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문제 정의
- 능동적 세포사멸인 apopto- sis의 특징은 세포수축, DNA 분절, caspase의 활성화 등의 현상이 관찰되고, 수동적 세포사멸인 necrosis는 세포질의 팽창, 세포파편, 염증유발 등의 현상이 관찰된다(33). Fig. 5에서 보이는 바와 같이 두 종의 암세포에서 모두 세포 밀도의 감소와 함께 일부 세포에서 관찰되는 세포수축 등의 형태적 변화 현상이 apoptosis 유발에 의한 현상인지 검증하고자 하였다.
- 본 연구결과에서 나타난 천일염으로 제조된 된장 추출물의 암세포 성장억제 작용이 세포사멸에 의한 작용인지 확인하고자 하였다. 세포사멸은 necrosis와 apoptosis라는 두 가지 다른 기전에 의해 일어난다.
- 세균형 코지를 사용하여 제조한 된장은 제조기간 단축(2개월 이내)과 더불어 고유한 재래된장의 맛과 향을 재현할 수 있음을 보고하였다. 본 연구에서는 된장 발효에서 소금이 그 품질에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 이에 본 연구팀이 개발하여 보고(26)한 바 있는 세균형코지를 사용한 새로운 된장제조방법을 사용하여, 된장 제조의 모든 조건(원료, 발효미생물, 발효조건 등)을 동일하게 하여 주고, 이에 사용되는 소금만을 정제염과 천일염을 각각 달리 사용하여 소금에 따른 차이가 된장에 어떠한 영향을 미칠 수 있는지 조사하였다.
- 본 연구팀은 재래식 된장과 개량식 된장의 단점을 보완하여 세균형 코지를 사용한 새로운 된장 제조방법을 개발하여보고 한 바 있다(26, 27). 세균형 코지를 사용하여 제조한 된장은 제조기간 단축(2개월 이내)과 더불어 고유한 재래된장의 맛과 향을 재현할 수 있음을 보고하였다.
- 본 연구에서는 된장 발효에서 소금이 그 품질에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 이에 본 연구팀이 개발하여 보고(26)한 바 있는 세균형코지를 사용한 새로운 된장제조방법을 사용하여, 된장 제조의 모든 조건(원료, 발효미생물, 발효조건 등)을 동일하게 하여 주고, 이에 사용되는 소금만을 정제염과 천일염을 각각 달리 사용하여 소금에 따른 차이가 된장에 어떠한 영향을 미칠 수 있는지 조사하였다. 즉, 천일염 첨가 된장과 정제염 첨가 된장이 소금의 종류(정제염, 천일염)와 발효 기간(2개월, 16개월)에 따라 인체 정상세포 (BJ) 에 미치는 세포 독성 및 인체 위암세포 (AGS) 와 인체 대장암세포 (HT-29) 의 성장억제 효과를 조사함으로써 된장제조 시 사용되는 소금과 발효 기간이 된장의 기능성(암세포 증식 억제효과, in w 行。)에미치는 영향을 규명하고자 하였다.
- 이에 본 연구팀이 개발하여 보고(26)한 바 있는 세균형코지를 사용한 새로운 된장제조방법을 사용하여, 된장 제조의 모든 조건(원료, 발효미생물, 발효조건 등)을 동일하게 하여 주고, 이에 사용되는 소금만을 정제염과 천일염을 각각 달리 사용하여 소금에 따른 차이가 된장에 어떠한 영향을 미칠 수 있는지 조사하였다. 즉, 천일염 첨가 된장과 정제염 첨가 된장이 소금의 종류(정제염, 천일염)와 발효 기간(2개월, 16개월)에 따라 인체 정상세포 (BJ) 에 미치는 세포 독성 및 인체 위암세포 (AGS) 와 인체 대장암세포 (HT-29) 의 성장억제 효과를 조사함으로써 된장제조 시 사용되는 소금과 발효 기간이 된장의 기능성(암세포 증식 억제효과, in w 行。)에미치는 영향을 규명하고자 하였다.
- 천일염과 정제염을 사용하여 제조한 된장의 세포성장 억제 효과를 알아보기 위하여 2개월 숙성된 된장을 시료로 하여 MTT assay를 실시하였다. 대조구로는 정상세포 BJ를 사용하였으며 이를 DMEM 에서 배양하고 위암세포 AGS 와대 장암 세포 HT-29는 RPMI 1640 배지에서 48시간 동안 생육시킨 후 이때의 생존율을 100%로 표시하였다.
제안 방법
- 48시간 배양하였다. Apoptosis 유발 여부를 확인하기 위해 세포에 CaspACE FITC-VAD-FMK kit(Promega, Madison, USA)을 최종 10 uM 농도로 첨가하여 37oC, 5% CO2배양기에서 30분간 염색하였다. 염색 후 세포를 PBS로 3회 수세한 후 caspase-3 activation을 fluorescence microscope ( x 200)(Eclipse TS100-F, Nikon, Tokyo, Japan)을이용하여 관찰하였다.
- Fig. 1~4의 실험결과에서, 두 종류의 암세포에 대하여 세포 생육억제활성이 가장 높게 나타난 천일염된장의 물 추출물(1 mg/mL) 을 처리하여 각 세포의 형태 변화를 살펴보았다. 위상차 현미경을 이용하여 16개월 숙성 천일염 된장의물 추출물을 각 세포에 1.
- 인체 위암세포(AGS)와 인체결장암 세포(HT-29)는 Roswell Park Memorial Institute medium(RPMI 1640; Gibco BRL, Carlsbad, USA)으로 배 양하고, 대조군으로 사용한 인체 포낭 정상세포주(BJ)는 Dul- becco/Vogt Modified Eagle's Minimal Essential Medium (DMEM; Gibco BRL)으로 배양하였다. 각각의 배지에는 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco BRL)과 100 ug/mL penicillin(Gibco BRL) 그리고 100 ug/mL streptomycin (Gibco BRL)을 첨가하였다. 배양된 각각의 세포는 일주일에 2~3회 신선한 새 배지로 갈아주고 6~7일 만에 phosphate buffered saline(PBS)로 세척한 후 0.
- MTT assay를 실시하였다. 대조구로는 정상세포 BJ를 사용하였으며 이를 DMEM 에서 배양하고 위암세포 AGS 와대 장암 세포 HT-29는 RPMI 1640 배지에서 48시간 동안 생육시킨 후 이때의 생존율을 100%로 표시하였다. 실험구는 2개월 숙성된 된장을 물과 메탄올로 각각 추출한 시료를 48 시간 동안 농도별로 처리한 후 배양세포의 생존율을 대조 구에 대한 상대적 생존율(%)로 표시하였다.
- 된장제조 시 사용되는 소금의 종류(천일염, 정제염)를 달리하여 제조한 된장을 각각 2개월, 16개월 동안 숙성시켜 소금의 종류 및 발효기간에 따른 된장의 항암활성을 조사하였다. 소금의 종류를 달리한 2개월 숙성 된장의 물 추출물과 메탄올 추출물은 모두 정상세포 BJ 에 대해 세포독성을 보이지 않고 오히려 세포성장효과를 지니는 반면 2종의 암세포에 대해서는 높은 성장억제효과를 나타내었다.
- subtilis DJI을 가수하기 전 원료콩의 1%(v/w) 비율로 접종하였으며, 접종 후 37oC incubator(SW-90S, Sangwoo, Bucheon, Korea)에서 12~14시간 배양하였다. 배양 종료 후 항온항습 장치 (HB-105SP, Hanbaek, Bucheon, Korea)를 이용해서 24 시간 동안 20oC, 30% 습도를 유지하면서 풍건시켜 이를 세균 형 코지로 사용하였다.
- 균은 37oC에서 24시간 전 배 양하여 LB 액 체배 지 ①uchefa bio- chemie, bacto-tryptone 10%, yeast-extract 5%, sodium chloride 10%)에 1%(v/v) 접종한 후, 9시간 배 양한 것으로 준비하였다. 배양된 B. subtilis DJIe 원심분리(9, 950xg, 15 min, 4oC)하여 균체를 회수하고 회수된 균체를 멸균된 3차 증류수로 2회 수세한 후 배양액과 동량의 멸균 증류수에 풀어 B. subtilis DJI 균체 현탁액을 준비하였다. 콩은 국내 에서 생산되는 소립종을 사용하였고, 정선된 원료콩 1 kg을 수세, 침지 후 고압 멸균기(1.
- 각각의 배지에는 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco BRL)과 100 ug/mL penicillin(Gibco BRL) 그리고 100 ug/mL streptomycin (Gibco BRL)을 첨가하였다. 배양된 각각의 세포는 일주일에 2~3회 신선한 새 배지로 갈아주고 6~7일 만에 phosphate buffered saline(PBS)로 세척한 후 0.05% trypsin-0.02% EDTA 로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 세포에 배지를 넣고 피펫으로 세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합한 다음 6~7일마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 계대 배양 시 각각의 passage number를 기록하였고 passage number가 10회 이상일 때는 새로운 세포를 액체질소 탱크로부터 꺼내어 다시 배양하여 실험하였다.
- 방법에 따라 제조하였다. 소금은 천일염(94% NaCl, Shinan-Docho, Korea), 정제염(99% NaCl Chunil salt, Seoul, Korea)을 각각 사용하여 상기 방법으로 제조된 세균 형 코지에 삶은 콩(원료콩을 기준)을 1:1 비율로 가하였다. 최종 소금의 농도는 12%(w/w) 가 되도록 정량된 소금을 종수에 녹여 삶은 콩, 코지와 함께 섞었다.
- 시료로 사용된 된장은 동결건조 후 마쇄하고 시료의 20배 (w/v) 물과 메탄올을 각각 첨가하여 12시간 동안 교반하고 이를 3회 반복한 후 여과(Whatman paper no. 2)한 후 rotary vacuum evaporator로 감압농축 하여 각각의 물 추출물, 메탄올 추출물을 얻었다. 준비된 각각의 메탄올과 물 추출물은 최종 농도가 0.
- 대조구로는 정상세포 BJ를 사용하였으며 이를 DMEM 에서 배양하고 위암세포 AGS 와대 장암 세포 HT-29는 RPMI 1640 배지에서 48시간 동안 생육시킨 후 이때의 생존율을 100%로 표시하였다. 실험구는 2개월 숙성된 된장을 물과 메탄올로 각각 추출한 시료를 48 시간 동안 농도별로 처리한 후 배양세포의 생존율을 대조 구에 대한 상대적 생존율(%)로 표시하였다.
- Apoptosis 유발 여부를 확인하기 위해 세포에 CaspACE FITC-VAD-FMK kit(Promega, Madison, USA)을 최종 10 uM 농도로 첨가하여 37oC, 5% CO2배양기에서 30분간 염색하였다. 염색 후 세포를 PBS로 3회 수세한 후 caspase-3 activation을 fluorescence microscope ( x 200)(Eclipse TS100-F, Nikon, Tokyo, Japan)을이용하여 관찰하였다.
- 상징 액을 70% ethanol 25 mL로 2회 반복 추출하고 추출액을 합하여 rotary vacuum evaporator(N- 1000SW, Eyela, Nasa, Japan)로 감압농축 하였다. 이 농축물을 0.02 N HCl 20 mL에 녹이고 10배 희석하여 0.45 ym syringe filter(Minisart, Sartorius, Goettingen, Germany)로 여과한 후 아미노산 자동분석기 (L-8800, Hitach, Tokyo, Japan)에 주입하여 분석하였다.
- 제조된 된장은 숙성 2개월, 숙성 16개월 후에 그 성분을 분석하였다(Table 1). 2개월 숙성 시 천일염과 정제염을 첨가하여 제조한 각 된장의 수분함량은 각각 50.
- 2)한 후 rotary vacuum evaporator로 감압농축 하여 각각의 물 추출물, 메탄올 추출물을 얻었다. 준비된 각각의 메탄올과 물 추출물은 최종 농도가 0.005, 0.050, 0.500, 1.000 mg/mL가 되도록 각각 첨가하여 세포실험에 사용하였다.
- 5 kg/cm2)에서 40분 동안 증자하였다. 증자된 콩은 냉각시킨 후 미리 준비해둔 B. subtilis DJI을 가수하기 전 원료콩의 1%(v/w) 비율로 접종하였으며, 접종 후 37oC incubator(SW-90S, Sangwoo, Bucheon, Korea)에서 12~14시간 배양하였다. 배양 종료 후 항온항습 장치 (HB-105SP, Hanbaek, Bucheon, Korea)를 이용해서 24 시간 동안 20oC, 30% 습도를 유지하면서 풍건시켜 이를 세균 형 코지로 사용하였다.
- 천일염된장과 정제염된장을 16개월 숙성시킨 후 물 (Fig. 3)과 메탄올(Fig. 4)로 추출한 시료를 정상세포 BJ에 대한 세포독성과 AGS, HT-29의 암세포주에 대한 증식억제 효과를 관찰하였다.
대상 데이터
- 세균형 코지의 제조: 된장 제조에 이용된 세균형 코지 제조는 Chang(28)의 방법에 따라 제조하였으며, 사용된 균주는 본 실험실에서 된장에서 분리하여 보유하고 있던 Bacillus subtilis DJI 균주를 종균으로 사용하였다. 균은 37oC에서 24시간 전 배 양하여 LB 액 체배 지 ①uchefa bio- chemie, bacto-tryptone 10%, yeast-extract 5%, sodium chloride 10%)에 1%(v/v) 접종한 후, 9시간 배 양한 것으로 준비하였다.
- 실험에 사용되어진 암세포주는 AGS(human gastric adenocarcinoma cell) CRL-1739, HT-29(human colon cancer cell) HTB-38과 정상세포주 BJ(human foreskin normal cell) CRL-2522를 사용하였다. 인체 위암세포(AGS)와 인체결장암 세포(HT-29)는 Roswell Park Memorial Institute medium(RPMI 1640; Gibco BRL, Carlsbad, USA)으로 배 양하고, 대조군으로 사용한 인체 포낭 정상세포주(BJ)는 Dul- becco/Vogt Modified Eagle's Minimal Essential Medium (DMEM; Gibco BRL)으로 배양하였다.
- 최종 소금의 농도는 12%(w/w) 가 되도록 정량된 소금을 종수에 녹여 삶은 콩, 코지와 함께 섞었다. 이와 같이 제조된 된장을 2개월, 16개월 동안 20oC 에서 숙성시킨 후 실험에 사용하였다.
- CRL-2522를 사용하였다. 인체 위암세포(AGS)와 인체결장암 세포(HT-29)는 Roswell Park Memorial Institute medium(RPMI 1640; Gibco BRL, Carlsbad, USA)으로 배 양하고, 대조군으로 사용한 인체 포낭 정상세포주(BJ)는 Dul- becco/Vogt Modified Eagle's Minimal Essential Medium (DMEM; Gibco BRL)으로 배양하였다. 각각의 배지에는 10% fetal bovine serum(FBS; Gibco BRL)과 100 ug/mL penicillin(Gibco BRL) 그리고 100 ug/mL streptomycin (Gibco BRL)을 첨가하였다.
- subtilis DJI 균체 현탁액을 준비하였다. 콩은 국내 에서 생산되는 소립종을 사용하였고, 정선된 원료콩 1 kg을 수세, 침지 후 고압 멸균기(1.0~1.5 kg/cm2)에서 40분 동안 증자하였다. 증자된 콩은 냉각시킨 후 미리 준비해둔 B.
데이터처리
- 1(statistical package for the social science) P/C package를 이용하여 평균값과 표준편차 범위로 나타내었다. 결과는 일원 배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였으며, 사후검정은 T-test에 의하여 실행하였다. 통계적 유의성은 p<0.
- 모든 실험은 3회씩 수행하였으며, SPSS 12.0.1(statistical package for the social science) P/C package를 이용하여 평균값과 표준편차 범위로 나타내었다. 결과는 일원 배치 분산분석(one-way ANOVA)을 실시하였으며, 사후검정은 T-test에 의하여 실행하였다.
이론/모형
- 된장의 수분은 105oC 상압가열건조법으로 조단백은 Kjeldahl 분해 장치로 분해하여 단백질자동분석기 (B-324, Buchi, Flawil, Swizeland)로 측정하였다(29). 염도는 시료 3 g에 증류수 27 mL을 가하여 mixer로 30분 동안 균질화한 후 Whatman paper no.
- 된장의 제조: 본 실험에 이용된 된장제조의 방법은 Chang (28)의 방법에 따라 제조하였다. 소금은 천일염(94% NaCl, Shinan-Docho, Korea), 정제염(99% NaCl Chunil salt, Seoul, Korea)을 각각 사용하여 상기 방법으로 제조된 세균 형 코지에 삶은 콩(원료콩을 기준)을 1:1 비율로 가하였다.
- 세포 증식 정도를 MTT assay법(30)에 따라 측정하였다. MTT assay는 살아있는 세포의 미토콘드리아 내막에 존재하는 oxide-reductase 작용을 받아 MTT 에 의하여 생성되는 dark blue formazan의 양을 측정하는 방법이 다.
- 1(Schleicher & Schuell, Christchurch, England)로 여과한 다음 염도계 (ES-421, Atago, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 유리 아미노산은 식품공전의 분석방법에 준하여 측정하였다(18). 시료 3 g을 취하여 70% ethanol 30 mL를 가하고 1시간 동안 균질화한 후 원심분리 (21,000 xg, 15 min)하였다.
성능/효과
- 5%로 소금의 종류에 따른 된장의 수분함량 차이는 보이지 않았다. 16개월 숙성 시 수분함량은 정제염된장 47.0%와 천일염 된장은 50.6%로 정제염된장의 경우는 숙성기간에 따른 수분의 함량이 감소하는 경향을 보였고 천일염된장은 숙성기간이 경과하여도 초기(2개월)와 비슷한 수준을 유지하는 것으로 관찰되었다. 이는 천일염으로 제조한 된장이 암염이나 정제염으로 제조한 된장에 비해 수분의 함량이 더 높게 나타났다고 보고한 Kim 등(22)의 보고와 유사하였다.
- 16개월 숙성된 천일염된장과 정제염된장 메탄올 추출물은 0.005~1.000 mg/mL의 농도 처리 시 AGS의 경우 각각 9~36%, 11~42%의 높은 억제율을 보였다. HT-29의 경우는 0.
- 2개월 숙성 된장 메탄올 추출물은 AGS 에 대해 0.005~ 1.000 mg/mL의 농도로 처리하였을 때 천일염된장은 7~ 29%, 정제염된장은 15~32%의 억제율을 보여 메탄올 추출물의 경우 정제염된장이 AGS 억제효과가 더 우수함을 관찰하였다. HT-29에 대한 메탄올 추출물의 억제효과는 물 추출물에서와 같이 0.
- 2개월 숙성 된장 물 추출물의 AGS 에 대한 성장 억제 효과는 천일염된장의 경우 0.005 mg/mL의 농도에서 97%의 생존율을 보여 억제효과가 거의 없는 것으로 보였으나 0.050~ 1.000 mg/mL의 농도 처리 시 16~41%의 높은 억제율을 나타냄을 관찰하였다. 정제염된장의 경우는 0.
- 1). 2개월 숙성 시 천일염과 정제염을 첨가하여 제조한 각 된장의 수분함량은 각각 50.2%와 50.5%로 소금의 종류에 따른 된장의 수분함량 차이는 보이지 않았다. 16개월 숙성 시 수분함량은 정제염된장 47.
- AGS 에 대한 물 추출물의 성장 억제효과는 0.005~1.000mg/mL 의 농도에서 천일염된장의 경우 10~50%로 유의적 (p<0.05)으로 높은 억제율을 나타내었고, 정제염된장의 경우는 9~32%의 억제율을 나타내어 물 추출물의 경우 천일염 된장이 정제염된장 첨가군에 비교해 매우 뛰어난 항암효과를 보였다. HT-29에 각 된장의 물 추출물을 최고 1.
- Fig. 6에 나타난 바와 같이 인체 위암세포 AGS에 천일염 된장과 정제염된장의 물 추출물을 각각 1.000 mg/mL 농도로 처리하였을 때 두 처리구 모두 apoptosis 가 유발됨을 관찰할 수 있었다. 또한 정제염된장의 물 추출물(3.
- 05)으로 높은 억제율을 나타내었고, 정제염된장의 경우는 9~32%의 억제율을 나타내어 물 추출물의 경우 천일염 된장이 정제염된장 첨가군에 비교해 매우 뛰어난 항암효과를 보였다. HT-29에 각 된장의 물 추출물을 최고 1.000 mg/mL 의 농도처리 시 천일염된장과 정제염된장은 각각 44%, 32%의 높은 억제율을 나타내어 천일염된장이 암세포 성장 억제효과가 더 뛰어남을 확인하였다(Fig. 3).
- 000 mg/mL의 농도로 처리하였을 때 천일염된장은 7~ 29%, 정제염된장은 15~32%의 억제율을 보여 메탄올 추출물의 경우 정제염된장이 AGS 억제효과가 더 우수함을 관찰하였다. HT-29에 대한 메탄올 추출물의 억제효과는 물 추출물에서와 같이 0.005 mg/mL의 저 농도에서는 천일염 된장과 정제염 된장 모두 억제효과가 없는 듯 보였으나 이후 농도에서부터 농도 의존적으로 생존율이 감소하여 최고 1.000 mg/mL 농도에서 각각 26%, 27%의 억제율을 나타냄을 알 수 있었다. 두 종의 암세포에 대해서 세포독성을 나타내어 항암효과가 뛰어남을 관찰하였다(Fig.
- 000 mg/mL의 농도 처리 시 6~29%의 억제효과를 나타내었다. HT-29에대한 성장억제효과는 천일염된장과 정제염된장의 경우 0.005 mg/mL의 저 농도에서는 다소 세포 성장 억제 효과가 없는 것으로 보였으나 0.050~1.000 mg/mL의 농도에서 각각 5~40%, 6~24%의 억제율을 보여 농도 의존적으로 억제 효과가 증가함을 나타내었다. 두 종의 암세포에 대해서 정제염 된장에 비교해 천일염된장은 더 뛰어난 항암효과를 나타내는 것으로 나타났다 (Fig.
- 000 mg/mL의 농도 처리 시 AGS의 경우 각각 9~36%, 11~42%의 높은 억제율을 보였다. HT-29의 경우는 0.050~1.000 mg/mL의 농도에서 각각 2~30%, 9~35%로 농도 의존적으로 암세포 성장 억제율이 증가함을 확인하였다.
- 동일 농도에서 HT-29의 경우 천일염된장의 물, 메탄올 추출물은 각각 44%, 30%의 억제율을 보였고, 정제염 된장의물, 메탄올 추출물은 각각 32%, 35%의 억제율을 보여 16개월 숙성 된장의 경우 천일염된장의 물 추출물이 암세포 성장억제 효과가 더 높게 나타났으며, 2개월 숙성 된장에 비교해 16개월 숙성 된장의 추출물이 항암효과가 더 우수함을 확인하였다. 더 나아가 AGS에 각 된장의 물 추출물을 최대 1 mg/mL의 농도로 처리하여 apoptosis 유발 여부를 측정한 결과 대조구에 비교해 모든 실험구에서 apoptosis 를 유발함을 확인하였다. 특히 천일염된장의 물 추출물(7.
- 최대 처리농도인 1 mg/mL에서 AGS의 경우 천일염된장의 물 추출물은 41%, 메탄올 추출물은 29%의 억제율을 보였고, 정제염 된장은 물 추출물에서 29%, 메탄올 추출물은 32%의 억제율을 보였다. 동일 농도에서 HT-29의 경우 천일염된장의 물 추출물은 40%, 메탄올 추출물은 26%의 억제율을 보였고, 정제염 된장의 물, 메탄올 추출물은 각각 24%, 27%의 억제율을 보여 AGS 와 HT-29 에 대해 천일염된장의 물 추출물은 억제 효과가 매우 뛰어남을 확인하였다. 천일염과 정제염을 첨가하여 제조한 16개월 숙성 된장의 각각의 추출물의 경우도 모두 정상 세포 BJ 에 대해 세포성장효과를 보였으며 특이 적으로 암세포 AGS 와 HT-29 에 대해서는 성장억제효과가 높음을 확인하였다.
- 소금의 종류에 따른 된장추출물의 암세포 성장억제 효과를 비교해 보기 위하여 최대 처리 농도인 1 mg/mL 로 비교해보면 AGS 의 경우 천일염된장의 물 추출물은 50%, 메탄올 추출물은 36%의 억제율을 보였고, 정제염 된장의 물 추출물은 32%, 메탄올 추출물은 42%의 억제율을 보였다. 동일 농도에서 HT-29의 경우 천일염된장의 물, 메탄올 추출물은 각각 44%, 30%의 억제율을 보였고, 정제염 된장의물, 메탄올 추출물은 각각 32%, 35%의 억제율을 보여 16개월 숙성 된장의 경우 천일염된장의 물 추출물이 암세포 성장억제 효과가 더 높게 나타났으며, 2개월 숙성 된장에 비교해 16개월 숙성 된장의 추출물이 항암효과가 더 우수함을 확인하였다. 더 나아가 AGS에 각 된장의 물 추출물을 최대 1 mg/mL의 농도로 처리하여 apoptosis 유발 여부를 측정한 결과 대조구에 비교해 모든 실험구에서 apoptosis 를 유발함을 확인하였다.
- 된장제조 시 소금의 첨가를 12%(w/w) 로 조정하였으나, 염도계로 측정된 숙성 후 된장의 염도는 천일염된장(약 12.2%)보다 정제염된장(약 13.5%)이 더 높은 경향을 보였다. 이는 염도계에 의한 염도측정은 시료내의 NaCl 농도를 측정하는 것이므로 첨가된 소금의 NaCl의 함량(천일염 94%, 정제염 99%)이 다르기 때문에 천일염된장의 염도가 더 낮게 나타나는 것으로 보인다.
- 000 mg/mL 농도에서 각각 26%, 27%의 억제율을 나타냄을 알 수 있었다. 두 종의 암세포에 대해서 세포독성을 나타내어 항암효과가 뛰어남을 관찰하였다(Fig. 2).
- 000 mg/mL의 농도에서 각각 5~40%, 6~24%의 억제율을 보여 농도 의존적으로 억제 효과가 증가함을 나타내었다. 두 종의 암세포에 대해서 정제염 된장에 비교해 천일염된장은 더 뛰어난 항암효과를 나타내는 것으로 나타났다 (Fig. 1).
- 위 결과로 볼때 정제염 및 천일염 된장 모두 숙성기간이 경과함에 따라 원료 단백질의 가수분해작용이 일어나 유리아미노산의 함량이 증가함을 알 수 있었다. 또한 정제염된장에서 보다 천일염된장에서의 유리 아미노산 함량이 더 높게 나타나 천일염이 된장의 발효 숙성을 더 촉진시킴을 알 수 있었다.
- 000 mg/mL 농도로 처리하였을 때 두 처리구 모두 apoptosis 가 유발됨을 관찰할 수 있었다. 또한 정제염된장의 물 추출물(3.00±0.58 cells)에 비교해 천일염된장의 물 추출물(7.00±1.15 cells)이 apoptosis 유발을 더 많이 진행시킴을 확인하였다. 그러나 AGS 에 된장추출물 대신 media(RPMI 1640)를 첨가한 대조구(0.
- 000 mg/mL의 농도에서는 114%의 생존율을 보여 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 메탄올 추출물의 경우도 천일염된장은 1.000 mg/mL의 농도에서 최고 118%의 생존율을 보였고, 정제염 된장은 0.500 mg/mL의 농도에서 최고 109%의 생존율을 나타내어 천일염된장과 정제염된장의 물, 메탄올 추출물은 정상 세포 BJ 에 대해 세포독성을 나타내지 않고 오히려 세포 성장 효과를 보임을 관찰하였다.
- 1, 2). 물 추출물의 경우 천일염 된장과 정제염된장 모두 0.005 mg/mL의 농도에서 각각 98%, 97%의 생존율을 보여 약간의 독성을 보이는 듯 했으나 천일염된장의 경우 0.500 mg/mL에서는 최대 111%의 높은 생존율을 보였고, 정제염된장의 경우 1.000 mg/mL의 농도에서는 114%의 생존율을 보여 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 메탄올 추출물의 경우도 천일염된장은 1.
- 00 cells)에서는 apoptosis가 관찰되지 않았다. 본 연구결과 천일염과 정제염으로 제조한 각 된장의 물 추출물은 인체 위암세포 AGS 의 성장을 억제하였고 이는 apoptosis 유발에 의한 것으로 사료되어진다. 특히 천일염 된장의 물 추출물은 AGS에 대한 억제효과 및 apoptosis 유발이 더 높은 것으로 나타났으며 정제염된장보다 천일염 된장이 더 뛰어난 항암효과를 지닌 것으로 생각되어진다.
- 소금의 종류를 달리한 2개월 숙성 된장의 물 추출물과 메탄올 추출물은 모두 정상세포 BJ 에 대해 세포독성을 보이지 않고 오히려 세포성장효과를 지니는 반면 2종의 암세포에 대해서는 높은 성장억제효과를 나타내었다. 최대 처리농도인 1 mg/mL에서 AGS의 경우 천일염된장의 물 추출물은 41%, 메탄올 추출물은 29%의 억제율을 보였고, 정제염 된장은 물 추출물에서 29%, 메탄올 추출물은 32%의 억제율을 보였다.
- 소금의 종류에 따른 된장의 조단백질의 함량은 소금의 종류나 숙성기간과 관계없이 모두 비슷한 함량(14.23~14.52%) 을 나타내어 차이가 없음을 알 수 있었다.
- 천일염과 정제염을 첨가하여 제조한 16개월 숙성 된장의 각각의 추출물의 경우도 모두 정상 세포 BJ 에 대해 세포성장효과를 보였으며 특이 적으로 암세포 AGS 와 HT-29 에 대해서는 성장억제효과가 높음을 확인하였다. 소금의 종류에 따른 된장추출물의 암세포 성장억제 효과를 비교해 보기 위하여 최대 처리 농도인 1 mg/mL 로 비교해보면 AGS 의 경우 천일염된장의 물 추출물은 50%, 메탄올 추출물은 36%의 억제율을 보였고, 정제염 된장의 물 추출물은 32%, 메탄올 추출물은 42%의 억제율을 보였다. 동일 농도에서 HT-29의 경우 천일염된장의 물, 메탄올 추출물은 각각 44%, 30%의 억제율을 보였고, 정제염 된장의물, 메탄올 추출물은 각각 32%, 35%의 억제율을 보여 16개월 숙성 된장의 경우 천일염된장의 물 추출물이 암세포 성장억제 효과가 더 높게 나타났으며, 2개월 숙성 된장에 비교해 16개월 숙성 된장의 추출물이 항암효과가 더 우수함을 확인하였다.
- 31 mg%로 나타났다. 위 결과로 볼때 정제염 및 천일염 된장 모두 숙성기간이 경과함에 따라 원료 단백질의 가수분해작용이 일어나 유리아미노산의 함량이 증가함을 알 수 있었다. 또한 정제염된장에서 보다 천일염된장에서의 유리 아미노산 함량이 더 높게 나타나 천일염이 된장의 발효 숙성을 더 촉진시킴을 알 수 있었다.
- 1~4의 실험결과에서, 두 종류의 암세포에 대하여 세포 생육억제활성이 가장 높게 나타난 천일염된장의 물 추출물(1 mg/mL) 을 처리하여 각 세포의 형태 변화를 살펴보았다. 위상차 현미경을 이용하여 16개월 숙성 천일염 된장의물 추출물을 각 세포에 1.000 mg/mL의 농도로 처리하였을 때, 정상세포 BJ에 대해서는 시료처리가 BJ 생육에 영향을 미치지 않으나, 위암세포 AGS와 대장암세포 HT-29는 대조 구에 비교해 정상적으로 성장하지 못하고 세포밀도가 감소하였으며 일부 세포의 형태적 변화가 일어났음을 관찰할 수 있었다(Fig. 5).
- 유리아미노산의 함량은 된장의 맛을 좌우하는 중요한 요인 중에 하나로 소금의 종류를 달리한 된장의 유리 아미노산 함량을 비교해보면 정제염된장의 경우 숙성 2개월과 숙성 16개월에서 각각 1716.86 mg%, 1892.98 mg%로 천일염 된장의 경우는 숙성 2개월과 16개월에서 각각 1953.10 mg%와 2001.31 mg%로 나타났다. 위 결과로 볼때 정제염 및 천일염 된장 모두 숙성기간이 경과함에 따라 원료 단백질의 가수분해작용이 일어나 유리아미노산의 함량이 증가함을 알 수 있었다.
- 이상의 결과로부터 천일염 된장과 정제 염 된장은 정상 세포에는 안전하나 두 종류의 암세포에는 증식억제효과를 나타냄을 알 수 있었고, 2개월 숙성 된장보다 16개월 숙성 된장이 두 종류의 암세포에 대해 보다 더 효과적으로 증식억제 작용을 함을 알 수 있었다.
- 정상세포 BJ 에 대해 소금의 종류를 달리한 16개월 숙성된 장의 물 추출물과 메탄올 추출물을 처리하였을 시 모두 세포독성이 없는 것으로 관찰되었으며 오히려 농도 의존적으로 세포성장효과를 보여 물 추출물의 경우 최고 1.000 mg/mL 의 농도에서 천일염된장과 정제염된장 모두 각각 114%, 112%의 높은 생존율을 나타냄을 관찰하였다. 메탄올 추출물의 경우도 마찬가지로 정상세포 BJ 에 세포독성을 나타내지 않았으며 모든 농도에서 오히려 세포성장효과를 나타내었다(Fig.
- 정상세포 BJ 에 대해서는 소금의 종류를 달리한 2개월 숙성 된장의 물 추출물과 메탄올 추출물 모두 세포독성이 거의 없는 것으로 관찰되었다(Fig. 1, 2). 물 추출물의 경우 천일염 된장과 정제염된장 모두 0.
- 000 mg/mL의 농도 처리 시 16~41%의 높은 억제율을 나타냄을 관찰하였다. 정제염된장의 경우는 0.005 mg/mL의 농도에서 96%의 생존율을 보였으며 0.050~1.000 mg/mL의 농도 처리 시 6~29%의 억제효과를 나타내었다. HT-29에대한 성장억제효과는 천일염된장과 정제염된장의 경우 0.
- 동일 농도에서 HT-29의 경우 천일염된장의 물 추출물은 40%, 메탄올 추출물은 26%의 억제율을 보였고, 정제염 된장의 물, 메탄올 추출물은 각각 24%, 27%의 억제율을 보여 AGS 와 HT-29 에 대해 천일염된장의 물 추출물은 억제 효과가 매우 뛰어남을 확인하였다. 천일염과 정제염을 첨가하여 제조한 16개월 숙성 된장의 각각의 추출물의 경우도 모두 정상 세포 BJ 에 대해 세포성장효과를 보였으며 특이 적으로 암세포 AGS 와 HT-29 에 대해서는 성장억제효과가 높음을 확인하였다. 소금의 종류에 따른 된장추출물의 암세포 성장억제 효과를 비교해 보기 위하여 최대 처리 농도인 1 mg/mL 로 비교해보면 AGS 의 경우 천일염된장의 물 추출물은 50%, 메탄올 추출물은 36%의 억제율을 보였고, 정제염 된장의 물 추출물은 32%, 메탄올 추출물은 42%의 억제율을 보였다.
- 소금의 종류를 달리한 2개월 숙성 된장의 물 추출물과 메탄올 추출물은 모두 정상세포 BJ 에 대해 세포독성을 보이지 않고 오히려 세포성장효과를 지니는 반면 2종의 암세포에 대해서는 높은 성장억제효과를 나타내었다. 최대 처리농도인 1 mg/mL에서 AGS의 경우 천일염된장의 물 추출물은 41%, 메탄올 추출물은 29%의 억제율을 보였고, 정제염 된장은 물 추출물에서 29%, 메탄올 추출물은 32%의 억제율을 보였다. 동일 농도에서 HT-29의 경우 천일염된장의 물 추출물은 40%, 메탄올 추출물은 26%의 억제율을 보였고, 정제염 된장의 물, 메탄올 추출물은 각각 24%, 27%의 억제율을 보여 AGS 와 HT-29 에 대해 천일염된장의 물 추출물은 억제 효과가 매우 뛰어남을 확인하였다.
- 본 연구결과 천일염과 정제염으로 제조한 각 된장의 물 추출물은 인체 위암세포 AGS 의 성장을 억제하였고 이는 apoptosis 유발에 의한 것으로 사료되어진다. 특히 천일염 된장의 물 추출물은 AGS에 대한 억제효과 및 apoptosis 유발이 더 높은 것으로 나타났으며 정제염된장보다 천일염 된장이 더 뛰어난 항암효과를 지닌 것으로 생각되어진다.
- 더 나아가 AGS에 각 된장의 물 추출물을 최대 1 mg/mL의 농도로 처리하여 apoptosis 유발 여부를 측정한 결과 대조구에 비교해 모든 실험구에서 apoptosis 를 유발함을 확인하였다. 특히 천일염된장의 물 추출물(7.00±1.15 cells)이 정제염된장의 물 추출물(3.00±1.15 cells)보다 AGS 에 대한 억제효과 및 apoptosis 유발이 더 높게 나타나 위 결과로 볼 때 천일염된장이 매우 뛰어난 항암효과를 지님을 알 수 있었다.
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