에서 10-4 M 농도까지는 PQ 독성에 대한 방어 효과가 약하게 나타났으나 10-3 M 농도에서는 Put 처리구를 제외하고 높게 나타났다 특히 Spd 처리구에서는 생체량이 거의 대조구 (0.1% Tween 20 단독처리구) 수준까지 회복되었다. 가장 방어 효과가 현저한 10-3 M 농도에서 PA 종류별로 그 효과를 비교하여 볼 때, Spd, Spm, 및 Put 순으로 방어 효과가 나타났다.
- 더욱 흥미로운 사실은 대조구에는 없었던 새로운 GPX 동위효소 밴드 한 개 (◄ 표시)가 모든 PA 전처리구에서 출현하였으며 이 밴드의 activity staining 강도 역시 Spd 처리구에서 가장 컸으며 그다음으로 Spm, Put 처리구 순으로 나타났다. 이들 결과는 24시간 PQ 에 노출된 자엽에서 Spd 전처리에 의한 GPX 총활성도 회복이 새로 생성된 GPX 동위효소와 더불어 GPX1 동위효소의 활성도 증가에 밀접한 관련이 있음을 의미하는 것이다. Rao 등 (1996)도 flavonoid 결핍 돌연변이 애기장대를 UV-B 에 노출시켰을때 새로운 GPX 동위효소가 합성되는 것을 입증한 바 있다.
- 그러나 한가지 흥미로운 사실은 모든 PA 전처리구에서 대조구에는 없었 던 새로운 GPX 동위효소 밴드 한개( ◄ 표시)가 출현하였으며 이 밴드의 activity staining 강도 역시 Spd 처리구에서 가장 컸으며 그 다음으로 Spm, Put 처리구 순으로 나타났다. 이들 결과는, 24시간 PQ에 노출된 자엽에서 특히 Spd 전처리에 의한 GPX 총활성도 회복이 새로 생성된 GPX 동위효소와 더불어 GPX1 동위효소의 발현증가에 기인하고 있음을 나타내는 것이다.
- pair) 을 보였으나 PA로 전처리 후 PQ 에 노출시켰을 때 모든 PA 전처리구에서 H2O2 의 함량이 다시 감소되었다. 이때 H2O2 축적에 대한 PA 의 억제 효과는 Spd 전처리구에서 가장 높아 거의 대조구와 유사한 수준 정도로 낮았으며, 비록 Spd의 억제 효과보다는 적었지만 Put 처리구와 Spm 처리구 에서도 의미 있게 H2O2 축적을 억제하여 PQ 단독 처리 구보다 낮은 수준의 H2O2 함량을 보였다.
- 그러나 PQ 에 의해 유도된 급격한 생체량 감소가 모든 PA 전처리구에서 억제되었다. 특히 PQ 처리 24시간 후, 1 mM Spd 처리구에서 생체량 감소가 가장 크게 억제되어 대조구의 80% 수준까지 회복되 었고 다음으로 1 mM Spm 처 리구이 었으며 1 mM Put 처리구에서 생체량 감소 억제 효과가 가장 적게 나타났다. 자엽에서 또 다른 PQ 손상으로 자엽 조직에 검은 반점이 나타나는 괴사 (necrosis) 현상이 출현해서 엽록소 함량 변화를 추적 조사하였다 (Fig.
후속연구
- Anderson 등 (1995)은 저온 스트레스에 노출된 옥수수 중배축에서 이 식물 조직이 저온에 순화하는 동안 미토콘드리아 catalase 의 특정 동위효소의 활성도 증가가 유도되어 세포 내 H2O2 함량 증가를 억제한다는 보고를 하였다. 그러나 Chandlee 등(1983)은 제초제 aminotriazole 에대한 내성 발현 연구에서 미토콘드리아 내의 CAT 동위효소 (CAT3) 보다 peroxisome 내의 동위효소 (CAT1, CAT2) 가 더 주도적인 역할을 한다고 보고한 바 있어, 스트레스 방어반응에서 polyamine (PA) 의 정확한 역할을 규명하기 위한 추후 연구에서는 본 실험에서 분리된 CAT1, CAT2 동위효소의 세포 내 localization 및 효소적 특성에 대한 추가적인 조사가 요구된다.
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